一种胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法

1.本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法。


背景技术：

2.胡椒碱是胡椒主要功能物质，是衡量胡椒品质高低的主要因子，也是胡椒果实中含量最大、活性最高的生物碱，既承载着胡椒口感热辣和促进食欲的两大传统功能，又具有抗炎症、抗抑郁、提高药效、降血脂、抑制肿瘤等多种功能，同时对羟基有较好的清除作用，可作为抗氧化剂，也被证明可提高四环素、链霉素、乙胺丁醇等药物的生物利用度。胡椒碱常通过溶剂萃取法提取出来，但均以胡椒干制品为原料进行提取，目前缺少胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法，前期通过实验发现，胡椒鲜果中胡椒碱的含量随着生长期的不同而变化，一定生长期鲜果中胡椒碱的含量相对干果中的更高，因此，利用胡椒鲜果为原料进行胡椒碱的提取，将提高胡椒原料的利用率、减少胡椒鲜果的加工环节、节约胡椒的加工成本。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法，本发明提供的提取方法适用于胡椒鲜果提取，能安全高效最大限度提取胡椒鲜果中的胡椒碱，提取液既可用于高效液相色谱仪分析检测胡椒碱含量，亦可用于胡椒油树脂的制备。
4.本发明提供了一种胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法，包括以下步骤：
5.a)将胡椒鲜果冷冻后脱粒，得到胡椒果粒；
6.将所述胡椒果粒加入液氮研磨，得到破碎的果粒；
7.b)将所述破碎的果粒与缓冲溶液和果胶酶混合进行酶解，得到酶解液；
8.将所述酶解液离心，得到酶解残余物；
9.c)将所述酶解残余物与缓冲溶液和淀粉酶混合进行酶解，得到酶处理后的残余物；
10.d)将酶处理后的残余物与乙醇溶液混合，进行加热回流提取，得到回流提取液；
11.e)将所述回流提取液过滤，得到胡椒碱提取液。
12.优选的，步骤a)中，冷冻的温度为-60～-80℃，所述冷冻的时间为2h以上。
13.优选的，步骤b)中，所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠水溶液或乙酸-乙酸钠水溶液，所述缓冲溶液的ph为3～5；
14.所述破碎的果粒、缓冲溶液与果胶酶的质量比为1：(5～10)：(0.01～0.2)。
15.优选的，步骤b)中，所述酶解的温度为35～50℃，时间为0.5～2h。
16.优选的，步骤c)中，所述缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液，用柠檬酸和氢氧化钠调节ph，所述缓冲溶液的ph为6.5～7.5。
17.所述酶解残余物、缓冲溶液和淀粉酶的质量比为1：(5～10)：(0.02～0.2)。
18.优选的，步骤b)中，所述酶解的温度为50～60℃，时间为0.5～3h。
19.优选的，步骤d)中，所述乙醇溶液的体积浓度为80％～100％；
20.酶处理后的残余物与乙醇溶液的质量比为2～10：(40～80)。
21.优选的，步骤d)中，所述回流提取的温度为70～90℃，时间为0.5～3h。
22.优选的，步骤e)中，所述过滤为选用定性滤纸过滤。
23.本发明还提供了一种胡椒油树脂，由上述提取方法提取得到的胡椒碱提取液浓缩得到。
24.与现有技术相比，本发明提供了一种胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法，包括以下步骤：a)将胡椒鲜果冷冻后脱粒，得到胡椒果粒；将所述胡椒果粒加入液氮研磨，得到破碎的果粒；b)将所述破碎的果粒与缓冲溶液和果胶酶混合进行酶解，得到酶解液；将所述酶解液离心，得到酶解残余物；c)将所述酶解残余物与缓冲溶液和淀粉酶混合进行酶解，得到酶处理后的残余物；d)将酶处理后的残余物与乙醇溶液混合，进行加热回流提取，得到回流提取液；e)将所述回流提取液过滤，得到胡椒碱提取液。本发明提供的提取方法适用于胡椒鲜果中胡椒碱的提取，能安全高效最大限度提取胡椒鲜果中的胡椒碱，提取液既可用于高效液相色谱仪分析检测胡椒碱含量，亦可用于胡椒油树脂的制备。本发明提供的提取方法安全、卫生、高效。
