一种自身免疫性疾病的肠型评分模型的构建方法及应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种自身免疫性疾病的肠型评分模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.自身免疫性疾病(autoimmune diseases，aid)，是多种因素引起体内病理性自身免疫反应，通过异常的免疫炎症反应，破坏和损伤自身的细胞成分，导致组织损害和器官功能障碍的一类疾病，以类风湿关节炎(ra)、系统性红斑狼疮(sle)、干燥综合征(pss)、强直性脊柱炎(as)等系统性风湿病较为常见。aid有家族遗传倾向，平均发病率约为7.6％～9.4％，通常累及患者的骨骼、肌肉、关节及其周围的组织等全身各个系统。aid可反复发作、慢性迁延，不仅给患者带来了巨大的痛苦，同时也给家庭和社会造成严重的负担。
3.免疫耐受缺陷是aid发病的重要机制。aid的发病机制复杂，其免疫细胞功能紊乱是其发生和造成组织器官损害的主要原因。以往认为aid测试样本“免疫过强”，主要表现为效应t细胞(effector t cell，teff)数目增多或功能过强，产生大量炎性细胞因子或自身抗体，过度激活免疫系统应答，诱发自身免疫炎症，损害靶器官或靶组织所致，所以传统治疗理念以“免疫抑制”为主。但单纯“免疫抑制”治疗仅能让17％的ra患者达到临床缓解，绝大多数难治性aid测试样本(refractory aid，raid)都对传统的激素、免疫抑制剂和生物制剂无效。不仅如此，“免疫抑制”还会降低机体的免疫监视和免疫防御能力，增加肿瘤和感染的风险。最新研究发现，aid测试样本的调节性t细胞(regulatory t cell，treg)数目和功能的不足所致的自身免疫耐受缺陷可能是其发病的更重要原因。据此我们通过之前提出的“周期联合、免疫调节”，而非免疫抑制或许是治疗aid的新理念，即用免疫调节药物促进外周 treg细胞生长，调节免疫平衡，达到恢复和重建机体免疫耐受的目的。前期试验性地将促进 treg生长的il-2、西罗莫司等应用于临床治疗aid测试样本，发现患者外周treg数量有明显增长，疾病活动明显缓解，且无严重不良事件发生，将住院病人的平均死亡率由2.5％降至 0.3％。由此可见促进treg细胞增殖从而恢复风湿病患者免疫耐受、降低疾病活动度的免疫调节理念是可行的。然而，目前尚缺乏大规模的淋巴细胞亚群及其细胞因子的临床数据来表征 aid测试样本免疫功能状态，这给“免疫调节”治疗策略的进一步优化造成了困难。
4.菌群紊乱可能是自身免疫紊乱的根源。treg细胞数量变化和功能受到诸多机制调节的，一定有上游调节机制的紊乱才会导致treg细胞数量减少或功能缺陷。近十多年来，很多学者对ra、sle、uspa、as、psa等aid测试样本的肠道菌群进行了研究，发现aid测试样本肠道菌群丰度和多样性发生改变。aid测试样本某些产生scfas可促进treg细胞生长的细菌明显减少，从而造成疾病的发生发展。肠道作为人体最大的免疫耐受器官，其中的肠道菌群可直接或间接刺激treg等免疫细胞的增殖和参与免疫应答的调控，是机体后天免疫耐受产生最主要的场所。前期我们对临床2013例风湿科门诊患者问卷调查的结果发现58％的患者有消化道症状如腹泻、便秘或腹胀等，且甲烷氢呼气试验检测发现70.8％的有小肠细菌过度
生长。因此我们推测肠道菌群微生态紊乱或许是造成免疫耐受缺陷和自身免疫性疾病发生的重要原因。
5.然而，aid测试样本的肠道菌群与淋巴细胞亚群及其细胞因子的关系并不十分明晰，菌群紊乱是如何造成treg细胞减少和免疫耐受缺陷的机制还不是很清楚，有待于进一步探索并加以阐明。


技术实现要素：

6.针对目前aid的肠道菌群紊乱如何引起免疫耐受缺陷机制的问题，本发明提供了一种自身免疫性疾病的肠型评分模型的构建方法及应用。
7.本发明旨在于将aid测试样本进行“肠型”分类，构建肠型e-score评分，从“免疫微生态”的视角重新审视aid疾病的发生、发展及转归过程，为aid的预防和治疗提供新的方向，以期增强对aid疾病的深入了解，为aid的诊疗提供新的思路和依据。
8.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
9.一种自身免疫性疾病的肠型评分模型的构建方法，通过挖掘aid样本肠道菌群肠型的特征，采用dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性，对样本肠道菌群分成 e1肠型和e2肠型；以lda score log10＞2为界，通过lefse筛选出不同肠型间基于属水平的肠道微生物分类标志物；通过主成分分析，分别提取两个肠型各优势菌的主成分pc1作为分类标志物的特征评分pc1i和pc1j，构建肠型的评分e-score模型，具体计算公式如下：
10.e-score＝escore(e1)-escore(e2)＝∑pc1
i-∑pc1j。
11.进一步，所述采用dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性的具体方法是：它使用拉普拉斯近似来识别基于属水平的群落集合或肠型。dmm(狄利克雷多项式混合模型)组件的数量最初设置为k＝10，模型拟合是根据最小拉普拉斯的拟合优度确定的。在属水平未分类或存在于少于20％的样本中的分类群被排除在dmm聚类之外。
