一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法

1.本发明涉及一种树鼩原代视网膜神经节细胞分离培养方法，属于细胞分离培养技术领域。


背景技术：

2.视网膜神经节细胞( retinal ganglion cells，rgcs) 是视网膜的唯一输出神经元，对于视觉功能和昼夜节律至关重要。rgcs是将视觉感受器连接到大脑的神经视网膜元素，形成神经视觉系统，rgcs 的功能和/或形态学在几种眼部和神经系统疾病中起重要作用，眼科疾病（如视神经病、青光眼、糖尿病视网膜病变等）可导致 rgcs 损伤、变性和凋亡，都将直接导致视觉障碍和视力下降，最终引起视功能丧失，因此保持或促进 rgcs存活及轴突生长对视功能的维持至关重要，建立体外视网膜神经节细胞原代培养模型，是深入研究视网膜神经节细胞病理改变过程与机制的基础与关键。
3.目前仅有大鼠视网膜神经节细胞、小鼠视网膜神经节细胞、人视网膜神经节细胞、猪视网膜神经节细胞被分离出，并且针对视网膜神经节细胞的特点开展了各个方向的眼科相关疾病研究。树鼩作为一种小型的攀鼩目动物，在生理、生化、新陈代谢、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类，已广泛应用于人类疾病模型的研究，包括病毒感染模型、肿瘤模型、呼吸系统疾病模型、代谢类疾病模型和神经系统疾病模型等，树鼩也被用于眼部、视神经以及脑部神经发育相关发生发展机制的研究。树鼩具有较大的眼睛，发达的视觉系统，锥细胞数量占感光细胞的96%，树鼩视觉相关基因也大部分与人类同源的视觉基因相关，树鼩独特的视网膜结构为研究视网膜病变提供了很好的基础。近年来，树鼩己被广泛应用于眼科疾病和视觉发育的研究，是一个潜在的有可能替代非人灵长类的实验动物。
4.rgcs为高度分化的细胞，增殖困难，所以只能进行原代培养，使得rgcs体外培养难度加大，随着近年来对神经节细胞的功能研究不断深入发展，以及对神经视觉系统的不断了解，rgcs体外培养越来越被需要和重视，rgcs是视网膜病变中早期发挥重要作用的细胞之一，在神经损伤对于一些疾病导致的不可逆性视力障碍中具有重要意义，但目前分离培养rgcs的研究较少，并且相关的动物组织来源也较为局限，因此建立完善多样化的rgcs体外模型越来越迫切。本发明采用树鼩这一新型模式动物，分离培养其rgcs，以期得到更为合适多样的细胞模型，为之后的深入研究做好铺垫，为进一步研究视网膜新生血管疾病及其病理机制奠定基础。
5.rgcs分离培养方法有机械分离法和酶消化法，酶消化法中的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶以及透明质酸酶等，胰蛋白酶消化法是目前原代培养rgcs的常用方法，目前不同物种以及不同实验胰蛋白酶浓度和消化时间不同，有1.25g /l胰蛋白酶消化20min、2g/l 浓度消化20min 、0.5g/l消化15min，也有25%胰蛋白酶消化15-20min，都无法获得高产量的rgcs，且以往报道的rgcs培养方法的培养基也无法保证rgcs在体外培养中增殖以及存活率。因此克服rgcs体外分离培养现有技术的不足仍是目前需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，该方法是采用质量浓度0.25%胰蛋白酶消化法消化25-35min分离得到树鼩视网膜神经节细胞，利用本方法可以快速完成分离；本发明使用的培养基是含5-15ng/mlbfgf的条件重编程（cr）培养基，可以有效延长树鼩视网膜神经节细胞体外存活时间和增加传代次数，细胞可在体外培养过程中增殖生长，并保持rgcs形态。
7.本发明树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法具体步骤如下：（1）树鼩视网膜分离：取1只1岁龄树鼩的眼球，将眼球放于加入含3%青霉素/链霉素的pbs液的玻璃培养皿中，洗2-4次，在解剖显微镜下用眼科显微剪沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，用眼科显微镊去除眼球晶状体和玻璃体，剥离视网膜组织，视网膜组织用3%青霉素/链霉素的pbs中洗2-4次，并用眼科剪剪碎；（2）制备单细胞悬液：将剪碎的视网膜放入离心管，加入0.25%胰蛋白酶液，置于 37℃、5%co2恒温箱消化25-35min(每隔10min摇晃离心管) ，待树鼩视网膜组织完全消化后，1000rpm离心5-8min，去除上清液；加入dmem/f12 