用于豌豆源性成分实时荧光PCR检测的成套试剂及检测方法与流程

用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的成套试剂及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体是指用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的成套试剂及检测方法。


背景技术：

2.随着人们对于健康的重视，以植物基肉制品为代表的新一代的食品因具有健康、可持续的内涵，将成为未来全球食品行业发展的主要方向之一。植物基食品不含胆固醇，又能满足人体对蛋白质的需求，尤其适用于乳糖不耐受人群和消化障碍人群。因为植物基食品强调的是蛋白质的替代，所以蛋白质含量高的豆类是植物基食品良好的蛋白质来源。在传统的植物蛋白消费中，大豆蛋白独占鳌头，随着对植物基新原料的不断开拓，豌豆蛋白的优势逐渐凸显，成为植物基原料新宠；
3.首先，豌豆蛋白氨基酸配比均衡，不仅含有成人所必需的全部8种氨基酸，还含有儿童所额外需要一种组氨酸，尤其是人体第一限制性氨基酸——赖氨酸含量也很高，营养价值高，吸收率能达到98％以上。此外，大豆蛋白容易导致人体的过敏反应，而豌豆蛋白不含致敏源，不含乳糖、谷蛋白和麸质，无抗生素残留，不含转基因成分，安全性更高，因此，豌豆蛋白是替代动物蛋白的首选植物蛋白；
4.但是目前尚无豌豆源性成分检测标准和检测方法，市场上销售的豌豆蛋白及其制品鱼龙混杂、真假难辨，因此急需开发快速、灵敏、精准的豌豆源性成分检测方法，以保护消费者的权益，并为豌豆蛋白的进出口监管提供技术支撑。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服上述技术的缺陷，提供用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的成套试剂及检测方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的成套试剂，所述成套试剂包括引物对及探针，所述引物对的上游引物为：5
’‑
ctggacgagtcgcgtactagatc-3’，所述引物对的下游引物为：5
’‑
tataggcacttgggtgtacttttac-3’，所述探针为：5
’‑
atgcaatgcagtcgggtttcgacgacatctt-3’，其中在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团tamra，在探针的5’端连接有一个荧光报告基团fam。
7.进一步地，所述成套试剂用于检测待测样品中是否含有豌豆源性成分。
8.本发明还提供一种用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的检测方法，所述检测方法以待测样品的基因组dna为模板，采用所述成套试剂进行实时荧光pcr并检测荧光信号，如结果显示阳性扩增曲线，则待测样品含有或疑似含有豌豆源性成分；如结果不显示阳性扩增曲线，则待测样品不含有或疑似不含有豌豆源性成分。
9.本发明与现有技术相比的优点在于：
10.1)特异性强：以豌豆lectin基因为检测靶标，建立了豌豆成分实时荧光pcr检测方
法，提高了特异性，有效避免假阳性或假阴性；
11.2)灵敏度高，豌豆源性检测方法的灵敏度可稳定达到0.1％(w/w)；
12.3)有较好的重复性与稳定性。
附图说明
13.图1是本发明的特异性检测豌豆成分的结果；
14.图2是本发明的模拟添加鳕鱼粉，检测豌豆成分的灵敏度检测结果；
15.图3是本发明的模拟添加易混豆粉，检测豌豆成分的灵敏度检测结果。
具体实施方式
16.下面结合实施例对本发明用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的成套试剂及检测方法做进一步的详细说明。
17.实施例1
18.用于豌豆源性成分实时荧光pcr检测的成套试剂，所述成套试剂包括引物对及探针，所述引物对的上游引物为：5
’‑
