一株鼠乳杆菌F5菌株及其应用

一株鼠乳杆菌f5菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一株鼠乳杆菌(lactobacillusmurinus)f5菌株及其应用。


背景技术：

2.多胺(ployamines，pa)普遍存在于动植物组织中，其稳态对维持体内细胞正常生长和增殖至关重要。近年来的研究表明，肿瘤细胞中多胺代谢往往会出现异常改变，因而靶向多胺代谢可能为预防和治疗肿瘤提供新的角度和契机，助力降低癌症相关疾病对社会经济造成的广泛影响。
3.然而目前有关多胺代谢机制的研究仍然不是很清楚，关于肠道微生物调控宿主多胺代谢的研究鲜有报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株鼠乳杆菌f5菌株及其应用，所述菌株可有效降低宿主血清以及结肠组织中的多胺水平。
5.本发明提供了一株鼠乳杆菌f5菌株，保藏编号为cgmcc no.24587。
6.本发明提供了一种调节多胺浓度的菌剂，包括所述f5菌株和辅料。
7.本发明提供了所述f5菌株或所述菌剂在制备调节多胺代谢的药物中的应用。
8.优选的，所述调节多胺代谢包括下调多胺代谢。
9.优选的，所述调节多胺代谢包括下调宿主血清和/或结肠组织中的多胺浓度。
10.本发明提供了所述f5菌株或所述菌剂在制备区分无菌动物和无特定病原体动物体内的多胺差异代谢表型的产品中的应用。
11.本发明提供了所述f5菌株或所述菌剂在制备预防和/或治疗以多胺代谢紊乱为靶点的疾病的药物中的应用。
12.优选的，所述多胺包括以下一种或几种：腐胺、亚精胺和精胺。
13.本发明提供的鼠乳杆菌(lactobacillus murinus)f5菌株，保藏编号为 cgmcc no.24587。本发明运用代谢组学揭示了无菌动物和无特定病原体动物体内的多胺代谢特征，筛选得到f5菌株。运用多组学分离培养f5菌株并在复合抗生素和无菌小鼠体内验证结果表明鼠乳杆菌菌株f5可以显著下调宿主血清以及结肠组织中的多胺水平。可见本发明提供的f5菌株在调控宿主代谢方面的巨大潜力。
附图说明
14.图1为无菌动物与无特定病原体动物各组织的多胺代谢图谱；图1a:无菌猪的饲养流程图；图1b:无菌猪血清、十二指肠、回肠、盲肠、结肠的代谢组结果；图1c:无菌小鼠的饲养流程图；图1d:无菌小鼠血清和结肠组织中各代谢物的变化，用t检验分析数据，并表示为平均值
±
标准差；*p《0.05， ****p《0.0001；
15.图2为不同抗生素处理小鼠血清、结肠、粪便中多胺及其前体代谢物的变化图谱，其中图2a:不同抗生素处理小鼠的饲养流程图；图2b:不同抗生素处理小鼠的血清代谢组结果；图2c:不同抗生素处理小鼠的结肠代谢组结果；图2d:对照组和粘菌素处理小鼠的粪便代谢组结果；用t检验分析数据，并表示为平均值
±
标准差，*p《0.05，****p《0.0001；
16.图3为鼠乳杆菌的挖掘及其在复合抗生素处理小鼠和无菌小鼠体内的定植；图3a:对照组和粘菌素处理小鼠的lefse分析图；图3b:种水平丰度排名前十的物种与血清和结肠组织代谢物结果的相关性分析图；图3c～图3f: 复合抗生素处理小鼠组与复合抗生素处理小鼠灌胃鼠乳杆菌组血清(c)、十二指肠(d)、结肠(e)、粪便(f)代谢组结果；图3g～图3h:无菌小鼠组与无菌小鼠灌胃鼠乳杆菌组血清(g)、结肠(h)代谢组结果，用t检验分析数据，并表示为平均值
±
标准差；*p《0.05，****p《0.0001。
17.生物材料保藏信息
18.鼠乳杆菌(lactobacillus murinus)菌株，本发明所述的鼠乳杆菌菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年 03月24日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为cgmcc no.24587。
具体实施方式
19.本发明提供了一株鼠乳杆菌(lactobacillus murinus)f5菌株，保藏编号为cgmcc no.24587。