培养液漂洗，1000rpm离心5-8min，弃上清，漂洗3-4次，收集细胞；（3）细胞培养：将步骤（2）得到的细胞加入含5-15ng/ml bfgf的条件重编程培养基中重悬细胞，吹打混匀，接种于t25培养瓶中，置于37℃、5%co2培养箱中培养，每天观察细胞生长状况，72h后换一半新培养基，之后每隔1天换1次培养基，每天观察细胞生长状况；（4）细胞纯化：待步骤（3）中的细胞铺满瓶底时，弃培养基，用含1%青霉素-链霉素的pbs液清洗原代细胞3-4次，然后加入0.25% trypsin-edta胰蛋白酶液，室温消化，倒置显微镜下观察细胞，待有轴突的大部分细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打，变圆的视网膜神经节细胞被吹打下来后，将细胞悬液转至新的培养瓶中培养，显微镜下观察细胞状态；（5）对步骤（4）细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定和特异性蛋白免疫荧光鉴定，所用抗体为1:200稀释的brn-3a抗体（millipore），镜下可见明显甲苯胺蓝染色和brn-3a荧光。
8.本发明采用的胰蛋白酶消化法分离树鼩视网膜神经节细胞，采用低浓度（0.25%胰蛋白酶）对细胞的伤害较小，分离时间25-30min，操作简便，大大提高了分离效率；用0.25%trypsin-edta胰蛋白酶液消化rgcs细胞与消化胶质细胞存在时间差，消化时rgcs优先脱落，通过控制消化时间从而将rgcs与杂细胞分离，该纯化方法可以快速、简便的纯化rgcs。
9.本发明中使用的cr培养基适用于从健康或肿瘤组织（气道、视网膜、前列腺、乳腺、肠、胰腺、肝胆管等）增殖原代上皮细胞。以往分离rgcs多用neurobasal medium 培养基，但该培养基无法使细胞持续增殖。本发明中首次将cr培养基应用于rgcs分离，并同时添加了终浓度为5-15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bfgf，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞的增殖与分化，对神经系统有重要作用，bfgf能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活，刺激胆碱乙酰化酶的合成以及突起的生长），发现该方法可使rgcs细胞增殖生长，可维持rgcs细胞形态（即细胞胞体明显，可见相互交错成网络样的轴突），同时有效延长树鼩视网膜神经节细胞体外存活时间和增加传代次数。总之本发明使用cr培养基并且结合酶消化分离方法，能够快速简便分离出视网膜神经节细胞，并且可以使视网膜神经节细胞增殖，可连续传代5次左右，满足常规实验需要。
附图说明
10.图1为原代树鼩视网膜神经节细胞培养形态（100
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）；其中a图为培养5d，b图为培养8d；图2为树鼩视网膜神经节细胞传代培养形态（100
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），图a为第3代；图b第5代；图3为树鼩视网膜神经节细胞甲苯胺蓝染色鉴定结果（100
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）；图4为树鼩视网膜神经节细胞免疫荧光鉴定结果示意图（100
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），图a为树鼩视网膜神经节细胞brn-3a（绿色）；图b为树鼩视网膜神经节细胞核dapi（蓝色）；图c为树鼩视网膜神经节细胞brn-3a与细胞核重叠。
具体实施方式
11.下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂，实施例中如无特殊说明百分含量均为质量百分含量（75%酒精、0.5% triton x-100及抗体稀释均为体积百分含量）；实施例中pbs液购自hyclone，青霉素-链霉素购自bi，0.25%trypsin-edta胰蛋白酶购自gibco，bfgf购自peprotech公司，cr培养基购自stemcell；甲苯胺蓝染液购自索莱宝；实施例1：树鼩视网膜神经节细胞分离培养及纯化取1岁左右的树鼩，腹腔注射3%戊巴比妥钠0.5ml麻醉后处死，于体积浓度75%的酒精中消毒 3min，将树鼩置于冰袋上，无菌操作取出眼球，并将眼球放于加入含3%青霉素-链霉素的pbs液培养皿中，洗3次，在解剖显微镜下用眼科显微剪沿角膜缘后 0.5mm 