一种基于磁性COF复合材料的miRNA光电化学生物传感器及其制备方法和应用

一种基于磁性cof复合材料的mirna光电化学生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于功能生物材料和生物传感技术领域，具体涉及一种基于磁性cof复合材料的mirna光电化学生物传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.microrna(mirna)是由19-24个核苷酸构成的内源性非编码rna。mirna在多种疾病的发生和发展阶段皆存在异常表达，可以作为非创伤性诊断的标志物。因此，发展灵敏检测mirna的分析方法对于临床诊断具有重要意义。然而，由于mirna的序列长度短、浓度低、序列同源性高且易降解，准确地检测mirna极具挑战。当前，应用最为广泛的mirna检测方法包括印迹法、反转录聚合酶链反应法以及微阵列法。其中，印记法是检测mirna的标准方法，但该方法耗时长、灵敏度低且样品需求量大。反转录聚合酶链反应法虽然具有灵敏度高和特异性好的优势，但是所需的引物短，导致该方法检测准确度不高。此外，该方法中存在的反转录步骤使得实验复杂性增加，同时増加了实验成本。尽管微阵列分析法可以实现mirna的多重检测，但其重现性低、交叉杂交及非特异性吸附等问题降低了检测的准确度。因此，开发一种高特异性、高灵敏度且简便的mirna检测方法是十分必要的。
3.光电化学(pec)生物传感器依靠光敏材料与电极之间的电子和空穴的转移，能够将生化指标转化为可读取的光电信号，其灵敏度高、背景信号低，比传统检测方法更有优势。另外，该传感技术由于成本低，操作简单且易于小型化，目前已被推广应用于各类生物检测中。然而，传统的pec传感器在检测过程中是基于光电信号相对于背景信号的增强或减弱进行分析，其缺点在于共存干扰物易于造成假阳性或假阴性信号，导致检测的特异性和灵敏度降低。针对上述问题，光电流极性翻转策略是一种理想的选择。光电流极性翻转型光电化学生物传感器的构建可以实现在目标物存在的情况下光电流的极性发生改变，因而具备高灵敏度和高选择性的优势。
4.在pec生物传感器中，光电活性材料的选择至关重要。一些传统光电材料，如硫化物、氮化碳、氧化物等，由于光电性能良好而广泛应用于pec传感领域。然而，对于多数传统活性材料构建的pec传感器，在检测中都需加入电子供体，如抗坏血酸和过氧化氢等，从而补偿电子消耗而获得稳定的pec信号。同时，光电子在光电活性材料和电子供体间的传递是分子间的传递过程，这大大降低了电子传递的效率和稳定性，因而限制了光电流响应信号强度的提高。电子供体-受体型(d-a)共价有机框架材料(cof)是由供电子基团和吸电子基团构成的新型半导体。基于d-a cof的pec分析无需在检测液中加入电子供体即可获得良好的光电信号。另外，d-a cof能实现分子内的电子转移，具备自增强效应，有望提升pec传感的性能，在pec传感领域具有潜在应用前景。因此，基于供体-受体型cof材料优异的光电性质，发展新的光电流极性翻转体系，构建可用于灵敏检测mirna的pec生物传感器具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是结合催化发卡自组装(cha)信号放大策略与磁分离技术，发展一种基于磁性cof复合材料的光电流极性翻转型光电化学生物传感器用于高灵敏、高特异性地检测复杂样品中的mirna。如附图1所示，首先，发卡结构dna(hp1)修饰的fe3o4@d-a cof(fe3o4@d-a cof-hp1)通过碱基互补配对从复杂样品中高效富集目标物mirna，并打开hp1的发卡结构。随后，修饰znse量子点(qds)的发卡结构dna hp2(znse qds-hp2)的引入启动cha反应，取代mirna。释放的mirna进而与下一个发卡结构的hp1杂交，引发下一个cha反应，如此循环使得fe3o4@d-a cof表面捕获大量的znse qds，从而实现信号放大。最后，利用磁性吸附将磁性复合物引入到磁性工作电极表面，在光照下检测pec信号变化，从而实现对目标物的高灵敏、特异性检测。其中，znse qds作为一种光敏材料，与d-a cof在能级上相匹配，这不仅有利于光生载流子的转移，还能诱导磁性cof复合材料(fe3o4@d-a cof)的光电流极性发生改变。所提出的基于znse qds诱导磁性cof复合材料新型光电流极性翻转体系有利于提升pec生物传感器的特异性。此外，通过更换相应的hp1和hp2，可实现不同种类mirna的检测。
6.基于上述目的，本发明所涉及的技术方案如下：
7.(1)fe3o4@d-a cof-hp1的制备
8.a.fe3o4的制备
9.首先，将fecl3·