附图说明
25.图1为胡椒鲜果提取物的液相图谱；
26.图2为胡椒碱标准曲线；
27.图3为胡椒碱标准品的液相图谱；
28.图4为不同实施例和对比例中胡椒碱含量；
29.图5为鲜胡椒油树脂的gc-ms总离子流图。
具体实施方式
30.本发明提供了一种胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法，包括以下步骤：
31.a)将胡椒鲜果冷冻后脱粒，得到胡椒果粒；
32.将所述胡椒果粒加入液氮研磨，得到破碎的果粒；
33.b)将所述破碎的果粒与缓冲溶液和果胶酶混合进行酶解，得到酶解液；
34.将所述酶解液离心，得到酶解残余物；
35.c)将所述酶解残余物与缓冲溶液和淀粉酶混合进行酶解，得到酶处理后的残余物；
36.d)将酶处理后的残余物与乙醇溶液混合，进行加热回流提取，得到回流提取液；
37.e)将所述回流提取液过滤，得到胡椒碱提取液。
38.本发明首先剔除胡椒叶片、小果、病虫害果等，选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原料，经清水清洗后沥干，进行冷冻。其中，冷冻的温度为-60～-80℃，优选为-60、-65、-70、-75、-80，或-60～-80℃之间的任意值，所述冷冻的时间为2h以上，优选为2、3、4、5、6，或2小时以上的时间的任意值。
39.将冷冻后的胡椒进行脱粒，本发明对所述脱粒的方法并没有特殊限制，本领域技
术人员公知的脱粒方法即可。在本发明中，可以采用手工脱粒。
40.脱粒完成后，得到胡椒果粒。然后向胡椒果粒中加入液氮进行研磨，至无明显颗粒物，得到破碎的果粒。
41.将破碎的果粒与缓冲溶液和果胶酶混合进行酶解，得到酶解液。所述缓冲溶液选自柠檬酸-柠檬酸钠水溶液或乙酸-乙酸钠水溶液，所述缓冲溶液的ph为3～5，优选为4、4.5、5，或3～5之间的任意值；
42.所述破碎的果粒、缓冲溶液与果胶酶的质量比为1：(5～10)：(0.01～0.2)，优选为1:5:0.04、1:10:0.1，或1：(5～10)：(0.01～0.2)之间的任意值。
43.其中，所述果胶酶的酶活为1000u/g以上。
44.所述酶解的温度为35～50℃，优选为35、40、45、50，或35～50℃之间的任意值，时间为0.5～2h，优选为0.5、1、1.5、2，或0.5～2h之间的任意值。
45.接着，将所述酶解液离心，得到酶解残余物。
46.将所述酶解残余物与缓冲溶液和淀粉酶(酶活2000u/g以上)混合进行酶解，得到酶处理后的残余物。
47.所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液，优选为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，用氢氧化钠等调节ph值，所述缓冲溶液的ph为5～7，优选为5、5.5、6、6.5、7，或5～7之间的任意值；
48.所述酶解残余物、缓冲溶液和淀粉酶的质量比为1：(5～10)：(0.02～0.2)，优选为1:5:0.02、1:5:0.03，或1：(5～10)：(0.02～0.2)之间的任意值。
49.所述酶解的温度为50～60℃，优选为52、55、57、60，或50～60℃之间的任意值，时间为0.5～3h，优选为0.5、1、2、3，或0.5～3h之间的任意值。
50.将酶处理后的残余物与乙醇溶液混合，进行加热回流提取，得到回流提取液；
51.所述乙醇溶液的体积浓度为80％～100％，优选为80％、90％、100％，或80％～100％之间的任意值；
52.酶处理后的残余物与乙醇溶液的质量比为2～10：(40～80)，优选为1:40、1:30、1:20、1:10、1:4，或2～10：(40～80)之间的任意值。
53.所述回流提取的温度为70～90℃，优选为70、80、90，或70～90℃之间的任意值，时间为0.5～3h，优选为0.5、1、2、3，或0.5～3h之间的任意值。
54.最后，所述回流提取液过滤，得到胡椒碱提取液。
55.将回流提取液用定性滤纸过滤，并用体积浓度为80％～100％的乙醇溶液润洗残余物，定容得到胡椒碱提取液。
56.在本发明中，还提供了一种胡椒油树脂由上述提取方法提取得到的胡椒碱提取液浓缩得到。