20.在本发明中，f5菌株分离自小鼠粪便，经16srdna测序，鉴定为鼠乳杆菌(lactobacillus murinus)。代谢组分析表明，无菌动物体内多胺含量相较于无特定病原体动物显著升高，同时鼠乳杆菌定植显著降低复合抗生素处理和无菌小鼠中的多胺水平，证实鼠乳杆菌调控宿主多胺代谢的因果性。
21.本发明对f5菌株的培养方法没有特殊要求，采用本领域所熟知的鼠乳杆菌的培养方法即可。
22.本发明提供了一种调节多胺浓度的菌剂，包括所述f5菌株和辅料。
23.本发明对所述辅料的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌剂辅料即可。所述菌剂的剂型包括水剂或粉剂。依据菌剂的剂型选择适当的辅料。所述菌剂中f5菌株的活菌数量优选为(1～5)
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107cfu/1ml。本发明对所述菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌剂制备方法即可。
24.本发明提供了所述f5菌株或所述菌剂在制备调节多胺代谢的药物中的应用。
25.在本发明中，所述调节多胺代谢优选包括下调多胺代谢。所述调节多胺代谢优选包括下调宿主血清和/或结肠组织中的多胺浓度。所述多胺优选包括以下一种或几种：腐胺、亚精胺和/或精胺。鼠乳杆菌菌株可能对粘菌素处理小鼠的多胺代谢变化影响较黄体链球菌，鼠乳杆菌相对丰度的变化可能会影响宿主的多胺代谢。
26.在本发明中，代谢组测定鼠乳杆菌f5菌株定植小鼠体内实验表明，结果显示，鼠乳杆菌f5组小鼠血清腐胺水平降低，对结肠组织中精氨酸、腐胺、亚精胺、精胺浓度显著降低。
27.鉴于所述f5菌株为粘菌素处理小鼠和对照组小鼠肠道粪便差异微生物，并且与宿主的多胺代谢变化显著相关，本发明提供了所述f5菌株或所述菌剂在制备区分无菌动物和无特定病原体动物体内的多胺差异代谢表型的产品中的应用。
28.鉴于f5菌株下调多胺代谢的作用，同时多胺代谢紊乱导致包括肿瘤在内的疾病，因此本发明提供了所述f5菌株或所述菌剂在制备预防和/或治疗以多胺代谢紊乱为靶点的疾病的药物中的应用。
29.下面结合实施例对本发明提供的一株鼠乳杆菌f5菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1
31.肠道微生物介导宿主多胺代谢
32.为了揭示肠道微生物是否与宿主的多胺代谢有关，对无菌猪和无特定病原体猪以及无菌小鼠和无特定病原体小鼠的血清、十二指肠和结肠进行靶向代谢组学的测定，无菌猪的饲养流程图见图1a，无菌小鼠的饲养流程图见图1c，具体方法如下。
33.1.在冰上对组织样本进行剪切处理使其质量偏差小于10％。
34.2.称取40mg组织样本于400μl超纯水中，进行匀浆处理，在离心机上 30rpm离心2min，重复3次。
35.3.将200μl匀浆液/血清与800μl的甲醇/乙腈(1：1)溶液混合。
36.4.将混合溶液涡旋30s，4℃水浴超声10min。
37.5.离心机上离心14500rpm，4℃，15min。
38.6.取上清液，真空离心90min，取下层沉淀用氮气吹干。
39.7.将沉淀加200μl的50％甲醇水复溶。
40.8.将混合溶液涡旋30s，4℃水浴超声10min。
41.9.离心机上离心14500rpm，4℃，15min。
42.10.装进样瓶，进行uplc-orbitrap-ms/ms上机检测精氨酸，鸟氨酸以及多胺的含量，具体使用thermo fisher scientificuplc系统，主要参数为：流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为100％乙腈，流速0.2ml/min，柱温 35℃，进样量2μl；流动相b初始比例是5％，然后依次增加到7％，13％和50％，分别用时3分钟，2分钟和10分钟，最后，流动相b比例快速下降到5％，用时1分钟，并且在5％的比例维持2分钟。
43.靶向代谢组学结果显示，无菌猪盲肠中亚精胺浓度显著上调(图1b)，无菌小鼠血清中精胺浓度以及结肠组织中亚精胺和精胺浓度显著上调(图 1d)。
44.实施例2