6h2o(0.24～1.88g)溶解于10～80ml乙二醇中。随后，依次加入0.40～1.86g乙酸钠和0.10～1.00g柠檬酸钠，搅拌10～90min。将混合溶液转移到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，并在150～220℃下反应6～20h。冷却至室温后，用磁铁收集产物，用去离子水和乙醇洗涤数次，然后真空干燥。
10.b.fe3o4@d-a cof的制备
11.称取10～50mg的fe3o4，将其分散在5～50ml的乙腈溶液中，超声处理10～60min。然后加入1,3,5-三(4-氨苯基)苯(0.1～0.3mmol)，室温下用摇床缓慢摇晃2～8h。随后，加入0.1～0.4mmol的2,5-二甲氧基对苯-1,4-二甲醛和1～8ml的冰醋酸(6～12mol/l)，继续室温摇晃12～36h后，外加磁场分离产物，用甲醇洗涤3次，最后真空干燥。
12.c.羧基化fe3o4@d-a cof(fe3o4@d-a cof-paa)的制备
13.将0.5～2ml的聚丙烯酸(paa)溶液(5mg/ml)与0.5～2ml含有0.1m edc/nhs(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺)的水溶液混合后，在黑暗中摇晃10～40min。然后，加入0.5～2ml的fe3o4@d-a cof溶液(4mg/ml)。将混合溶液摇晃12～36h后，用超纯水洗涤3次，并进行磁分离。最后，将产品分散在2ml的超纯水中，并在4℃下保存备用。
14.d.fe3o4@d-a cof-hp1的制备
15.将10～200μl羧基化的fe3o4@d-a cof分散液与10～200μl含有0.1m的edc/nhs溶液混合，摇晃10～40min，经磁分离和磷酸盐缓冲(pbs)溶液(0.1m，ph＝7.4)洗涤后，加入10～200μl含有hp1(100μm)的pbs溶液，然后在25～40℃下反应40～90min，得到fe3o4@d-a cof-hp1。经磁分离和pbs溶液洗涤后用1％牛血清白蛋白(bsa)封闭剩余的活性位点，然后将其重新分散在100μl的pbs溶液中备用。
16.(2)znse qds-hp2的制备
17.a.znse qds的制备
18.在氮气气氛下，将28～240mg的nabh4加入1～8ml超纯水中，再加入22～220mg的se粉，由此获得的nahse作为se前驱体。将100～400mg的zn(ch3cooh)2溶解在5～40ml超纯水中，在90～110℃下用n2鼓泡搅拌，然后加入200～500μl的巯基丙酸(mpa)。在n2保护下，用0.1～1m naoh将溶液的ph值调节至9～11，将1～5ml的nahse溶液快速注入上述溶液中。反应2～6h后，获得mpa包覆的znse qds溶液。用乙醇萃取三次后，以8000rpm的速度离心除去未反应的试剂，得到纯化的znse qds。加入超纯水超声分散得到1～4mg/ml的znse qds分散液，4℃下避光储存备用。
19.b.znse qds-hp2的制备
20.将10～200μl的znse qds分散液加到含有0.1m edc/nhs的200μl pbs(0.1m，ph＝7.4)溶液中，反应20～60min。用pbs离心洗涤后，加入50～300μl含150μm hp2的pbs，在37℃下反应1～3h，用pbs离心洗涤3次，得到znse qds-hp2。最后，用1％bsa封闭，并重新分散于200μl pbs溶液中，在4℃储存备用。
21.(3)光电化学生物传感器的制备
22.首先，将10～100μl的fe3o4@d-a cof-hp1溶液和10～100μl的znse qds-hp2溶液加到10～100μl不同浓度的mirna样品中，反应10～60min。由于hp2和hp1之间的结合位点更多，hp2的加入可以引发cha，mirna被置换下来并进入下一个循环。将得到的fe3o4@d-a cof-hp1/znse qds-hp2复合物经磁分离和pbs洗涤后，分散在100μl的pbs溶液中。最后，将分散液(10～30μl)滴在磁性氧化铟锡(ito)电极表面，磁性复合物被电极迅速捕获，在氙灯照射下的pbs溶液中进行pec测试。其中，饱和甘汞电极和铂电极分别作为参比电极和对电极，与工作电极共同构成三电极体系。
23.所述的mirna为：mirna-1、mirna-16、mirna-21、mirna-34a、mirna-107、mirna-133a、mirna-138、mirna-141、mirna-146a、mirna-155、mirna-373等。