57.本发明提供的提取方法适用于胡椒鲜果中胡椒碱的提取，能安全高效最大限度提取胡椒鲜果中的胡椒碱，提取液既可用于高效液相色谱仪分析检测胡椒碱含量，亦可用于胡椒油树脂的制备。本发明提供的提取方法安全、卫生、高效。
58.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的胡椒鲜果中胡椒碱的提取方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
59.实施例1
60.(1)胡椒鲜果的挑选选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原料，经清水清洗后沥干放入低温冷冻箱中-60℃冷冻4h以上；
61.(2)研磨将冷冻后的胡椒手工脱粒后称取1份果粒，迅速将液氮加入到该果粒表面研磨至无明显颗粒物；
62.(3)酶处理研磨处理完后用5份ph值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液转移至容器中，添加0.04份果胶酶，酶活为1000u/g，水浴加热，温度控制在50℃，处理时间为1h，离心后向酶解残余物加入5份ph值为6磷酸缓冲溶液，同时加入0.02份淀粉酶，酶活为2000u/g，60℃水浴加热0.5h；
63.(4)热回流提取将酶处理后的残余物用70份100％乙醇，采用热回流法进行回流提取2小时，提取温度控制在85℃，冷凝管接冷却循环泵，控制冷凝温度8℃；
64.(5)冷却过滤将回流提取液用定性滤纸过滤，并用20份100％乙醇润洗4次残余物，并定容得到胡椒碱提取液。
65.实施例2
66.(1)胡椒鲜果的挑选选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原料，经清水清洗后沥干放入低温冷冻箱中-80℃冷冻4h以上；
67.(2)研磨将冷冻后的胡椒手工脱粒后称取1份果粒，迅速将液氮加入到该果粒表面，并研磨至无明显颗粒物；
68.(3)酶处理研磨处理完后迅速用10份ph值为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液转移至容器中，添加0.1份果胶酶，酶活为1000u/g，水浴加热，温度控制在45℃，处理时间为0.2h，离心后酶解残余物加入5份ph值为6.5磷酸缓冲溶液，同时加入0.03份淀粉酶，酶活为2000u/g，60℃水浴加热0.5h；
69.(4)热回流提取将酶处理后的残余物转移至烧瓶中，并加入80份95％乙醇溶液，采用热回流法进行回流提取3h，提取温度控制在75℃，冷凝管接冷却循环泵，控制冷凝温度8℃；
70.(5)冷却过滤将回流提取液用定性滤纸过滤，并用5份95％乙醇分3次润洗残余物，收集滤液并定容得到胡椒碱提取液。
71.对比例1
72.(1)胡椒鲜果的挑选选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原料，经清水清洗后沥干待提取；
73.(2)研磨用研钵或组织捣碎机快速破碎处理1份胡椒鲜果，同时加入5份提取溶剂95％乙醇水溶液，并研磨至无明显颗粒物；
74.(3)热回流提取将研磨处理后的样品用50份95％乙醇水溶液分3次润洗，并将润洗液一并转入烧瓶中，采用热回流法进行回流提取3h，提取温度控制在80℃，烧瓶上装冷凝管，接口处为磨砂玻璃，适当涂点凡士林密封，冷凝管接冷却循环泵，控制冷凝温度8℃以下；
75.(4)冷却过滤将回流提取液用定性滤纸过滤，并用50份95％乙醇分4次润洗残余物，收集滤液并定容得到胡椒碱提取液。
76.对比例2
77.(1)胡椒鲜果的挑选选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原
料，经清水清洗后沥干待提取；
78.(2)研磨用研钵或组织捣碎机，加入5份提取溶剂95％乙醇水溶液，快速破碎处理1份胡椒鲜果，并研磨至无明显颗粒物；
79.(3)酶处理研磨处理完后迅速用10份ph值为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液转移至容器中，添加0.05份果胶酶，酶活为1000u/g，水浴加热，温度控制在45℃，处理时间为0.5h，离心后酶解残余物加入5份ph值为6.5缓冲溶液，同时加入0.02份淀粉酶，酶活为2000u/g，60℃水浴加热0.5h；
