一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法

技术特征：
1.一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，其特征在于：采用酶消化法从树鼩视网膜组织中分离纯化获得原代树鼩视网膜神经节细胞，原代树鼩视网膜神经节细胞培养使用含5-15ng/ml bfgf的条件重编程培养基。2.根据权利要求1所述的树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）树鼩视网膜分离：取1只1岁龄树鼩的眼球，将眼球放于加入含3%青霉素-链霉素的pbs液中，洗2-4次，在解剖显微镜下用眼科显微剪沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，用眼科显微镊去除眼球晶状体和玻璃体，剥离视网膜组织，视网膜组织用含3%青霉素/链霉素的pbs液洗2-4次后剪碎；（2）制备单细胞悬液：将剪碎的视网膜组织放入离心管，加入胰蛋白酶液，然后置于 37℃、5%co2恒温箱消化25-35min，每隔10min摇晃离心管一次，待树鼩视网膜组织完全消化后，离心去除上清液，加入dmem/f12培养液漂洗，离心弃上清，漂洗3-4次，收集细胞；（3）将步骤（2）得到的细胞加入含5-15ng/ml bfgf的条件重编程培养基中重悬细胞，吹打混匀，接种于t25培养瓶中，置于37℃、5%co2培养箱中培养，72h后换一半新培养基，之后每隔1天换1次培养基，每天观察细胞生长状况；（4）待步骤（3）培养的细胞铺满瓶底时，弃培养基，用含1%青霉素-链霉素的pbs液清洗细胞3-4次，然后加入0.25% trypsin-edta胰蛋白酶液，室温消化，倒置显微镜下观察细胞，待有轴突的大部分细胞变圆后吸弃胰蛋白酶液，加入完全培养基反复吹打，变圆的视网膜神经节细胞被吹打下来后，将细胞悬液转至新的培养瓶中培养6天以上，获得树鼩视网膜神经节细胞。3.根据权利要求2所述的树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（2） 中胰蛋白酶液质量浓度为0.25%。4.根据权利要求2所述的树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（2） 中离心的转速为1000rpm，离心时间为5-8min。

技术总结
本发明公开了一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，该方法是采用酶消化法从树鼩视网膜组织中分离获得原代树鼩视网膜神经节细胞，方法实施过程中胰蛋白酶液的浓度为0.25%，细胞培养使用的培养基为含有5-15ng/mLbFGF的CR培养基；本发明方法可以轻松实现树鼩视网膜神经节细胞的体外分离培养，进一步简化了分离方法，神经节细胞特异性标志物Brn-3a免疫荧光染色率高，能够满足生物学研究领域对视网膜神经节相关实验的要求。视网膜神经节相关实验的要求。视网膜神经节相关实验的要求。


技术研发人员：陆彩霞 邱敏 代解杰 王文广 李娜 孙晓梅 仝品芬
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：2022.09.09
技术公布日：2022/11/29