24.发明原理：本发明中的fe3o4@d-a cof具有优异的光电性能和很强的磁性，并修饰有大量的探针hp1。当有目标物mirna存在时，hp1修饰的fe3o4@d-a cof可以从复杂样品中高效富集目标物。因此，使用fe3o4@d-a cof，可以简化实验操作步骤并可以聚集分析物，从而提高生物传感器的灵敏度。目标mirna的存在使得fe3o4@d-a cof-hp1的hp1发卡结构打开，但是由于hp2和hp1之间的结合位点更多，因而znse qds-hp2的加入可以引发cha反应，释放mirna进入下一个循环，从而可以在fe3o4@d-acof表面捕获更多的znse qds，有利于低浓度目标物的检测。最后，利用磁性吸附将磁性复合物引入到磁性工作电极表面，在光照下检测pec信号变化，实现对目标物的高灵敏、高特异性检测。其优点在于：
25.(1)高灵敏度。本发明使用的d-a cof和znse qds，均是光电性能良好的光电材料，极低浓度目标物的引入就可以引起明显的光电流信号输出；另一方面，采用催化发卡自组装策略，通过循环释放目标mirna实现信号放大。
26.(2)特异性强，常见其他mirna和电活性/电惰性干扰物对目标mirna检测均无干扰。原因在于：一方面，本发明是基于目标mirna序列设计的两条发卡结构dna序列(hp1和hp2)，目标mirna与hp1碱基互补配对结合打开hp1发卡结构，使得hp2能与hp1通过碱基互补配对结合，引发cha反应，其他mirna序列不同，不能引发cha反应；另一方面，仅目标mirna能诱导znse qds-hp2与fe3o4@d-acof-hp1的结合，引发光电流极性翻转，但其他mirna和电活
性/电惰性干扰物的存在无法诱导znse qds-hp2与fe3o4@d-a cof-hp1结合，不能使光电流极性发生改变。故均对本检测体系无干扰。
27.(3)检测方法简便、快速。将fe3o4@d-acof-hp1、znse qds-hp2、目标mirna放进同一个容器中，实现快速识别并形成光电流极性翻转体系znse qds//fe3o4@d-a cof，通过磁辅助快速分离并吸附到磁性ito电极上，即可检测得到即时的光电化学极性翻转信号，实现目标物高灵敏、高选择性检测。
28.(4)此方法具有普适性。只需根据目标mirna序列设计相应的发卡结构dna(hp1和hp2)，即可实现对不同mirna的检测。
29.综上所述，本发明基于磁性cof复合材料，将光电流极性翻转策略、催化发卡自组装信号放大策略以及磁分离技术有机结合，构建一种mirna光电化学生物传感器，具有高灵敏度、高特异性、普适性、简便快速、易于操作等优点，可以实现复杂样品中低浓度mirna的检测，具有良好的即时和临床检测应用前景。
附图说明
30.图1为所述的基于磁性cof复合材料的mirna光电化学生物传感器的制备流程图；
31.图2为所述的光电化学生物传感器对mirna-138检测的光电响应图；
32.图3为所述的光电化学生物传感器对mirna-138检测的标准曲线图；
33.图4为所述的光电化学生物传感器的选择性实验数据图。
具体实施方式
34.下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步详细描述。
35.下述实施例中，所有寡核苷酸均购买自生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
36.实施例1fe3o4@d-a cof-hp1和znse qds-hp2的制备
37.(1)fe3o4@d-a cof-hp1的制备
38.a.fe3o4的制备
39.首先，将fecl3·
6h2o(1.36g)溶解于40ml乙二醇中。随后，依次加入1.44g乙酸钠和0.40g柠檬酸钠，搅拌50min。将混合溶液转移到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，并在200℃下反应14h。冷却至室温后，用磁铁收集产物，用去离子水和乙醇洗涤数次，然后真空干燥。
40.b.fe3o4@d-a cof的制备
41.称取30mg的fe3o4，将其分散在30ml的乙腈溶液中，超声处理30min。然后加入1,3,5-三(4-氨苯基)苯(0.24mmol)，室温下用摇床缓慢摇晃6h。随后，加入0.36mmol的2,5-二甲氧基对苯-1,4-二甲醛和6ml的冰醋酸(12mol/l)，继续室温摇晃24h后，外加磁场分离产物，用甲醇洗涤3次，最后真空干燥。
42.c.羧基化fe3o4@d-a cof(fe3o4@d-a cof-paa)的制备
43.将1ml的paa溶液(5mg/ml)与1ml含有0.1m edc/nhs的水溶液混合后，在黑暗中摇晃30min。然后，加入1ml的fe3o4@d-a cof溶液(4mg/ml)。将混合溶液摇晃24h后，用超纯水洗涤3次，并进行磁分离。最后，将产品分散在2ml的超纯水中，并在4℃下保存备用。
44.d.fe3o4@d-a cof-hp1的制备