12.进一步，所述e1肠型的特征性菌为：ucg\005菌(ucg_005)、梭状芽孢杆菌ucg\014 (clostridia_ucg_014)、毛螺菌科\nk4a136\菌(lachnospiraceae_nk4a136_group)、嗜胆汁菌(bilophila)、真杆菌\共前列烷烯菌(_eubacterium__coprostanoligenes_group)、布劳提亚 (blautia)、真杆菌\埃希菌(_eubacterium__eligens_group)、阿利斯蒂普斯(alistipes)、丁蓖麻球菌(butyricicoccus)、cag\56菌(cag_56)、丛毛单胞菌(comamonas)、土孢子杆菌 (terrisporobacter)、un\f\u单宁鱼科(un_f__tannerellaceae)、巴内西拉(barnesiella)、瘤胃科(un_f__ruminococcaceae)、颤螺菌(oscillibacter)、瘤胃球菌 (_ruminococcus__gauvreauii_group)、伦布西亚(romboutsia)、脱硫弧菌(desulfovibrio)、拉赫诺斯皮拉(lachnospira)、rf39菌(rf39)、蔷薇属(roseburia)、毛螺菌科\nd3007\菌 (lachnospiraceae_nd3007_group)、臭细菌(odoribacter)、未培养的瘤胃球菌科 (uncultured_f__ruminococcaceae)、毛螺菌科\ucg\003菌(lachnospiraceae_ucg_003)、毛螺菌科\ucg\001菌(lachnospiraceae_ucg_001)、毛螺菌科\ucg\010菌 (lachnospiraceae_ucg_010)、拨号器菌(dialister)、阴性纤毛菌(negativibacillus)、螺旋藻菌(incertae_sedis)、示波螺旋藻科菌(uncultured_f__oscillospiraceae)、毛螺菌科\fcs020\ 菌(lachnospiraceae_fcs020_group)、真杆菌科\
腹菌(_eubacterium__ventriosum_group)、真杆菌科\锡雷乌姆菌(_eubacterium__siraeum_group)、阿克曼西亚(akkermansia)、ucg\010 (ucg_010)、粪球菌(coprococcus)、科林塞拉(collinsella)、福涅雷拉(fournierella)、土杆菌(turicibacter)、丁基橡胶(butyrivibrio)、菊科\r\7\菌(christensenellaceae_r_7_group)、 ucg\002菌(ucg_002)、真杆菌\木霉菌(_eubacterium__xylanophilum_group)、丹毒菌科 ucg\003菌(erysipelotrichaceae_ucg_003)、单球状体(monoglobus)、霍尔德
·
梅内拉 (holdemanella)、丁酸蓖麻单胞菌(butyricimonas)、甲烷杆菌(methanobrevibacter)、nk4a214\ 组(nk4a214_group)、粪杆菌(faecalibacterium)、ucg\003菌(ucg_003)、肠杆菌 (intestinibacter)、鼠杆菌科(muribaculaceae)、真杆菌群(_eubacterium__hallii_group)、共右旋杆菌(colidextribacter)、酸性氨基球菌(acidaminococcus)、普雷沃菌属(prevotella)、未培养的红螺旋体(uncultured_f__uncultured_f__uncultured_o__rhodospirillales)、多莉娅 (dorea)、真杆菌反刍动物菌(_eubacterium__ruminantium_group)、共催化剂(coprobacter)、下穹窿(subdoligranulum)、副雷沃菌(paraprevotella)、盐单胞菌属(halomonas)、瘤胃球菌 (ruminococcus)、相位弧菌(phascolarctobacterium)、无杆菌(agathobacter)、家族性\xiii\ ad3011\菌(family_xiii_ad3011_group)、cag\352菌(cag_352)；
13.e2肠型的特征性菌为：腔隙杆菌(lachnoclostridium)、假单胞菌(pseudomonas)、_梭菌群(_clostridium__innocuum_group)、大肠杆菌志贺氏菌(escherichia_shigella)、黄酮萃取菌 (flavonifractor)、类杆菌(bacteroides)、副卡特尼菌(fusicatenibacter)、瘤胃球菌\gnavus菌(_ruminococcus__gnavus_group)、亨加泰拉(hungatella)、梭杆菌(fusobacterium)、瘤胃球菌\torques菌(_ruminococcus__torques_group)、未培养的\f\毛螺菌 (uncultured_f__lachnospiraceae)、莫加内拉(morganella)、巨单胞菌(megamonas)、梭状芽孢杆菌(clostridium_sensu_stricto_1)、梭状芽孢杆菌vadinbb60\菌 (clostridia_vadinbb60_group)、un\f\示波螺旋藻科(un_f__oscillospiraceae)、丹毒杆菌 (erysipelatoclostridium)、副甾体(parabacteroides)、副巴特拉菌(parasutterella)。
14.进一步，所述挖掘aid样本肠道菌群肠型的特征的具体方法是：采用高通量二代测序检测测试样本的肠道菌群，首先需提取总dna，然后对细菌编码rrna相对应的dna序列16s rrna的v3-v4高变区进行扩增，获得足够的扩增子后进行建库测序；进行测序reads质控后，将一对双端reads拼接为1条tag；然后将所有测试样本的tag序列聚类，把序列分成不同的 cluster，每个cluster视为一个otu，选取其中最长的序列作为该otu的代表序列otu，各测试样本中包含的tag数即为otu在各测试样本中的绝对丰度；基于otu代表序列比对数据库，获得每个otu的物种注释信息，以计算获得各分类水平的物种丰度；最后基于物种和 otu丰度表，进行肠道微生物菌落的多样性、物种构成、功能预测和深度数据挖掘分析。
15.一种如上述构建方法构建的自身免疫性疾病的肠型评分模型的应用，用于评价甲氨蝶呤 (methotrexate，mtx)治疗的疗效。
