多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法与流程

技术特征：
1.一种多谱系肝类器官模型，其特征在于：该模型由如下方法构建而成：s1、使用含有gdf8的培养基诱导hpsc分化形成定形内胚层；s2、使用含有nog、fgf4的培养基诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；s3、肝脏相关的多谱系特化阶段一：使用含有前期分化组合物的培养基培养前肠管衍生物；s4、肝脏相关的多谱系特化阶段二：使用含有后期分化组合物的培养基继续培养，得到匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；s5、肝类器官成熟：使用含有egm-2的培养基实现多谱系肝类器官模型的成熟化。2.根据权利要求1所述的多谱系肝类器官模型，其特征在于：gdf8的使用浓度为50-200ng/ml，nog的使用浓度为50-200ng/ml，fgf4的使用浓度为250-1000ng/ml。3.根据权利要求1所述的多谱系肝类器官模型，其特征在于：前期分化组合物包括1-5μm的repsox、10-50mm的nic、20-100ng/ml的vegf、20-100ng/ml的fgf2、50-200ng/ml的wnt3a、20-100ng/ml的egf；后期分化组合物包括2-10μm的atra、10-50mm的nic、10-50μm的lca。4.根据权利要求1所述的多谱系肝类器官模型，其特征在于：s5阶段中，培养基中还添加0.1-0.4μm的dihexa、10-50μm的mk4、2-10μm的tgfβ抑制剂、0.1-0.5mm的pka激活剂、0.1-0.5μm的mk125，培养基中包括体积比为10%-25%的egm-2培养基。5.基于权利要求1-4任一项所述的多谱系肝类器官模型的药物肝毒评价方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1）对类器官进行质检；2）选取临床药物，用选择的药物对多谱系肝类器官模型进行处理并定义为药物处理组，同时设置对照组进行对照；3）选择评价指标，获取药物处理组和对照组的各评价指标的结果，并对结果进行分析评价；其中，评价指标包括：细胞活力、肝损伤、胆汁淤积毒性、线粒体毒性。6.根据权利要求5所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：细胞活力通过检测cyp3a4酶活性值来判断，肝损伤通过检测ast与alt活性值来判断，胆汁淤积毒性通过clf染色判断，线粒体毒性通过tmrm染色和耗氧率判断。7.根据权利要求6所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：对肝类器官进行肝损伤评价标准为：当对照/药物组ast与alt活性值的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01、以及p＜0.001时，分别判定为无肝损伤、轻度肝损伤、中度肝损伤以及重度肝损伤。8.根据权利要求6所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：对胆汁淤积毒性评价标准为：当对照/药物组荧光强度值的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无胆汁淤积毒性、轻度胆汁淤积毒性、中度胆汁淤积毒性以及重度胆汁淤积毒性。9.根据权利要求6所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：对线粒体毒性评价标准为：当对照/药物组荧光强度值的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无线粒体毒性、轻度线粒体毒性、中度线粒体毒性以及重度线粒体毒性。10.根据权利要求6所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：对线粒体毒性评价标准为：
当对照/药物组耗氧率的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无线粒体毒性、轻度线粒体毒性、中度线粒体毒性以及重度线粒体毒性。11.根据权利要求5所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：类器官质检包括类器官谱系构成检测、cyp3a4酶活性与可诱导性检测、药物肝毒识别能力检测以及胆汁分泌能力检测。12.根据权利要求11所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：类器官谱系构成检测分别使用各谱系特异性标志物一抗以及荧光二抗标记，并在荧光显微镜下检定类器官谱系构成；cyp3a4酶活性与可诱导性检测为分别检测使用诱导剂利福平诱导前后原代肝细胞和肝类器官的cyp3a4酶活性；药物肝毒识别能力检测选取结构类似、但肝毒性不同的药物，分别稀释至不同的浓度并对上述模型进行处理，检测药物处理组和对照组的细胞活力；胆汁分泌能力检测使用总胆汁酸tba分析试剂盒，按照操作说明书检测胆汁分泌能力。13.根据权利要求12所述的药物肝毒评价方法，其特征在于：类器官质检的标准为：1）类器官谱系构成检测：各标志物表达模式正确的前提下，证实其至少包含alb

肝细胞、sox9

胆管细胞、cd68

肝巨噬细胞、vim

肝星状细胞以及lyve1

肝血窦内皮细胞；2）cyp3a4酶活性与可诱导性检测：诱导前后cyp3a4活性值的统计学差异p＜0.05，证明可被显著诱导；在此基础上，诱导倍数不低于原代肝细胞的1/3，则视为过检；3）药物肝毒识别能力检测任何药物浓度下，存在组间统计学差异p＜0.05，证明在该药物浓度下类器官可区分肝毒性不同的结构类似物；在此基础上，随药物浓度增加，组间细胞活力差值呈现增加趋势，则视为过检；4）胆汁分泌能力检测类器官的胆汁分泌量不低于原代肝细胞的1/3，即6.5μm/ml/106细胞/24h，视为过检。

技术总结
本发明提供了一种多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法，该模型使用添加有GDF8、NOG、FGF4、前期分化组合物、后期分化组合物和EGM-2的培养基对hPSC培养，最终获得多谱系肝类器官模型；该评价方法包括质量检定步骤以及药物性肝毒评价步骤。基于该类器官的肝毒评价方法比原代肝细胞灵敏度更高，可有效检出AST、ALT等肝损指标，准确区分结构类似物的肝脏毒性，识别譬如胆汁淤积毒性、线粒体毒性等传统体内/外模型难以辨认的特异质肝毒。应用此新型药物肝毒评价方法，将填补当下2D/3D细胞模型与动物模型之间的沟壑，有助于降低药物的未知肝毒风险，提高药物开发成功率。提高药物开发成功率。提高药物开发成功率。


技术研发人员：吴迪 葛啸虎 王莉莉 李慧芳 徐迎 罗晓琴 曹宁
受保护的技术使用者：天津外泌体科技有限公司
技术研发日：2022.10.26
技术公布日：2022/11/25