ctggacgagtcgcgtactagatc-3’，所述引物对的下游引物为：5
’‑
tataggcacttgggtgtacttttac-3’，所述探针为：5
’‑
atgcaatgcagtcgggtttcgacgacatctt-3’，其中在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团tamra，在探针的5’端连接有一个荧光报告基团fam；
19.所述成套试剂用于检测待测样品中是否含有豌豆源性成分，具体检测方法包括：以待测样品的基因组dna为模板，采用所述成套试剂进行实时荧光pcr并检测荧光信号，如结果显示阳性扩增曲线，则待测样品含有或疑似含有豌豆源性成分；如结果不显示阳性扩增曲线，则待测样品不含有或疑似不含有豌豆源性成分。
20.实施例2特异性检测
21.分别提取待测样品的基因组dna，进行实时荧光pcr扩增，检测引物和探针的特异性。
22.所述待测样品包括：
23.1)甜豌豆，青豌豆，白豌豆；
24.2)阴性对照：阴性对照：黄大豆、黑豆、芸豆、绿豆、扁豆、鹰嘴豆、红豆、大米、薏米、高粱米、红米、黑米、黑麦、荞麦、苦荞、燕麦、大麦、小麦、藜麦、黄米、奇亚籽、黑芝麻、玉米、木耳、香菇、鳕鱼、猪肉、牛肉、鸭肉；
25.3)空白对照：ddh2o。
26.结果显示，豌豆样品均出现明显的扩增曲线，黄大豆等其他谷物以及异源性动植物基因组dna(图1)均无扩增检测结果，不同物种之间没有交叉反应，说明所述的豌豆源性成分实时荧光pcr检测方法具有很好的特异性。
27.实施例3灵敏度检测
28.1)模拟添加鳕鱼粉检测豌豆源性的灵敏度检测结果
29.将豌豆样品和鳕鱼粉样品按质量比例(100％、10％、1％、0.1％)进行混合，提取不同浓度混合样品的dna，作为灵敏度检测模板，进行实时荧光pcr检测，其中以ddh2o作为空白对照；
30.结果显示如图2所示，所述豌豆源性成分实时荧光pcr检测方法的灵敏度可稳定达到0.1％(w/w)。
31.2)模拟添加易混豆粉检测豌豆源性的灵敏度检测结果
32.将豌豆样品和易混豆粉(黄豆、绿豆和鹰嘴豆混合物)基质按质量比例(100％、10％、1％、0.1％)进行混合，提取不同浓度混合样品的dna，作为灵敏度检测模板，进行实时荧光pcr检测，其中以ddh2o作为空白对照；
33.结果显示如图3所示，所述豌豆源性成分实时荧光pcr检测方法的灵敏度可稳定达到0.1％(w/w)。
34.实施例4重复性和稳定性实验
35.以1μl浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl的豌豆基因组dna为模板进行实时荧光pcr检测，以不同浓度基因组dna获得的ct值计算其平均数和变异系数，进行重复性和稳定性分析。结果显示，批内变异系数在0.22％～0.79％，批间变异系数在0.49％～0.93％(表1)，说明所述的豌豆源性成分的实时荧光pcr检测方法有较好的重复性和稳定性。
36.表1豌豆源性成分实时荧光pcr重复性和稳定性试验分析结果
[0037][0038]
实施例5市售产品的检测
[0039]
对市售的豌豆粒、豌豆粉，豌豆蛋白以及不含豌豆源性成分的豆粉、豆奶、素肉食品等160份样品进行检测，其中豌豆样品均出现扩增曲线，均为阳性结果；不含豌豆源性成分的豆粉、豆奶等样品均未出现扩增曲线，为阴性结果(表2)，检测结果与商品标识一致。
[0040]
通过大量的实际应用结果可见，本方法用于检测食品中豌豆源性成分具有很好的适用性。
[0041]
表2市售豌豆成分商品的检测结果
[0042]
样品名称数量(份)豌豆源性成分阳性数量(份)阳性比例％是否与商品标识一致豌豆粒2020100是豌豆粉2020100是豌豆蛋白粉2020100是素肉食品(豌豆蛋白)2020100是豌豆泥1010100是大豆粉100-是大豆乳100-是素肉食品(大豆蛋白)500-是
[0043]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术
人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。