16.进一步，将甲氨蝶呤mtx治疗4周后疾病活动评分28处关节疾病活动度评分(das28) 下降大于1.8的ra测试样本分视为响应者(responders，r)，否则视为不响应者 (non-responders，nr)。
17.与现有技术相比本发明具有以下优点：
18.本发明通过如上方法发现了aid的发生发展与肠道菌群有着密切关系，菌群与疾病的活动情况及对治疗药物的反应息息相关。肠道共生菌菌株可影响免疫反应的强弱，提示某些特定种类的肠道微生物在aid的发生发展中发挥致病性或保护性的作用。根据aid测试样本肠道菌群的特征，本发明构建了一套新型的肠道菌群e1和e2两个肠型。为了更好的量化e1 和e2两肠型的特征，本发明构建了一套肠型评分e-score模型，据此模型的算法可对任意一有肠道菌群测序的患者或动物进行肠型判别。
19.肠型评分e-score模型可有效评价药物治疗的疗效，其中高e-score的药物治疗有效率评价结果为21.4％，低e-score的药物治疗有效率评价结果为69.2％。不响应组(nr)的e-score 明显高于响应组(r)。
20.经过验证，饮食可以重塑肠道菌群的肠型特征，改变肠型e-score评分，尤其是配方中所涉及的高膳食纤维，可将降低e-score评分，将肠型由e2转化成e1肠型。
附图说明
21.图1是本发明肠道微生物扩增子检测分析流程图；
22.图2是本发明aid样本菌群不同alpha多样性分析指数下的稀释曲线图；
23.图3是本发明aid样本菌群alpha多样性分析图；
24.图4是本发明菌群微生物肠型的鉴定与表征；
25.图5是本发明e-score与mtx治疗ra响应图；
26.图6是本发明不同肠型及e-score的cia小鼠足爪关节炎症对比图；
27.图7是本发明不同肠型小鼠膝关节h&e染色组织病理学对比图；
28.图8是本发明不同肠型小鼠足爪及膝关节micro-ct三维对比图；
29.图9是本发明不同肠型小鼠血清中sfca的表达比较图；
30.图10是本发明不同肠型小鼠血清中细胞因子水平比较图。
具体实施方式
31.所有统计分析均使用r软件4.1.0进行，相关性分析采用pearson相关检验。两组间比较采用independent-samples t检验；计数资料使用卡方检验或fisher检验进行组间比较。p《0.05 视为差异有统计学意义。
32.收集2018年1月至2019年6月于山西医科大学第二医院风湿免疫科住院确诊测试样本，详见表1。
33.表1测试样本统计表
[0034][0035]
同时收集475例山西医科大学第二医院或山西省人民医院体检中心的健康测试样本(hc) 作为对照。同时排除合并有其他的免疫相关性疾病或肠道疾病、近半年内有慢性感染史或合并有恶性肿瘤等可能对检测结果造成影响的疾病，以及近1个月内参加过其他药物观察组或近期服用免疫调节药物、免疫抑制药物、抗生素和益生菌、益生元等微生态调节剂或处于怀孕或哺乳期的测试样本。
[0036]
实施例1
[0037]
aid样本肠道菌群肠型的特征
[0038]
采用高通量二代测序检测测试样本的肠道菌群，首先需提取总dna，然后对细菌编码 rrna相对应的dna序列16s rrna的v3-v4高变区进行扩增，获得足够的扩增子后进行建库测序。进行测序reads质控后，将一对双端reads拼接为1条tag；然后将所有测试样本的 tag序列聚类，把序列分成不同的cluster，每个cluster视为一个otu，选取其中最长的序列作为该otu的代表序列otu，各测试样本中包含的tag数即为otu在各测试样本中的绝对丰度；基于otu代表序列比对数据库，获得每个otu的物种注释信息，以计算获得各分类水平的物种丰度；最后基于物种和otu丰度表，进行肠道微生物菌落的多样性、物种构成、功能预测和深度数据挖掘分析。
[0039]
具体包括如下步骤：
[0040]
(1)标本收集：取测试样本约10g清晨初次中段的粪便标本，在1min内精确称取250 mg粪便标本并放入新的2ml无菌容器中，保存至-80℃冰箱中备用，随后进行基因组dna 提取及测序；同时收集所有测试样本静脉血，将其颠倒混匀置于室温中，送实验室检测血沉、 c反应蛋白、外周淋巴细胞亚群和细胞因子；
[0041]
(2)dna提取采用ctab法提取粪便微生物dna；具体操作步骤如下：吸取1000μl ctab裂解液至2.0ml ep管里，加入溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65℃水浴，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解；离心取上清，加ph8.0的酚：氯仿：异戊醇(体积比为 25:24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；取上清，加氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；吸取上清至1.5ml离心管里，加入异丙醇，上下摇晃，
ꢀ‑
20℃沉淀；
12000rpm离心10min，倒出液体，不倒出沉淀；用1ml75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体再次离心收集，然后用枪头吸出；超净工作台吹干；加入ddh2o溶解dna样品，于55℃～60℃下孵育10min助溶；加rnasea1μl消化rna，37℃下放置15min；
[0042]
(3)靶向扩增及文库构建：采用高保真dna聚合酶kapahifihotstartreadymix和带有barcode的16srrna基因v3-v4高变区特异引物扩增细菌上编码rrna相对应的dna序列(16srrna)基因v3-v4高变区并添加接头序列；95℃初始变性2min，95℃变性30s，重复25个循环，55℃退火30s，72℃下延伸30s，继续延伸5min；每个样本重复3次；特异引物的序列包括正向引物序列，f:actcctacgggacccagcag和反向引物序列，r:ggactachvgggtwtctaat。扩增完成后将所有产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的效率和质量，随后将pcr产物放入dna片段筛选磁珠试剂盒中纯化并回收；再采用qubit4.0定量将纯化的产物制备成样品的混合文库，使其浓度达到4nm；将混合文库上机进行测序；
