一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3-羟基丁酸酯的方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3-羟基丁酸酯的方法。


背景技术：

2.聚3-羟基丁酸酯具有良好的生物降解性和生物相容性，被认为是医疗、农业和食品包装等传统塑料的有效替代品。聚3-羟基丁酸脂作为可降解生物基塑料，具备与聚乙烯等传统石油基塑料相似的物理性质，对于减少常规塑料“白色污染”和推动社会可持续发展方面具有重要应用价值。
3.目前，聚3-羟基丁酸酯的生产主要采用的是生物发酵法。聚3-羟基丁酸酯可由微生物在碳源和氮源失衡条件下，在细胞内积累贮存，当碳源贫乏时可被重新利用作为细胞生长的碳源和能源。目前，已发现约66个菌属300多种微生物能够产聚3-羟基丁酸酯，但合成效率比较低，生产成本比较高。因此，迫切需要筛选出聚3-羟基丁酸酯高产率菌株，以提高聚3-羟基丁酸酯生物合成效率，并降低生产成本。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有生物发酵法生产聚3-羟基丁酸酯存在的不足，提供一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3-羟基丁酸酯的方法，本发明利用筛选的蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)tq-0513-2发酵生产聚3-羟基丁酸酯，该菌生长过程中可在细胞内积累聚3-羟基丁酸酯，并且产量高，工艺简单。
5.本发明的技术方案为：
6.一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3-羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：
7.(1)将蜡状芽孢杆菌接种至种子培养基，30℃培养12h，获得种子液；
8.(2)将种子液以体积浓度1％的接种量接种至无机盐培养基，震荡培养后，离心弃上清，收集湿菌体；
9.(3)将湿菌体进行提纯，得到聚3-羟基丁酸酯。
10.步骤(1)中，所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)菌株tq-0513-2，已保藏于中国典型培养物中心，保藏编号为cctcc no:m 2020433，保藏日期为2020年9月2日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。该菌株是从土壤中分离筛选获得，经检测，其在生长过程中具有在细胞内积累聚3-羟基丁酸酯的能力。
11.步骤(2)中，所述无机盐培养基的配方为：碳源20-25g/l；磷酸氢二钠2800mg/l；磷酸二氢钾1000mg/l；硫酸铵500mg/l；氯化镁53mg/l；四水钙盐50mg/l；edta二钠0.5mg/l；七水合硫酸亚铁0.2mg/l；七水硫酸锌0.01mg/l；四水氯化锰0.003mg/l；硼酸0.03mg/l；六水氯化钴0.02mg/l；二水氯化铜0.001mg/l；六水氯化镍0.002mg/l；二水钼酸钠0.003mg/l，ph为7.0。
12.进一步，步骤(1)中，所述种子培养基为lb培养基，其组成为：氯化钠10.0g/l，酵母
提取物5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，溶剂为水，ph值为7.0。
13.进一步，所述无机盐培养基的配方中，碳源为酵母提取物、葡萄糖、甘油、阿拉伯糖、麦芽糖中的一种或几种，更优选为酵母提取物和葡萄糖。
14.进一步，步骤(2)中，所述震荡培养的条件为：30℃，200r/min培养24h。
15.进一步，步骤(3)中，所述提纯方法为：湿菌体经液氮反复冻融，离心后，沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤2次，最后70℃烘干，得到聚3-羟基丁酸脂。
16.本发明的有益效果：
17.本发明从自然界筛选得到可以高效积累聚3-羟基丁酸酯的蜡状芽孢杆菌菌株tq-0513-2，并提供了利用其发酵生产聚3-羟基丁酸酯的方法，与现有技术相比，本发明以低廉碳源作为营养物质，并能够提高聚3-羟基丁酸酯生物合成效率，为生物可降解塑料聚3-羟基丁酸酯的生物合成提供了重要的菌株资源和技术手段，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
18.图1实施例1得到的湿菌体细胞样品酯化后的气相色谱图；
19.图2为实施例1得到的湿菌体细胞样品的透射电镜图。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。值得说明的是，下述实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围，并非限于此中的细节及其修改案。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
21.实施例1
