一种染色体着丝粒探针的制作方法

1.本技术属于分子生物学领域，具体涉及一种人染色体着丝粒探针。


背景技术：

2.染色体异常与许多疾病的发生有密切联系。在许多情况下，染色体拷贝数也是一些疾病非手术治疗患者的良好预后指标。
3.如17号染色体多体是乳腺癌常见的遗传畸变，是增加her2拷贝数的另一种机制。荧光原位杂交法(fish)是检测her2基因状态的金标准，通过分析her2基因与17号染色体着丝粒(cep17)的信号数及her2/cep17比值来进行结果判读。研究证实，明显的“多倍体”(cep17增加)通常与局灶性中心点增加有关，而不是真正的多倍体，当her2基因与cep17共扩增时，确定her2状态也可能是复杂的，因此准确判断17号染色体的拷贝数非常关键。her2状态的准确评估，对临床指导单克隆抗体靶向用药，如(赫赛汀，曲妥珠单抗)，从而降低复发和死亡风险至关重要。另外，her2/cep17比值》2也是胃癌her2基因扩增的标志，对患者预后和治疗的具有重要临床价值。染色体拷贝数不稳定(cin)是一种对细胞生物学产生多重效应的基因组不稳定性，是细胞群体遗传异质性的来源。cin导致染色体拷贝数的细胞间变异，荧光原位杂交(fish)可以检测和定量。极端cin-17在四分之一以上的胃食管腺癌中被检出，是非手术治疗患者良好的预后指标。
4.已经公开了确定8p21-22基因座的丢失、8号染色体的增加和c-myc拷贝数相对于着丝粒拷贝数的额外增加是一种预测前列腺癌的方法(美国专利号6,613,510)。
5.有报道表明，12号染色体三体和不典型的形态学及免疫表型特征之间有明显的相关性，还与淋巴细胞增殖活性高、分期级别高及预后有关系。12号染色体三体是慢性淋巴细胞白血病中常见的染色体异常现象，12号染色体三体的慢性淋巴细胞白血病具有临床及生物学上的特殊性，如早期出现淋巴结及器官的浸润，并可转化为幼稚淋巴细胞白血病或其它侵袭性淋巴瘤(richter’s综合症)，研究认为存在12号染色体三体的患者预后普遍较差。
6.x染色体是人类的性染色体，x性染色体的数目异常会使人产生性染色体病，性染色体病会使人性腺发育不全或两性畸形。如klinefelter综合征、多x综合征、turner综合征等等。
7.荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。fish的基本原理是用已知的标记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于dna分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
8.杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星iii类的探针，其杂交靶位常大于1mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3)特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
9.传统的染色体着丝粒探针一般是标记包含重复序列的α卫星dna，通常为几百个碱基，由于序列特异性较低，实际杂交中容易出现非特异性信号，背景高，导致杂交效果较差，严重的甚至影响判读。近年来，随着合成生物学的发展，寡核苷酸探针已经广泛用于荧光原位杂交，其一般采用数量较多的几十个碱基大小的非重复序列来标记特定位点。但染色体着丝粒含大量重复序列，不适用于制备去重复序列的较短的寡核苷酸探针。