[0043]
(4)生物信息学分析：采用fastqc对原始序列数据进行质量控制，通过usearch和vsearch软件获取引物的位置信息；用qiime2的dada2软件将hiseq/miseq测序获得的paired-end(pe)reads拼接成一条序列，过滤低质量和重复的reads，去除嵌合体，修正扩增子的测序错误，最终得优化序列(asv)；基于优化序列采用silva数据库作为物种注释的参考数据库进行物种分类注释；使用microbiotaprocess包进行alpha多样性指数分析，采用bray-curtis距离进行beta多样性分析，通过anosim分析(analysisofsimilarities)，一种基于置换检验和秩和检验的非参数检验方法，用来检验组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。用picrust2软件基于16srrna序列预测功能(kegg)丰度；采用stemp软件比较各组之间的差异物种和代谢通路的差异。采用dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性，对样本肠道菌群分型，挖掘测试样本肠道菌群的特征。
[0044]
aid测试样本的肠道菌群明显有异于健康测试样本(hc)，主要表现为测试样本菌群的多样性降低，且菌群的构成组分、相对丰度和代谢异常。
[0045]
采用dirichlet多项式混合无监督聚类描述微生物组数据的变异性，对样本肠道菌群分成e1肠型和e2肠型；它使用拉普拉斯近似来识别基于属水平的群落集合或肠型。dmm组件的数量最初设置为k＝10，模型拟合是根据最小拉普拉斯的拟合优度确定的。在属水平未分类或存在于少于20％的样本中的分类群被排除在dmm聚类之外。
[0046]
根据aid测试样本的肠道菌群特征，可将aid测试样本分为e1肠型和e2肠型两种，这种分型特征在健康测试样本中也同样适用。无论测试样本还是健康测试样本，普氏菌属为e1肠型的优势菌，拟杆菌属为e2肠型的优势菌，e1肠型的多样性明显高于e2肠型。
[0047]
其中，aid菌群的alpha多样性不足，其observed指数、chao1指数、ace指数、shannon指数、simpson指数和puelou’sevennessj指数均明显低于hc(p《0.001)。与hc相比类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，ra)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)、原发干燥综合征(primarysjogren'ssyndrome，pss)、未分化脊柱关节病(undifferentiatedspondyloarthropathy，uspa)、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，as)、白塞氏综合征(behcet'ssyndrome，bd)菌群的丰富度和均匀度均明显减少(p《0.05)；多肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，dm/pm)、混合性结缔组织病(mixedconnectivetissuedisease，mctd)、血管炎(vasculitis)的均匀度明显减少
(p＜0.05)但丰富度的下降无统计学差异(p ＞0.05)；银屑病关节炎(psoriatic arthritis，psa)的alpha多样性有下降趋势但无统计学差异(p＞0.05)。
[0048]
ra、sle、pss、uspa、as、bd、dm/pm、mctd、vasculitis菌群beta多样性均异于 hc(p＜0.05)，psa的beta多样性虽不同于hc，但此差异无统计学意义(p＞0.05)。因aid 不同疾病类型的菌群beta多样性存在较大差异，故掩盖了aid总体与hc的beta多样性差异(p＞0.05)。
[0049]
aid和hc肠道菌群的组成在门水平上主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、疣微菌门、梭杆菌门、脱硫杆菌门、蓝菌门、协同菌门、广古菌门、弯曲杆菌门；在属的水平上主要有拟杆菌属、柔嫩梭菌属、大肠-志贺氏杆菌、普氏菌、罗氏菌属、醋菌属、布劳特氏菌属、小杆菌属、罕见小球菌属、副拟杆菌属、双歧杆菌属，其门和属水平上的相对丰度不同(p＜0.05)。
[0050]
aid与hc肠道菌群的代谢存在巨大差异，其中硫辛酸的新陈代谢、propanoate代谢、牛磺酸和低牛磺酸代谢、脂多糖生物合成、谷胱甘肽代谢等功能较hc升高(p＜0.01)；而组氨酸代谢、rna聚合酶等代谢较hc明显降低(p＜0.001)。
[0051]
根据aid和hc肠道菌群特征，aid和hc均可分为两个肠型e1和e2。在门水平上， e1和e2的优势菌分别为厚壁菌门和变形菌门。在属水平上，e1和e2的优势菌分别为普氏菌属和拟杆菌属。不同肠型间在aid和hc中alpha多样性(p＜0.001)、beta多样性(p＜0.001)、菌群构成、相对丰度及代谢均存在明显差异(p＜0.05)。
[0052]
以lda score log10＞2为界，通过lefse筛选出不同肠型间基于属水平的肠道微生物分类标志物；通过主成分分析，分别提取两个肠型各优势菌的主成分pc1作为分类标志物的特征评分pc1i和pc1j，构建肠型的评分e-score模型，具体计算公式如下：
[0053]
e-score＝escore(e1)-escore(e2)＝∑pc1
i-∑pc1j[0054]
