过氧化氢酶制备的发酵工艺的制作方法

1.本发明涉及酶发酵制备工艺技术领域，具体为过氧化氢酶制备的发酵工艺。


背景技术：

2.过氧化氢酶(cat)，是一种催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内，过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40％。过氧化氢酶的应用较为广泛，过氧化氢酶在食品工业中也被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢；除此之外，过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化；在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的，在实验室中还常常被用作了解酶对反应速率影响的工具。
3.过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在，但是会受限于原料来源，而微生物生产过氧化氢酶原料充足，所以越来越多的过氧化氢酶通过微生物发酵获得，而微生物的生长离不开碳源、氮源等营养物质，同时过氧化氢酶的合成受发酵条件的影响条件不同所产生的酶量不同，因此提高其产酶水平需要进行发酵条件的优化。
4.因为过氧化氢酶的应用广泛，具有较为重要的作用，而目前制备过氧化氢酶的工艺多种多样，所以如何提高过氧化氢酶的酶量，需要优化发酵条件。鉴于此，我们提出过氧化氢酶制备的发酵工艺。


技术实现要素：

5.为了弥补以上不足，本发明提供了过氧化氢酶制备的发酵工艺。
6.本发明的技术方案是：
7.过氧化氢酶制备的发酵工艺，具体工艺过程包括：
8.菌种培养，所述菌种培养包括制备菌种培养基，并且基于菌种培养基能够培养菌群数量，且制备得到发酵种液；
9.种液菌种产酶优化，所述种液菌种产酶优化包括向发酵培养基中添加能够优化过氧化氢酶产量和酶体活力的碳源和氮源营养物质，且向发酵培养基中添加能够影响酶体活力的金属离子。
10.优选的，菌种培养基的培养液各成分及制备工艺为：将5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g琼脂和水1000ml充分混匀，并添加1％浓度的孟加拉红水溶液3.3ml。
11.优选的，将所有菌种培养基在使用前保持密闭状态经过125摄氏度高温蒸汽杀菌，并自然冷却至室温待用。
12.优选的，将待培育的原始菌种放入蒸汽杀菌并冷却后的菌种培养基内培养24小时，保持温度范围20-30摄氏度，筛选得到能够产生过氧化氢酶的菌种。
13.优选的，发酵种液的制备具体工艺为：从菌种培养基中筛选挑取培养完成的菌体，并将菌体转接入含50ml菌种培养基培养液的250ml摇瓶中，将摇瓶放置在全温空气摇床上
进行菌种培养，使得菌种充分混合混匀，得到发酵种液。
14.优选的，发酵种液制备条件具体为：200r/min，20-30℃培养24h，ph值为7.0。
15.优选的，发酵培养基在菌种培养基的组成成分基础上，添加碳源、氮源和金属离子，并使其组分充分混匀形成发酵培养基培养液。
16.优选的，将发酵种液按1.5％-2.5％的接种量取出菌悬液，并将该菌悬液转接入含有发酵培养基培养液的发酵罐中，发酵形成含有过氧化氢酶菌体细胞的发酵液。
17.优选的，控制发酵温度20-30℃，200r/min条件下发酵24-72h。
18.优选的，将发酵后形成的发酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸盐缓冲液来重悬菌体，并在冰浴中用超声破碎含有过氧化氢酶的菌体细胞，经过离心机离心处理后过滤上清液，该上清液即为含有过氧化氢酶的粗酶液。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.该过氧化氢酶制备的发酵工艺，通过菌种培养过程可以初步培育筛选原始菌种，得到状况良好具有正常活性的菌种，并通过菌种培养基快速繁育菌种形成含有大量菌群的发酵种液，通过发酵种液中添加碳源和氮源营养物质，可以为发酵过程菌体细胞提供充足能量并促进其产酶，同时碳源、氮源和金属离子可以有效提高发酵得到的过氧化氢酶体的活力，即该工艺可以提高过氧化氢酶的产量，并使其具有更好的酶活性。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实施例1
23.过氧化氢酶制备的发酵工艺，具体工艺过程包括：