22.一种利用蜡状芽孢杆菌制备聚3-羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：
23.(1)将蜡状芽孢杆菌接种至种子培养基，30℃培养12h，获得种子液；
24.(2)将种子液以体积浓度1％的接种量接种至无机盐培养基，30℃、200r/min震荡培养24h后，7500rpm下离心弃上清，收集湿菌体；
25.(3)湿菌体经液氮反复冻融，离心后，沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤2次，最后70℃烘干，得到聚3-羟基丁酸酯。
26.步骤(1)中，所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)菌株tq-0513-2，已保藏于中国典型培养物中心，保藏编号为cctcc no:m 2020433，保藏日期为2020年9月2日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
27.步骤(1)中，所述种子培养基为lb培养基，其组成为：氯化钠10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，溶剂为水，ph值为7.0。
28.步骤(2)中，所述无机盐培养基的配方为：酵母提取物5g/l；葡萄糖20g/l；磷酸氢二钠2800mg/l；磷酸二氢钾1000mg/l；硫酸铵500mg/l；氯化镁53mg/l；四水钙盐50mg/l；edta二钠0.5mg/l；七水合硫酸亚铁0.2mg/l；七水硫酸锌0.01mg/l；四水氯化锰0.003mg/l；硼酸0.03mg/l；六水氯化钴0.02mg/l；二水氯化铜0.001mg/l；六水氯化镍0.002mg/l；二水钼酸钠0.003mg/l，ph为7.0。
29.将实施例1的湿菌体真空冷冻干燥后，得到冻干细胞样品，将其酯化，然后通过气相色谱检测酯化产物，以确定该细胞内积累聚3-羟基丁酸脂。详细检测方法为：取10mg冻干
细胞样品，加入2ml氯仿和2ml含3％(v/v)浓硫酸的甲醇溶液，85℃酯化反应6h，加入去离子水充分混匀并静置，然后取下层氯仿用于气相色谱分析，气相色谱检测的方法与条件分别为：仪器为agilent-8860气相，载气为n2，检测器为fid检测器；色谱柱为hp-5(30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,100℃(1min)；柱流速为2ml/min；分流比为30：1；进样量为1μl。聚3-羟基丁酸酯酯化后产物的保留时间为：2.346min。
30.气相色谱检测结果如图1所示，可以看出，细胞内聚3-羟基丁酸酯含量占细胞干重56.2％。
31.取0.1克实施例1的湿菌体，经2.5％的戊二醛固定液处理后，通过透射电镜观测细胞内聚3-羟基丁酸脂存在情况，结果见图2，图2中，高亮部分为胞内聚3-羟基丁酸酯积累，可以看出，蜡状芽孢杆菌菌株tq-0513-2在培养24h后胞内会积累一定量的聚3-羟基丁酸酯。
32.实施例2
33.所述无机盐培养基配方为：甘油20g/l；磷酸氢二钠2800mg/l；磷酸二氢钾1000mg/l；硫酸铵500mg/l；氯化镁53mg/l；四水钙盐50mg/l；edta二钠0.5mg/l；七水合硫酸亚铁0.2mg/l；七水硫酸锌0.01mg/l；四水氯化锰0.003mg/l；硼酸0.03mg/l；六水氯化钴0.02mg/l；二水氯化铜0.001mg/l；六水氯化镍0.002mg/l；二水钼酸钠0.003mg/l，ph为7.0。
34.其余与实施例1相同。
35.气相色谱检测方法同实施例1，结果显示，本实施例中，细胞内聚3-羟基丁酸酯含量占细胞干重46.4％。
36.实施例3
37.所述无机盐培养基配方为：麦芽糖20g/l；磷酸氢二钠2800mg/l；磷酸二氢钾1000mg/l；硫酸铵500mg/l；氯化镁53mg/l；四水钙盐50mg/l；edta二钠0.5mg/l；七水合硫酸亚铁0.2mg/l；七水硫酸锌0.01mg/l；四水氯化锰0.003mg/l；硼酸0.03mg/l；六水氯化钴0.02mg/l；二水氯化铜0.001mg/l；六水氯化镍0.002mg/l；二水钼酸钠0.003mg/l，ph为7.0。
38.其余与实施例1相同。
39.气相色谱检测方法同实施例1，结果显示，本实施例中，细胞内聚3-羟基丁酸酯含量占细胞干重42.0％。
40.对比例1：采用lb培养基
41.将无机盐培养基改为lb培养基，lb培养基组成为：氯化钠10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，溶剂为水，ph值为7.0。
42.其余与实施例1相同。
43.气相色谱检测方法同实施例1，结果显示，细胞内聚3-羟基丁酸酯含量占细胞干重9.0％。
44.实施例1-3及对比例1的蜡状芽孢杆菌tq-0513-2细胞中聚3-羟基丁酸酯含量统计情况见表1：
45.表1
[0046][0047]
由表1可以看出，本发明采用的蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)tq-0513-2可在细胞内积累聚3-羟基丁酸酯，利用其发酵生产聚3-羟基丁酸酯，工艺简单、成本低，并且产量高。