剪开眼球，用眼科显微镊去除眼球晶状体和玻璃体，剥离视网膜组织，视网膜组织用3%青霉素-链霉素的pbs液洗3次，并用眼科剪剪碎，放入15ml离心管，加入3ml 0.25%胰蛋白酶液后放入37℃、5%co2恒温箱消化30min( 每隔10min摇晃离心管) ，待树鼩视网膜组织完全消化后，1000rpm离心8min，去除上清液；加入3ml dmem/f12 培养液漂洗，1000rpm离心5min，弃上清，漂洗重复3次，用含10ng/mlbfgf的cr培养基重悬后，接种于t25培养瓶中，置于37℃、5%co2培养箱中培养，之后每天观察细胞生长状况，72h后半换液，之后每隔1天换1次液，待细胞铺满瓶底时，弃培养基，用1%青霉素-链霉素的pbs液清洗细胞3次，加入0.25% trypsin-edta胰蛋白酶液1ml，室温消化，倒置显微镜下观察细胞，待有轴突的细胞变圆后吸弃胰蛋白酶液，加入完全培养基反复吹打，变圆的视网膜神经节细胞被吹打下来后，将细胞悬液转至新的培养瓶中培养，显微镜下观察细胞状态；细胞培养5d 后可见部分胞体聚集生长，并开始渐长出几十微米的轴突（图1a）；培养第8d（图1b），细胞生长状态良好，细胞胞体明显，可见相互交错成网络样的轴突，小片状融合聚集生长，胞体，形态较一致，为树鼩视网膜神经节细胞；获得的树鼩视网膜神经节细胞采用含有5-15ng/mlbfgf的cr培养基传代培养5代，其中第3代细胞形态见图2a，第5代的细胞形态见图2b，从图中可以看出经过5代培养后细胞仍然维持rgcs细胞形态。
12.实施例2：树鼩视网膜神经节细胞特征鉴定
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甲苯胺蓝染色鉴定与神经节细胞特异性标志物brn-3a鉴定
1、甲苯胺蓝染色鉴定取第3代视网膜神经节细胞，接种于24孔板中，置于37℃、5%co2培养箱中，待细胞长满80%左右，用pbs液浸洗3次，每次3min， 按500μl/孔加入4%多聚甲醛固定细胞30min 后用pbs液浸洗3次，每次3min；加入甲苯胺蓝染色试剂后将24孔板置于50℃-60℃下干燥箱浸染 30-40min后，pbs液浸洗3次，每次3min，95%乙醇分化脱水3-5s，pbs液浸洗爬片3次，每次3min，显微镜下观察采集图像，图3为第3代树鼩视网膜神经节细胞甲苯胺蓝染色，甲苯胺蓝着染的细胞胞体中可见神经细胞特征性的清晰地着染成蓝紫色结构清晰的结节为尼式小体，可见细胞为神经细胞（放大倍数为目镜10
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，物镜10
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）。
13.2、神经节细胞特异性标志物brn-3a鉴定取第3代视网膜神经节细胞，接种于24孔板中，置于37℃、5%co2培养箱中，待细胞长满80%左右，用 pbs 浸洗3次，每次3min；用体积分数为4%的多聚甲醛溶液固定20min，pbs漂洗3次，每次3min；用体积浓度3%的bsa（用pbs稀释）封闭30min；弃bsa，pbs漂洗3次，每次3min；用0.5%triton
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100细胞穿孔20min，弃0.5%triton
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100，pbs液漂洗 3次，每次3min，在孔板中滴加稀释好的兔源性抗 brn-3a（购自millipore）一抗（工作液稀释比例为1:200），对照孔加pbs液代替，4℃过夜孵育；pbs漂洗3次，每次3min；滴加羊抗兔荧光二抗（购自abcam）（1:400），37 ℃避光孵育1h；pbs 漂洗3次，每次3min；dapi染核1min，pbs漂洗3次，每次3min；加入抗荧光淬灭剂（1:500），在荧光显微镜下观察拍照；图4a是第3代树鼩视网膜神经节细胞brn-3a绿色荧光，分布于细胞核中，图4b是第3代树鼩视网膜神经节细胞核蓝色荧光，将图a、b重叠得到图c，可见细胞核中均能检测到明显的brn-3a蛋白，说明所得细胞确为视网膜神经节细胞（放大倍数为目镜10
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，物镜10
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）；综上，本发明方法可成功分离培养树鼩视网膜神经节细胞，且树鼩视网膜神经节细胞体外存活时间和传代次数都增加了。