24.菌种培养，菌种培养包括制备菌种培养基，并且基于菌种培养基能够培养菌群数量，且制备得到发酵种液；
25.种液菌种产酶优化，种液菌种产酶优化包括向发酵培养基中添加能够优化过氧化氢酶产量和酶体活力的碳源和氮源营养物质，且向发酵培养基中添加能够影响酶体活力的金属离子。
26.菌种培养基的培养液各成分及制备工艺为：将5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g琼脂和水1000ml充分混匀，并添加1％浓度的孟加拉红水溶液3.3ml，提供基础的菌群培育能量。
27.将所有菌种培养基在使用前保持密闭状态经过125摄氏度高温蒸汽杀菌，并自然冷却至室温待用。
28.将待培育的原始菌种放入蒸汽杀菌并冷却后的菌种培养基内培养24小时，保持温度范围20-30摄氏度，筛选得到能够产生过氧化氢酶的菌种，主要筛除培育过程中失活或者活性较低的菌种，提高后期发酵效率，本实施例温度为25摄氏度。
29.发酵种液的制备具体工艺为：从菌种培养基中筛选挑取培养完成的菌体，并将菌体转接入含50ml菌种培养基培养液的250ml摇瓶中，将摇瓶放置在全温空气摇床上进行菌种培养，使得菌种充分混合混匀，得到发酵种液。
30.发酵种液制备条件具体为：200r/min，20-30℃培养24h，ph值为7.0，本实施例温度为25摄氏度。
31.发酵培养基在菌种培养基的组成成分基础上，添加碳源、氮源和金属离子，并使其组分充分混匀形成发酵培养基培养液。
32.将发酵种液按1.5％-2.5％的接种量取出菌悬液，并将该菌悬液转接入含有发酵培养基培养液的发酵罐中，发酵形成含有过氧化氢酶菌体细胞的发酵液，1.5％-2.5％的选取量影响初始发酵的菌群数量，过高的量无法充分发酵，过少会造成浪费，影响生产发酵的效率，本实施例选取1.5％。
33.控制发酵温度20-30℃，200r/min条件下发酵24-72h，具体为25摄氏度下发酵48小时。
34.将发酵后形成的发酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸盐缓冲液来重悬菌体，并在冰浴中用超声破碎含有过氧化氢酶的菌体细胞，经过离心机离心处理后过滤上清液，该上清液即为含有过氧化氢酶的粗酶液
35.需要说明的是，碳源可选种类为麦芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作为碳源物质；氮源可选硫酸铵、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作为氮源，金属离子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl获得。
36.本实施例选用黄曲霉作为发酵菌种，并且本实施例中碳源添加量为5g/l，氮源添加量为5g/l，并添加0.001mol/l的金属离子，本实施例优选麦芽糖作为碳源，牛肉膏作为氮源和cacl2作为提供金属离子的物质。
37.对比例1
38.过氧化氢酶制备的发酵工艺，具体工艺过程包括：
39.菌种培养，菌种培养包括制备菌种培养基，并且基于菌种培养基能够培养菌群数量，且制备得到发酵种液；
40.种液菌种产酶优化，种液菌种产酶优化包括向发酵培养基中添加能够优化过氧化氢酶产量和酶体活力的碳源和氮源营养物质，且向发酵培养基中添加能够影响酶体活力的金属离子。
41.菌种培养基的培养液各成分及制备工艺为：将5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g琼脂和水1000ml充分混匀，并添加1％浓度的孟加拉红水溶液3.3ml，提供基础的菌群培育能量。
42.将所有菌种培养基在使用前保持密闭状态经过125摄氏度高温蒸汽杀菌，并自然冷却至室温待用。
43.将待培育的原始菌种放入蒸汽杀菌并冷却后的菌种培养基内培养24小时，保持温度范围20-30摄氏度，筛选得到能够产生过氧化氢酶的菌种，主要筛除培育过程中失活或者活性较低的菌种，提高后期发酵效率，本对比例温度为25摄氏度。
44.发酵种液的制备具体工艺为：从菌种培养基中筛选挑取培养完成的菌体，并将菌体转接入含50ml菌种培养基培养液的250ml摇瓶中，将摇瓶放置在全温空气摇床上进行菌种培养，使得菌种充分混合混匀，得到发酵种液。
45.发酵种液制备条件具体为：200r/min，20-30℃培养24h，ph值为7.0，本对比例温度为25摄氏度。
46.发酵培养基在菌种培养基的组成成分基础上，添加碳源、氮源和金属离子，并使其
组分充分混匀形成发酵培养基培养液。