80.(4)超声波提取将酶处理后的残余物用45份95％乙醇水溶液分3次以上润洗，并将润洗液一并转入烧瓶中，采用超声波进行提取30min，提取温度控制在50～60℃；
81.(4)冷却过滤将超声波提取液用定性滤纸过滤，并用50份95％乙醇分4次润洗残余物，收集滤液并定容得到胡椒碱提取液。
82.对比例3
83.(1)胡椒鲜果的挑选选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原料，经清水清洗后沥干待提取；
84.(2)研磨用研钵或组织捣碎机，加入5份提取溶剂95％乙醇水溶液，快速破碎处理1份胡椒鲜果，并研磨至无明显颗粒物；
85.(4)微波提取将研磨处理后的样品用30份95％乙醇水溶液分3次润洗，并将润洗液一并转入烧瓶中，采用微波进行提取30min，提取温度控制在70～90℃，功率在200～300w；
86.(4)冷却过滤将微波提取液用定性滤纸过滤，并用50份95％乙醇分4次润洗残余物，收集滤液并定容得到胡椒碱提取液。
87.对比例4
88.(1)黑胡椒(胡椒鲜果晒干至水分含量降至13％以下的果实)选用颗粒饱满的黑胡椒粒为原料；
89.(2)粉碎用粉碎机将其粉碎，用40目筛子过筛处理，取过筛后的胡椒粉；
90.(3)热回流提取取1份粉碎过筛后的黑胡椒粉，加入用50份95％乙醇水溶液至烧瓶中，采用水浴锅加热，烧瓶上装冷凝管，接口处为磨砂玻璃，适当涂点凡士林密封，水浴温度控制在80～90℃，提取时间3h，冷凝管接冷却循环泵，控制冷凝温度8℃；
91.(4)冷却过滤将热回流提取液用定性滤纸过滤，并用50份95％乙醇分4次润洗残余物，收集滤液并定容得到胡椒碱提取液。
92.对比例5
93.(1)胡椒鲜果的挑选选用无病虫害、果实饱满、有一定光泽的胡椒鲜果果粒为原料，经清水清洗后沥干放入低温冷冻箱中-60℃冷冻4h以上；
94.(2)研磨将冷冻后的胡椒手工脱粒后称取1份果粒，迅速将液氮加入到该果粒表面研磨至无明显颗粒物；
95.(3)酶处理研磨处理完后迅速用10份ph值为4.5的缓冲溶液转移至容器中，添加0.3份纤维素酶，酶活为1000u/g，水浴加热，温度控制在50℃，处理时间为0.5h，离心后酶解残余物加入5份ph值为6.5缓冲溶液，同时加入0.05淀粉酶，60℃水浴加热0.5h；
96.(4)超声波提取将酶处理后的残余物用45份95％乙醇水溶液分3次润洗，并将润洗液一并转入烧瓶中，采用超声波进行提取30min，提取温度控制在50～60℃；
97.(4)冷却过滤将超声波提取液用定性滤纸过滤，并用50份95％乙醇分4次润洗残余物，定容得到胡椒碱提取液。
98.对2种实施例和5种对比例所提取的胡椒碱提取液经稀释后用高效液相色谱仪检测其中胡椒碱的含量，并用外标法定量，检测图谱和结果如图1～4和表1所示。图1为胡椒鲜果提取物的液相图谱，图2为胡椒碱标准曲线，图3为胡椒碱标准品的液相图谱，图4为不同实施例和对比例中胡椒碱含量。
99.表1不同实施例和对比例中胡椒碱含量
[0100][0101]
实施例3
[0102]
将实施例1中胡椒碱提取液过滤后再通过旋转蒸发仪脱除溶剂后，经真空干燥，即得胡椒油树脂。该胡椒油树脂整体呈现墨绿色，有一定的流动性，对其中的风味物质组件及含量进行spme-gc-ms分析检测，gc-ms总离子流图见图5，具体组成及含量见表2。
[0103]
表2胡椒油树脂的风味物质组成及含量表
[0104]
[0105]
[0106]
[0107][0108]
由表2可知，胡椒油树脂中β-石竹烯(caryophyllene)相对含量最高，为40.28％，其次是δ-榄香烯(cyclohexene,4-ethenyl-4-methyl-3-(1-methylethenyl)-1-(1-methylethyl)-,(3r-trans))，相对含量为21.19％，(-)-alpha-蒎烯(alfa.-copaene)相对含量为10.85％，这些化合物是胡椒特有的风味物质，β-石竹烯是一种介于的丁香和松脂之间的气味淡黄色油性液体，有温和的丁香香气，榄香烯有辛辣的茴香气味，(-)-alpha-蒎烯是一种水果挥发性物质，这些风味化合物赋予了胡椒鲜果油树脂的特殊风味。
[0109]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。