e1肠型的特征性菌为：ucg\005菌(ucg_005)、梭状芽孢杆菌ucg\014 (clostridia_ucg_014)、毛螺菌科\nk4a136\菌(lachnospiraceae_nk4a136_group)、嗜胆汁菌(bilophila)、真杆菌\共前列烷烯菌(_eubacterium_coprostanoligenes_group)、布劳提亚 (blautia)、真杆菌\埃希菌(_eubacterium_eligens_group)、阿利斯蒂普斯(alistipes)、丁蓖麻球菌(butyricicoccus)、cag\56菌(cag_56)、丛毛单胞菌(comamonas)、土孢子杆菌 (terrisporobacter)、un\f\u单宁鱼科(un_f_tannerellaceae)、巴内西拉(barnesiella)、瘤胃科(un_f__ruminococcaceae)、颤螺菌(oscillibacter)、瘤胃球菌(_ruminococcus__gauvreauii_group)、伦布西亚(romboutsia)、脱硫弧菌(desulfovibrio)、拉赫诺斯皮拉(lachnospira)、rf39菌(rf39)、蔷薇属(roseburia)、毛螺菌科\nd3007\菌 (lachnospiraceae_nd3007_group)、臭细菌(odoribacter)、未培养的瘤胃球菌科 (uncultured_f__ruminococcaceae)、毛螺菌科\ucg\003菌(lachnospiraceae_ucg_003)、毛螺菌科\ucg\001菌(lachnospiraceae_ucg_001)、毛螺菌科\ucg\010菌 (lachnospiraceae_ucg_010)、拨号器菌(dialister)、阴性纤毛菌(negativibacillus)、螺旋藻菌(incertae_sedis)、示波螺旋藻科菌(uncultured_f__oscillospiraceae)、毛螺菌科\fcs020\ 菌(lachnospiraceae_fcs020_group)、真杆菌科\腹菌(_eubacterium__ventriosum_group)、真杆菌科\锡雷乌姆菌(_eubacterium__siraeum_group)、阿克曼西亚(akkermansia)、ucg\010 (ucg_010)、粪球菌(coprococcus)、
科林塞拉(collinsella)、福涅雷拉(fournierella)、土杆菌(turicibacter)、丁基橡胶(butyrivibrio)、菊科\r\7\菌(christensenellaceae_r_7_group)、 ucg\002菌(ucg_002)、真杆菌\木霉菌(_eubacterium__xylanophilum_group)、丹毒菌科 ucg\003菌(erysipelotrichaceae_ucg_003)、单球状体(monoglobus)、霍尔德
·
梅内拉 (holdemanella)、丁酸蓖麻单胞菌(butyricimonas)、甲烷杆菌(methanobrevibacter)、nk4a214\ 组(nk4a214_group)、粪杆菌(faecalibacterium)、ucg\003菌(ucg_003)、肠杆菌 (intestinibacter)、鼠杆菌科(muribaculaceae)、真杆菌群(_eubacterium__hallii_group)、共右旋杆菌(colidextribacter)、酸性氨基球菌(acidaminococcus)、普雷沃菌属(prevotella)、未培养的红螺旋体(uncultured_f__uncultured_f__uncultured_o__rhodospirillales)、多莉娅 (dorea)、真杆菌反刍动物菌(_eubacterium__ruminantium_group)、共催化剂(coprobacter)、下穹窿(subdoligranulum)、副雷沃菌(paraprevotella)、盐单胞菌属(halomonas)、瘤胃球菌 (ruminococcus)、相位弧菌(phascolarctobacterium)、无杆菌(agathobacter)、家族性\xiii\ ad3011\菌(family_xiii_ad3011_group)、cag\352菌(cag_352)；
[0055]
e2肠型的特征性菌为：腔隙杆菌(lachnoclostridium)、假单胞菌(pseudomonas)、_梭菌群(_clostridium__innocuum_group)、大肠杆菌志贺氏菌(escherichia_shigella)、黄酮萃取菌 (flavonifractor)、类杆菌(bacteroides)、副卡特尼菌(fusicatenibacter)、瘤胃球菌\gnavus菌 (_ruminococcus__gnavus_group)、亨加泰拉(hungatella)、梭杆菌(fusobacterium)、瘤胃球菌\torques菌(_ruminococcus__torques_group)、未培养的\f\毛螺菌 (uncultured_f__lachnospiraceae)、莫加内拉(morganella)、巨单胞菌(megamonas)、梭状芽孢杆菌(clostridium_sensu_stricto_1)、梭状芽孢杆菌vadinbb60\菌 (clostridia_vadinbb60_group)、un\f\示波螺旋藻科(un_f__oscillospiraceae)、丹毒杆菌 (erysipelatoclostridium)、副甾体(parabacteroides)、副巴特拉菌(parasutterella)。
[0056]
为验证不同肠道微生物的分型及其评分对药物治疗的响应，对bioproject(prjna682730) 数据集中aid测试样本的肠道菌群进行分析及e-score评分。为评价肠型和e-score评分对甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)治疗的疗效，将mtx治疗4周后疾病活动评分das28下降大于1.8的ra测试样本分视为响应者(responders，r)，否则视为不响应者(non-responders， nr)。