47.将发酵种液按1.5％-2.5％的接种量取出菌悬液，并将该菌悬液转接入含有发酵培养基培养液的发酵罐中，发酵形成含有过氧化氢酶菌体细胞的发酵液，1.5％-2.5％的选取量影响初始发酵的菌群数量，过高的量无法充分发酵，过少会造成浪费，影响生产发酵的效率，本对比例选取1.5％。
48.控制发酵温度20-30℃，200r/min条件下发酵24-72h，具体为25摄氏度下发酵48小时。
49.将发酵后形成的发酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸盐缓冲液来重悬菌体，并在冰浴中用超声破碎含有过氧化氢酶的菌体细胞，经过离心机离心处理后过滤上清液，该上清液即为含有过氧化氢酶的粗酶液
50.需要说明的是，碳源可选种类为麦芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作为碳源物质；氮源可选硫酸铵、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作为氮源，金属离子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl获得。
51.本对比例选用黄曲霉作为发酵菌种，并且本对比例中碳源添加量为5g/l，氮源添加量为5g/l，并添加0.001mol/l的金属离子，本对比例优选淀粉作为碳源，牛肉膏作为氮源和cacl2作为提供金属离子的物质。
52.对比例2
53.过氧化氢酶制备的发酵工艺，具体工艺过程包括：
54.菌种培养，菌种培养包括制备菌种培养基，并且基于菌种培养基能够培养菌群数量，且制备得到发酵种液；
55.种液菌种产酶优化，种液菌种产酶优化包括向发酵培养基中添加能够优化过氧化氢酶产量和酶体活力的碳源和氮源营养物质，且向发酵培养基中添加能够影响酶体活力的金属离子。
56.菌种培养基的培养液各成分及制备工艺为：将5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g琼脂和水1000ml充分混匀，并添加1％浓度的孟加拉红水溶液3.3ml，提供基础的菌群培育能量。
57.将所有菌种培养基在使用前保持密闭状态经过125摄氏度高温蒸汽杀菌，并自然冷却至室温待用。
58.将待培育的原始菌种放入蒸汽杀菌并冷却后的菌种培养基内培养24小时，保持温度范围20-30摄氏度，筛选得到能够产生过氧化氢酶的菌种，主要筛除培育过程中失活或者活性较低的菌种，提高后期发酵效率，本对比例温度为25摄氏度。
59.发酵种液的制备具体工艺为：从菌种培养基中筛选挑取培养完成的菌体，并将菌体转接入含50ml菌种培养基培养液的250ml摇瓶中，将摇瓶放置在全温空气摇床上进行菌种培养，使得菌种充分混合混匀，得到发酵种液。
60.发酵种液制备条件具体为：200r/min，20-30℃培养24h，ph值为7.0，本对比例温度为25摄氏度。
61.发酵培养基在菌种培养基的组成成分基础上，添加碳源、氮源和金属离子，并使其组分充分混匀形成发酵培养基培养液。
62.将发酵种液按1.5％-2.5％的接种量取出菌悬液，并将该菌悬液转接入含有发酵培养基培养液的发酵罐中，发酵形成含有过氧化氢酶菌体细胞的发酵液，1.5％-2.5％的选
取量影响初始发酵的菌群数量，过高的量无法充分发酵，过少会造成浪费，影响生产发酵的效率，本对比例选取1.5％。
63.控制发酵温度20-30℃，200r/min条件下发酵24-72h，具体为25摄氏度下发酵48小时。
64.将发酵后形成的发酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸盐缓冲液来重悬菌体，并在冰浴中用超声破碎含有过氧化氢酶的菌体细胞，经过离心机离心处理后过滤上清液，该上清液即为含有过氧化氢酶的粗酶液
65.需要说明的是，碳源可选种类为麦芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作为碳源物质；氮源可选硫酸铵、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作为氮源，金属离子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl获得。
66.本对比例选用黄曲霉作为发酵菌种，并且本对比例中碳源添加量为5g/l，氮源添加量为5g/l，并添加0.001mol/l的金属离子，本对比例优选麦芽糖作为碳源，蛋白胨作为氮源和cacl2作为提供金属离子的物质。
67.对比例3
68.过氧化氢酶制备的发酵工艺，具体工艺过程包括：
69.菌种培养，菌种培养包括制备菌种培养基，并且基于菌种培养基能够培养菌群数量，且制备得到发酵种液；