45.将100μl羧基化的fe3o4@d-a cof分散液与100μl含有0.1m的edc/nhs溶液混合，摇晃30min用pbs溶液洗涤后，加入100μl含有hp1(100μm)的pbs溶液，然后在37℃下反应60min，得到fe3o4@d-acof-hp1，所述的hp1(发卡结构dna)的序列为5
’‑
nh
2-(ch2)
6-cggcctgattcacaacaccagctccatgtgtagaagctggtgttgtgaatc-3’。然后用pbs洗涤并用1％bsa封闭后，将其重新分散在100μl的pbs溶液中备用。
46.(2)znse qds-hp2的制备
47.a.znse qds的制备
48.在氮气气氛下，将132mg的nabh4加入4ml超纯水中，再加入110mg的se粉，由此获得的nahse作为se前驱体。将229mg的zn(ch3cooh)2溶解在25ml超纯水中，在100℃下用n2鼓泡搅拌，然后加入375μl mpa。在n2保护下，用1m naoh将溶液的ph值调节至10，将2.85ml的nahse溶液快速注入上述溶液中。反应5h后，获得mpa包覆的znse qds溶液。用乙醇萃取三次后，以8000rpm的速度离心除去未反应的试剂，得到纯化的znse qds。加入超纯水超声分散得到2mg/ml的znse qds分散液，4℃下避光储存备用。
49.b.znse qds-hp2的制备
50.将100μl的znse qds加到含有0.1m edc/nhs的200μl pbs(0.1m，ph＝7.4)溶液中，反应30min。用pbs离心洗涤后，加入200μl含150μm hp2的pbs，在37℃下反应2h，用pbs离心洗涤3次，得到znse qds-hp2，所述的hp2(发卡结构dna)的序列为5
’‑
nh
2-(ch2)
6-caccagcttctacacatggagctggtgttgtgaatccatgtgtaga-3’。最后，用1％bsa封闭，然后重新分散于200μl pbs溶液中，在4℃储存备用。
51.实施例2标准样品和人血清样品中mirna的检测
52.基于实施例1制备的fe3o4@d-a cof-hp1和znse qds-hp2，将10μl的fe3o4@d-a cof-hp1溶液和100μl的znse qds-hp2溶液加到100μl含有不同浓度的mirna的标准溶液/人血清溶液中，反应30min。将得到的fe3o4@d-a cof-hp1/znse qds-hp2复合物用pbs洗涤并进行磁分离，分散在100μl的pbs溶液中。最后，将分散液(20μl)滴在磁性ito电极表面，磁性复合物被电极迅速捕获，氙灯照射下，在pbs溶液中进行pec测试。
53.实施例3mirna-138的检测
54.基于实施例1和实施例2的过程，以mirna-138为目标物模型进行检测，所述的mirna-138序列为5
’‑
agcugguguugugaaucaggccg-3’，且所制备的fe3o4@d-a cof-hp1和znse qds-hp2中hp1和hp2的序列是根据目标物mirna-138的序列设计的，记录在加入不同mirna-138标准浓度下的光电流响应曲线。mirna-138标准溶液的浓度从a到j分别为0fm、1fm、5fm、10fm、50fm、100fm、1pm、10pm、30pm、50pm。结果如附图2，随着mirna-138浓度的增加，极性翻转的光电流信号强度随之增加。并且如附图3所示，可以观察到pec光电流信号大小与mirna-138浓度的对数在1fm
–
10pm之间呈现良好的线性关系。线性相关方程为δi(na)＝672.26logc
mirna-138(fm) 1380.66(r2＝0.9924)。δi＝i
–
i0，i和i0是分别在mirna-138存在和不存在情况下的光电流数值。检测限计算值为0.42fm，表明该传感器具有极好的分析性能。上述实验结果说明了我们所提出的分析方法具有灵敏检测mirna的应用价值。
55.实施例4选择性和抗干扰实验
56.在选择性和抗干扰实验中，目标物mirna-138浓度为1pm，所用到的其他干扰物名称及浓度如下：mirna-155(10pm)、mirna-141(10pm)、mirna-21(10pm)与mirna-107(10pm)。
按上述实施例1、实施例2和实施例3的步骤，用其他mirna代替mirna-138用于选择性检测，将其他mirna与mirna-138混合用于抗干扰性检测。结果如附图4所示，与mirna-138对比，其他mirna的引入并未引起光电流信号极性翻转，基本接近空白信号，说明本发明方法对目标mirna-138的检测具有极好的选择性。此外，其它mirna与mirna-138混合后，并未影响光电流的极性翻转及翻转后的信号强度，说明本发明所提出的传感器对目标mirna的检测具有极好的抗干扰性能。
57.上述说明是针对本发明可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。