[0057]
两名研究人员采取独立单盲进行病理评分，评分细则如下：
[0058]
炎性细胞浸润评分(0-3)：0＝正常，无浸润；1＝轻度浸润(1个炎性聚集灶或散在轻微浸润)；2＝中度浸润(≥2炎性聚集灶)；3＝重度浸润(广泛浸润，甚至到关节囊)；
[0059]
滑膜增殖评分(0-3)：0＝正常，无增殖；1＝轻度增殖(滑膜厚度2-4层细胞)；2＝中度增殖(滑膜厚度≥4层细胞)；3＝重度增殖(滑膜过度增殖，侵蚀软骨及骨，关节间隙消失)；
[0060]
骨侵蚀评分(0-3)：0＝正常，无侵蚀，关节面光滑；1＝轻度侵蚀(1-2个小浅部位点状侵蚀，关节面粗糙)；2＝中度侵蚀(1-4个中等大小的深部位侵蚀，关节面糜烂)；3＝重度侵蚀(≥5个部位，侵蚀深达骨皮质)。
[0061]
aid测试样本肠道中诸多菌及其预测的代谢功能与免疫细胞、细胞因子的水平密
切相关。构建的肠型及其评分e-score可有准确地预测评估aid测试样本对mtx治疗的预后。
[0062]
其中，无论是门水平还是属水平，aid测试样本肠道中诸多菌及其预测的代谢功能与t、 b、nk、cd4 t、cd8 t、th1、th2、th17、treg细胞数和il-2、il-4、il-6、il-10、inf-γ、 tnf-α等细胞因子的水平相关(p《0.05)。
[0063]
通过肠型优势菌群构建了肠型评分e-score，可以很好地区分e1、e2两种肠型，roc曲线下面积acu为93.3％(95％ci:90.2％-96.3％)。e1的e-score明显低于e2(p《0.001)。e-score 可有效评价mtx的响应率：高e-score的ra患者mtx的治疗响应率为21.4％，低e-score 的ra患者mtx的治疗响应率为69.2％。不响应组(nr)的e-score明显高于响应组(r) (p《0.05)。具体内容如下表：
[0064]
表2：不同肠型及e-score评分特征比较
[0065][0066]
实施例2，aid测试样本的肠型e-score对关节炎症的影响机制：
[0067]
(1)研究动物：dba/1小鼠，(7-8周，雄性，体重20
±
2g)，购买于江苏集萃药康生物科技股份有限公司(gempharmatech co.,ltd)，饲养于山西医科大学第二医院标准动物房，室温25℃左右，相对湿度55
±
10％，给予12h昼夜交替，自由摄食摄水，更换无菌垫料1 次/周。
[0068]
随机分成2组：
[0069]
高膳食纤维饮食组5只(sf11-025高纤维饲料；e1肠型组)，诱导cia模型，造模当天即开始给予高纤维饲料；
[0070]
正常饮食组7只(ain93g普通型饲料；e2肠型组)，诱导cia模型，普通型饲料喂养。
[0071]
(2)饲料配方及合成：sf11-025高纤维饲料及ain93g普通型饲料由北京博泰宏达生物科技有限公司负责合成，配方由specialty feeds公司提供，具体如下：
[0072]
表1：小鼠饲料配方表
[0073][0074]
(3)cia模型诱导：采用鸡ii型胶原诱导cia关节炎模型，
[0075]
具体试剂包括鸡ii型胶原(chicken type ii collagen，cc ii，sigma)、不完全弗氏佐剂 (incomplete freund’s adjuvant,icfa，sigma)、灭活结核杆菌(m.tuberculosis h37 ra，bd)、无水冰醋酸(天津市第二化学试剂厂)等。
[0076]
其中，冰醋酸配制(5mm)：10ml双蒸水中加入2.86μl无水冰醋酸，制成5mm的冰醋酸，常温保存；cc ii配制(4mg/ml)：1.5ml冰醋酸(5mm)中加入6mg cc ii，4℃冷藏过夜，充分溶解；含5mg/ml结核分子杆菌的完全弗氏佐剂配制：1.5ml的icfa中加入灭活结核分枝杆菌7.5mg，混匀，-20℃保存；乳化剂配制：cc ii和完全弗氏佐剂按1:1的比例混合，先将含胶原的冰醋酸加入到搅拌杯中，低速搅拌，后将完全弗氏佐剂逐滴加入，当溶液变为白色乳糜状时吸取少许滴于冰水混合物中，不扩散即为乳化完全。乳化全程冰上操作。
[0077]
初次免疫(0天)：每只小鼠腹腔注射5％水合氯醛0.12ml进行麻醉(注意回抽)，约10 min后，从距小鼠尾根部远端2cm处进针，将0.1ml乳化剂皮下推入，针尖在皮下走行(可见轮廓，避开静脉)。加强免疫(21天)：同上的方法再次皮下注射0.1ml乳化剂，尽量避开第一次注射部位。
[0078]
自21天始，采用5级评分法隔天衡量并记录关节病变程度。0＝关节无红肿；1＝小趾关节红肿；2＝趾关节及足跖关节红肿；3＝踝关节以下足爪红肿；4＝包括踝关节在内的全部足爪红肿，出现强直或关节畸形。4个肢体评分相加即为关节炎分数(arthritis score,as)，最高 16分。足趾肿胀用游标卡尺测量。第49天收集每只小鼠眼球血(外周血)至1.5ml抗凝ep 管中，3000rpm离心15min，移液枪取上清，-80℃保存，用于测外周血细胞因子和短链脂肪酸(short chain fatty acids，scfas)的表达水平。脱颈处死小鼠，10％福尔马
林溶液固定膝关节及足爪，待做micro-ct，而后将膝关节石蜡包埋行he染色。冻存管收集小鼠盲肠肠内容物，-80℃保存，用于做16s rrna肠道菌群分析。
[0079]