70.种液菌种产酶优化，种液菌种产酶优化包括向发酵培养基中添加能够优化过氧化氢酶产量和酶体活力的碳源和氮源营养物质，且向发酵培养基中添加能够影响酶体活力的金属离子。
71.菌种培养基的培养液各成分及制备工艺为：将5g蛋白胨、10g葡萄糖、20g琼脂和水1000ml充分混匀，并添加1％浓度的孟加拉红水溶液3.3ml，提供基础的菌群培育能量。
72.将所有菌种培养基在使用前保持密闭状态经过125摄氏度高温蒸汽杀菌，并自然冷却至室温待用。
73.将待培育的原始菌种放入蒸汽杀菌并冷却后的菌种培养基内培养24小时，保持温度范围20-30摄氏度，筛选得到能够产生过氧化氢酶的菌种，主要筛除培育过程中失活或者活性较低的菌种，提高后期发酵效率，本对比例温度为25摄氏度。
74.发酵种液的制备具体工艺为：从菌种培养基中筛选挑取培养完成的菌体，并将菌体转接入含50ml菌种培养基培养液的250ml摇瓶中，将摇瓶放置在全温空气摇床上进行菌种培养，使得菌种充分混合混匀，得到发酵种液。
75.发酵种液制备条件具体为：200r/min，20-30℃培养24h，ph值为7.0，本对比例温度为25摄氏度。
76.发酵培养基在菌种培养基的组成成分基础上，添加碳源、氮源和金属离子，并使其组分充分混匀形成发酵培养基培养液。
77.将发酵种液按1.5％-2.5％的接种量取出菌悬液，并将该菌悬液转接入含有发酵培养基培养液的发酵罐中，发酵形成含有过氧化氢酶菌体细胞的发酵液，1.5％-2.5％的选取量影响初始发酵的菌群数量，过高的量无法充分发酵，过少会造成浪费，影响生产发酵的效率，本对比例选取1.5％。
78.控制发酵温度20-30℃，200r/min条件下发酵24-72h，具体为25摄氏度下发酵48小
时。
79.将发酵后形成的发酵液中加入20ml的50mmol/l的磷酸盐缓冲液来重悬菌体，并在冰浴中用超声破碎含有过氧化氢酶的菌体细胞，经过离心机离心处理后过滤上清液，该上清液即为含有过氧化氢酶的粗酶液
80.需要说明的是，碳源可选种类为麦芽糖、淀粉、葡萄糖、甘油和蔗糖作为碳源物质；氮源可选硫酸铵、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作为氮源，金属离子可添加mgcl2、cacl2、mgcl2、kh2po4或nacl获得。
81.本对比例选用黄曲霉作为发酵菌种，并且本对比例中碳源添加量为5g/l，氮源添加量为5g/l，并添加0.001mol/l的金属离子，本对比例优选麦芽糖作为碳源，牛肉膏作为氮源和mgcl2作为提供金属离子的物质。
82.碳源平行对照例
83.该碳源平行对照例具有多组，且与实施例1和对比例1之间的区别仅限于碳源选择不同，其添加量均为5g/l,如下表所示：
[0084] 葡萄糖淀粉甘油蔗糖麦芽糖酶产量(u/ml)17501685143220382487酶活性(u/mg)34103973320840575226
[0085]
得出结论：添加碳源可以促进过氧化氢酶的产量和活性，选择合适的碳源有利于合理控制制备工艺成本并生产所需酶活性。
[0086]
氮源平行对照例
[0087]
该氮源平行对照例具有多组，且与实施例1和对比例2之间的区别仅限于氮源选择不同，其添加量均为5g/l,如下表所示：
[0088] 硫酸铵蛋白胨酵母粉牛肉膏酶产量(u/ml)462146334624642酶活性(u/mg)3951519155586550
[0089]
得出结论：添加氮源可以影响过氧化氢酶的产量和活性，选择合适的氮源有利于合理控制制备工艺成本并生产所需酶活性。
[0090]
金属离子平行对照例
[0091]
该金属离子平行对照例具有多组，且与实施例1和对比例3之间的区别仅限于金属离子选择不同，其添加量均为0.001mol/l,如下表所示：
[0092] znclcacl2mgcl2kh2po4nacl酶产量(u/ml)25543862351255694566酶活性(u/mg)42515806548760736118
[0093]
得出结论：添加金属离子可以影响过氧化氢酶的产量和活性，选择合适的氮源有利于合理控制制备工艺成本并生产所需酶活性。
[0094]
需要解释的是，酶活性可以理解为单位数量的过氧化氢酶有效存活率或可以发生反应作用的酶数量，单位数量酶活性越高，其有效性越高。
[0095]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明
的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。