45.粘菌素处理重现无菌动物模型中的多胺代谢表型
46.基于实施例1中代谢组分析表明，无菌动物体内多胺含量相较于无特定病原体动物显著升高的。为了阐明哪种细菌影响了宿主多胺代谢，本试验运用了不同抗菌谱的抗生素(氨苄西林1g/l、粘菌素1g/l、甲硝唑1g/l、新霉素1g/l和万古霉素0.5g/l)分别饮水处理了小鼠2周(图2a)，并对血清和结肠进行了代谢组测定(代谢组学前处理步骤如实施例1)。
47.代谢组结果显示，粘菌素处理组血清中的精氨酸、鸟氨酸、腐胺、亚精胺、精胺相较于对照组显著上调(图2b)，粘菌素处理组结肠组织中的腐胺、亚精胺、精胺相较于对照组显著上调(图2c)，粘菌素处理组粪便中的精胺浓度相较于对照组显著上调(图2d)。
48.实施例3
49.鼠乳杆菌定植显著降低复合抗生素处理和无菌小鼠中的多胺水平
50.为证实鼠乳杆菌调控宿主多胺代谢的因果性，在复合抗生素处理小鼠模型和无菌
小鼠模型中定植了该株鼠乳杆菌，并对血清以及结肠等组织进行了代谢组的测定(代谢组学前处理步骤如实施例1)。
51.为了更好地阐明肠道微生物对小鼠多胺代谢的影响，运用16srrna基因扩增子测序技术(北京诺禾致源科技股份有限公司)对粘菌素处理小鼠和对照组小鼠(正常饮水饲喂)粪便进行检测。将粘菌素(1g/l)处理组小鼠和对照组小鼠(正常饮水饲喂)粪便收集保存于-80℃冰箱，转移至干冰中，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行16srrna基因扩增子测序分析 (novaseq，美国illumina)。基于illumina nova测序平台测序，构建pcr-free 文库，然后进行双末端(paired-end)测序。利用lefse分析对组间的物种丰度数据通过秩和检验的方法检测不同分组间的差异物种并通过lda(线性判别分析)实现降维从而评估差异物种的影响大小，即得到ldascore，
52.最后绘制差异物种的lda值分布柱状图(见图3a)。结果显示，包括鼠乳杆菌、约氏乳酸杆菌在内的众多菌种对两组之间的差异贡献度的排名。
53.通过北京诺禾致源科技股份有限公司售后数据分析平台将16srrna基因扩增子测序与血清和结肠代谢组的结果进行相关性分析。结果见图3b，结果显示鼠乳杆菌与血清中精氨酸、鸟氨酸、腐胺、亚精胺，精胺的浓度呈显著负相关，黄体链球菌与血清中精氨酸、鸟氨酸、腐胺、亚精胺，精胺的浓度呈显著正相关。提示鼠乳杆菌可能对粘菌素处理小鼠的多胺代谢变化贡献较大，鼠乳杆菌相对丰度的变化可能会影响宿主的多胺代谢。
54.在饮水中添加含氨苄西林(1g/l)、甲硝唑(1g/l)、新霉素(1g/l)和万古霉素(0.5g/l)的混合抗生素处理小鼠1周后，分别设置对照组和鼠乳杆菌f5组，鼠乳杆菌f5组每天每只灌胃鼠乳杆菌f5pbs悬液 (1
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108cfu/ml，200μl)，对照组灌胃等量的pbs，连续灌胃1周后采集小鼠血清、十二指肠、结肠以及粪便样品，利用靶向代谢组学技术(代谢组学前处理步骤如实施例1)检测其多胺及其前体物质精氨酸和鸟氨酸含量。
55.结果发现，鼠乳杆菌f5定植后小鼠血清精氨酸、鸟氨酸、腐胺和精胺水平降低(图3c)，十二指肠、结肠、粪便中没有重现发现类似现象(图3d～图3f)。
56.实施例4
57.为了进一步验证鼠乳杆菌f5的定植效果，我们利用无菌小鼠进行鼠乳杆菌f5的定植实验。实验设置对照组和鼠乳杆菌f5组，鼠乳杆菌f5组在第1天和第3天进行含鼠乳杆菌f5的pbs悬液(1
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108cfu/ml，200μl) 灌胃，对照组在第1天和第3天灌胃等量的pbs，在第7天采集小鼠结肠和血清样品进行代谢组测定(代谢组学前处理步骤如实施例1)。
58.结果显示，鼠乳杆菌f5组小鼠血清腐胺水平降低(图3g)，结肠组织中精氨酸、腐胺、亚精胺、精胺浓度显著降低(图3h)。
59.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。