小鼠的il-2、il-4、il-6、il-10、il-17a、ifn-γ、tnf等细胞因子检测与第二部分中人的细胞因子检测方法相似，均采用流式微球阵列法(cba)方法，采用试剂盒为mouseth1/th2/th17 cba(cytometric bead array)kit。具体步骤为：加2ml ccs(nr spb/mouse/ratspb)stnd diluent稀释液稀释标准品s1，混匀静置15min。取一8联管，标记s2-9(分别稀释1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256)，每管加入300μl稀释液，从s1管取 300μl至s2管(1:2稀释)，吹打混匀；随后从s2管中取300μl至s3管(1:4稀释)，吹打混匀，以此类推，直至1:256；(2)最后取1支s0流式管，只加入300μl稀释液作为阴性对照标准管(0pg/ml)。确定实验样本数(12个检测样本、1个阴性对照管s0及9个标准品 s1-9)；(2)充分涡旋每种微球15s，吸取适量微球(10μl/sample)，混合所有微球置一支流式管中，充分涡旋混匀，制备混悬液。将每50μl标准品或检测样品中加入50μl微球混悬液，再加50μl pe检测抗体，室温避光孵育3h；每管加入1ml洗液，离心200g
×
5min，弃上清，每管再加入300μl洗液重悬微球；流式细胞仪上机检测，上机前充分混匀样本，分析数据。il-1β采用elisa法检测，采用的试剂盒mouse interleukin 1(il-1β)elisa kit。检测范围为12-960pg/ml；灵敏度≥2.4pg/ml。具体操作步骤为：(1)倍比稀释标准品：标准品浓度梯度为960pg/ml，480pg/ml，240pg/ml，120pg/ml，60pg/ml，0pg/ml，依次在酶标板标准品孔加入不同浓度标准品50μl；(2)设空白孔和待测样品孔，其中待测样品孔中加40μl样品及10μl的抗il-1β抗体，混匀，除空白孔每孔加酶标试剂50μl，封板，37℃孵育30min；(3)揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满稀释后的洗涤液静置30s后弃去甩干，反复5次；(4)每孔加50μl显色剂a及50μl显色剂b，混匀，37℃避光10min，每孔加50μl终止液(液体由蓝色立转黄色)；(5)测量各孔的吸光度，绘制标准曲线，计算浓度。
[0080]
采用气相色谱技术(gas chromatography，gc)进行检测外周血短链脂肪酸浓度。具体操作步骤为：
[0081]
(1)缓慢解冻血清样本，约4h，移液枪吸取样本100μl，加50％水稀释的浓硫酸50μl，再加乙醚150μl，混匀1min，4℃离心12000g，5min；
[0082]
(2)4℃静置30min，吸取乙醚层上清液，加无水硫酸钠去除水份，准备上机(飞行时间色谱仪)检测。其中包括，分离scfa：涂有5％苯基/95％甲基聚硅乙烷的hp-5ms色谱柱； 1μl的衍生物按10:1的比例分注，溶剂延迟时间设定为2.2min；设定烤箱温度：开始50℃， 2min升至70℃(v＝10℃/min)，5min升至85℃(v＝3℃/min)，5min升至110℃(v＝5℃/min)，6min 升至290℃(v＝30℃/min)，最后维持290℃，8min；氦气以v＝1ml/min的速度通过色谱柱，分别设定进气道、传输线、电子碰撞源的温度为260、290、230℃；电子能量为-70ev，质谱数据采用全扫描模式采集(m/z30
–
600)。下机数据通过基线校正、平滑、降噪、反褶积、库检索及面积计算，通过与标准化合物进行比较，鉴定化合物种类，并计算各衍生scfa的峰面积。
[0083]
设定扫描参数，利用analyze 12.0 micro-ct分析软件对小鼠膝关节及足爪进行三维重建。量化分析时将目标范围锁定为胫骨干骺端远侧2mm，计算得出whole bmd(总骨密度)、 cortex bmd(骨皮质骨密度)、trabeculae bmd(骨小梁骨密度)、intratrabecular bmd(小梁内骨密度)、trabecular tissue bmd(小梁组织骨密度)、bv/tv(骨体积分数)、bs/
bv(骨表面积/骨体积)、bs/tv(骨表面积/组织体积)。
[0084]
将小鼠膝关节迅速用10％福尔马林溶液固定48h；edta脱钙液常温脱钙2-3周，48h 更换一次脱钙液，待针头不费力扎入标本时表示脱钙成功；先后用70％、80％、90％、95％、 100％酒精(两次)脱水，0.5～1h/次；二甲苯浸泡，替换组织中的酒精；石蜡包埋；切片机切片，厚约5μm，将薄片置于45℃水中，全面展开，无气泡贴于载玻片，45℃恒温箱中烘干。依次将切片放入二甲苯(两次)、100％(两次)、95％、90％、80％、70％酒精各10min，流水冲洗石蜡；苏木精染色5～10min，自来水浸洗1min；1％盐酸乙醇分化10s，自来水浸洗 3-5min，褪去胞浆苏木精染色；1％的氨水蓝化5s，流水冲洗；伊红染色2min，自来水浸洗1min；再依次将切片放入70％，80％，90％，95％酒精各2min，2次100％酒精，10min/ 次；二甲苯浸泡3次，时间分别为2min，5min，10min；中性树胶封片；荧光显微镜采集图像，读片。
[0085]
高膳食饮食可降低e-score评分，诱导cia小鼠的肠型向e1转化，改善cia鼠关节的炎症症状，其机制可能是低e-score或e1肠型的肠道菌群分泌更多的短链脂肪酸，刺激抗炎性 il-10细胞因子的分泌，诱导了小鼠的自身免疫耐受。
[0086]
其中，高膳食纤维饮食的cia鼠e-score较普通饮食更低(p《0.01)，肠型向e1肠型转化。具体而言：正常饮食(ain93m普通型饲料)的cia小鼠的e-score评分分别为3.897962、 2.215709、1.978886、1.145529、2.456622、3.956396和2.040855，根据之前的roc模型评判，这些小鼠为高e-score评分组，属于e2肠型。高膳食纤维饮食组(sf11-025高纤维饲料)的 cia小鼠的e-score评分分别为-3.960113、-2.387914、-3.458802、-2.447307和-5.437824，为低e-score评分组，属于e1肠型。
[0087]
因饮食不同，小鼠肠型在不断地变化，最终收敛成e1和e2两种肠型。e1和e2小鼠关节炎症状逐渐呈现出差异。自第41天后，e1和e2小鼠关节炎分数出现的差异开始具有统计学意义(p《0.05)。第41、43、45、47、49天e1小鼠关节炎症分数分别为6.4
±
3.0、6.2
±
3.8、 5.2
±
3.6、5.4
±
3.8、5.4
±
3.8，明显低于e2组的12.0
±
2.9(p《0.01)、11.7
±
2.9(p《0.05)、 11.3
±
2.5(p《0.01)、11.0
±
2.6(p《0.05)、10.9
±
2.7(p《0.05)。值得注意的是，第49天处死小鼠时测定的肠型e-score与小鼠关节炎分数呈正相关(r＝0.770,p＝0.004)。在49天处死小鼠后，收集其膝关节进行he染色，观察关节炎症浸润水平、滑膜增生情况及骨质破坏程度。e1肠型小鼠膝关节内存在部分炎性细胞浸润、适量滑膜增生，相对较轻骨质破坏；e2 肠型小鼠膝关节内炎性细胞大量浸润，滑膜细胞明显增生，软骨层结构完整性破坏、骨质破坏明显。e1肠型小鼠膝关节的炎细胞浸润水平、滑膜增生情况及骨破坏程度均低于e2肠型，其中骨破坏程度具有统计学意义(p《0.05)。e-score与关节组织病理炎症程度呈正相关，其中与骨破坏程度(r＝0.600,p＝0.041)的相关性具有统计学意义，而与炎细胞浸润水平(r＝ 0.460,p＝0.130)、滑膜增生情况(r＝0.420,p＝0.170)未见统计学差异。
[0088]
小鼠足爪和膝关节的micro-ct三维成像如图6所示：e1和e2组小鼠爪子均有一定程度侵蚀，但e2组在远端指间关节、近端指间关节及掌指关节半脱位处的侵蚀程度明显较e1严重。与e1相比，e2的膝关节破坏更为严重，髌骨右侧不光整，形态较e1严重缺如。e1和 e2小鼠胫骨通用骨分析参数较为不同。与e2组相比，e1组的小梁内(p《0.05)及小梁组织(p《0.01)的骨矿物质含量明显升高，骨表面积和骨体积的比值(bs/bv)明显偏低(p《0.05)，相对骨体积或骨体积分数(bv/tv)明显升高(p《0.05)。e-score与小梁内骨密度(r＝-0.730, p＝0.025)、小梁组织骨密度(r＝-0.86,p＝0.003)、bv/tv(r＝-0.850,p＝0.004)呈负相
关，与bs/bv(r＝0.870,p＝0.002)呈正相关。简言之，与e2肠型相比，e1肠型cia小鼠的足爪关节炎分数更低，膝关节组织病理骨破坏程度更轻，骨矿物质含量水平更高，骨表面积和骨体积的比值(bs/bv)明显偏低，相对骨体积或骨体积分数(bv/tv)明显升高，且差异程度与e-score呈现高度相关性。
[0089]
第49天取小鼠外周血血清，用气相色谱法检测短链脂肪酸(scfa)水平，如图所示： e1组的各种scfa水平均明显高于e2组，其中总scfa(p《0.05)、丙酸(p《0.05)、异丁酸 (p《0.001)水平差异具有统计学意义。肠型e-score与总的短链脂肪酸(r＝-0.800,p＝0.006)、乙酸(r＝-0.47,p＝0.170)、丙酸(r＝-0.750,p＝0.012)、丁酸(r＝-0.480,p＝0.160)、异丁酸(r＝-0.830,p＝0.003)、戊酸(r＝-0.590,p＝0.074)、异戊酸(r＝-0.580,p＝0.077)、己酸(r＝-0.340,p＝0.330)均为负相关，其中总的短链脂肪酸、丙酸、异丁酸具有统计学意义(p《0.05)。简言之，e1肠型cia小鼠血清总scfa、丙酸、异丁酸明显高于e2肠型小鼠，且高低水平与e-score呈现高度相关性(p《0.05)。
[0090]
第49天取小鼠外周血血清，用elisa法检测血中il-1β，cba法检测il-6、il-10、il-17a、 tnf-α细胞因子，结果显示e1组小鼠血清的il-1β、il-6、il-17a、tnf-α等促炎细胞因子低于e2组，但差异无统计学意义；e1组小鼠血清il-10水平明显高于e2组(p《0.01)。e-score 与il-1β(r＝0.110,p＝0.740)、il-6(r＝0.510,p＝0.090)、il-17a(r＝0.170,p＝0.590)、 tnf-α(r＝0.550,p＝0.061)呈正相关，与il-10(r＝-0.680,p＝0.014)呈负相关。简言之， e1肠型cia小鼠血清il-10水平高于e2肠型(p《0.01)，且il-10水平与e-score呈负相关 (r＝-0.680,p＝0.014)。这部分的主要结果如下表：
[0091]
表3：不同肠型关节炎症水平及免疫特征比较
[0092][0093]
综上，本发明通过如上方法发现了aid的发生发展与肠道菌群有着密切关系，菌群与疾病的活动情况及对治疗药物的反应息息相关。肠道共生菌菌株可影响免疫反应的强弱，提示某些特定种类的肠道微生物在aid的发生发展中发挥致病性或保护性的作用。根据aid测试样本肠道菌群的特征，本发明构建了一套新型的肠道菌群e1和e2两个肠型。为了更好的量化e1和e2两肠型的特征，本发明构建了一套肠型评分e-score的算法，据此算法可对任意一有肠道肠道菌群测序的患者或动物进行肠型判别。
[0094]
肠型e-score可有效评价药物治疗的疗效，其中高e-score的药物治疗有效率为21.4％，低e-score的药物治疗有效率为69.2％。不响应组(nr)的e-score明显高于响应组
(r)。
[0095]
饮食可以重塑肠道菌群的肠型特征，改变肠型e-score评分，尤其是配方中所涉及的高膳食纤维，可将降低e-score评分，将肠型由e2转化成e1肠型。
[0096]
与e2肠型相比，e1肠型的关节炎分数更低，膝关节组织病理骨破坏程度更轻，骨矿物质含量水平更高，骨表面积和骨体积的比值(bs/bv)明显偏低，相对骨体积或骨体积分数 (bv/tv)明显升高。这可能是由于e1肠型的血清总scfa、丙酸、异丁酸明显高于e2肠型小鼠，e1肠型血清il-10水平高于e2肠型，il-10水平与e-score呈负相关。其机制可能是低e-score或e1肠型的肠道菌群合成了更多的短链脂肪酸，刺激抗炎性il-10细胞因子的分泌，诱导了其自身免疫耐受，这将大大有益于aid疾病的康复。
[0097]
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。