技术实现要素：

10.一方面，本技术提供了一种用于荧光原位杂交检测人染色体着丝粒的探针，所述探针序列长度为40-90nt，所述探针序列对应于目标染色体着丝粒区域的拷贝数≥200。
11.在一些实施方案中，所述探针经fish验证未出现非特异性信号。
12.在一些实施方案中，所述目标染色体的靶区域为目标染色体的序列区域或目标染色体的着丝粒区域。
13.在一些实施方案中，所述探针序列对应于非靶区域的匹配数≤10；在一些实施方案中，所述的非靶区域的匹配数是blat中的查询匹配数；在一些实施方案中，所述探针的靶区域匹配分值≥10000；在一些实施方案中，所述的探针为检测染色体着丝粒拷贝数的探针；在一些实施方案中，所述的探针为dna探针和/或rna探针；在一些实施方案中，所述探针序列对应于目标染色体着丝粒区域的拷贝数为200-6000；优选为200-5000。
14.一方面，本技术提供了一种染色体着丝粒探针组，包括一条或多条所述的染色体着丝粒探针，各条探针间tm值差异≤10℃，各条探针序列长度相差≤10nt；在一些实施方案中，所述的探针为dna探针和/或rna探针。
15.一方面，本技术提供了一种用于检测17号染色体着丝粒的探针，包含如seq id no：16所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt。
16.如本文所用，dna探针的序列“对应的rna序列”，是指与dna序列相同，而将脱氧核糖核苷酸替换成相应的核糖核苷酸而得到的rna序列；在碱基层面上，a、g、c保持与dna一致，在rna序列中，碱基t替换成u。包含本技术序列表所示的dna序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列的探针，均在本技术的保护范围中。
17.在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：1-23任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
18.一方面，本技术提供了一种人7号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：24-29任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：24-29任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
19.一方面，本技术提供了一种人10号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：30-40任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：30-40任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
20.一方面，本技术提供了一种人18号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：41-46任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：41-46任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
21.一方面，本技术提供了一种人x染色体着丝粒探针，包含如seq id no：47-59任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：47-59任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
22.一方面，本技术提供了一种人6号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：60-64任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：60-64任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
23.一方面，本技术提供了一种人8号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：65-74任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：65-74任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
24.一方面，本技术提供了一种人11号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：75-78任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：75-78任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
25.一方面，本技术提供了一种人12号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：79-85任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：79-85任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
26.一方面，本技术提供了一种人16号染色体着丝粒探针，包含如seq id no：86-87任一所示的序列、其互补序列和/或它们对应的rna序列，长度为40-90nt；在一些实施方案中，所述探针的序列如seq id no：86-87任意一条和/或它们对应的rna序列所示。
27.在一些实施方案中，所述探针的长度为45-85nt；在一些实施方案中，所述探针的长度为45-80nt；在一些实施方案中，所述探针的长度为45-75nt；在一些实施方案中，所述探针的长度为48-55nt；优选地，所述探针的长度为50-55nt。
28.一方面，本技术提供了一种筛选检测人染色体着丝粒探针模板序列或探针序列的方法，包括以下步骤：
29.s1.获取多条初始备选序列组成初始序列库：
30.从目标染色体的α卫星序列中，获取多条长度为40-90nt的序列片段，成为初始备选序列库；
31.s2.获取中期备选序列：
32.对步骤s1获得的多条初始备选序列在人类基因组数据库中进行查询比对；在对某条初始备选序列进行查询比对时，以该初始备选序列为查询基准序列，获得该查询基准序列在人类基因组数据库中的匹配对象，确定匹配对象分布在靶区域的匹配数a及分布在非靶区域的匹配数b，当b和a的相对量小于等于预设比例时，其对应的初始备选序列被确定为中期备选序列；
33.s3.获取一条或多条探针模板序列或探针序列：对中期备选序列进行参数筛选，所述参数符合预设条件的，其对应的中期备选序列被确定为探针模板序列或探针序列。
34.在一些实施方案中，所述步骤s1，是从目标染色体的α卫星序列中，通过1～10nt/位移的方式进行截取，获得至少一条长度为40-90nt的序列片段；优选通过1～5nt/位移的
方式进行截取；更优选通过1nt/位移的方式进行截取。
35.在一些实施方案中，设定序列片段长度为45-85nt；在一些实施方案中，设定序列片段长度为45-80nt；在一些实施方案中，设定序列片段长度为45-75nt；在一些实施方案中，设定序列片段长度为48-55nt；在一些实施方案中，设定序列片段长度为50-55nt。
36.在一些实施方案中，对于所获取的序列片段完全相同的，只保留一条。
37.在一些实施方案中，所述步骤s2中，匹配对象的匹配条件是：与查询基准序列的一致性i或相似性s大于等于预设的一致性阈值it或相似性阈值st。
38.在一些实施方案中，所述步骤s2中的所述一致性或相似性的预设的一致性阈值it或相似性阈值st的选取范围为70％～95％。
39.在一些实施方案中，当以blat为工具查询匹配对象时，所述的一致性的阈值it为70％；并且在一些实施方案中，score≥20。
40.在一些实施方案中，步骤s2所述靶区域为目标染色体的序列区域。
41.在一些实施方案中，所述靶区域为目标染色体的着丝粒区域；在一些实施方案中，所述非靶区域为除了所述靶区域外的其他区域；在一些实施方案中，所述非靶区域包括非目标染色体的序列区域；在一些实施方案中，所述非靶区域还包括目标染色体的非着丝粒序列区域。
42.在一些实施方案中，所述b和a的相对量的预设比例为7:8；优选3:4；更优选5:8；还更优选1:2。
43.在一些实施方案中，所述匹配数a、b满足a≥16且b≤14；在一些实施方案中，a≥16且b≤12；在一些实施方案中，a≥16且b≤10；在一些实施方案中，a≥16且b≤8；在一些实施方案中，a≥16且b≤6；在一些实施方案中，a≥16且b≤4。
44.作为一种优选的实施方式，可以使用blat工具进行b和a的相对量的获取。此时的运算效率更高。
45.在一些实施方案中，以blat工具进行查询时，所述匹配数为匹配结果数matches。
46.在一些实施方案中，所述的步骤s3中，所述参数选自中期备选序列在靶区域的拷贝数；当所述拷贝数大于等于预设拷贝数的，其对应的中期备选序列被确定为探针模板序列或探针序列；
47.在一些实施方案中，所述的预设拷贝数为200～4000；优选为200～1000；在一些实施方案中，所述步骤s3中的参数筛选，还包括以下参数中的一种或多种：tm值、靶区域的匹配分值、序列长度、非靶匹配数；在一些实施方案中，在对中期备选序列进行参数筛选前，还包括将多条中期备选序列进行聚类分析的步骤。
48.在后续的fish实验验证中，发明人发现，参数选取拷贝数200或以上，是较为优选作为优先考虑的因素。同一区域的常规的荧光信号分子在达到200或以上，在常规荧光显微镜下fish信号能更好地显现。
49.在一些实施方案中，所述步骤s3的步骤包括：
50.对中期备选序列进行聚类分析，将序列间有连续20个或以上碱基相同的中期备选序列归为一组；获取各条中期备选序列的参数，所述参数为靶区域的拷贝数；将获取的各条中期备选序列的参数进行分析，按照靶区域的拷贝数高的原则从聚类分析得到的每组中期备选序列中选出各1条序列；并且，所述的从每组中期备选序列中所选出的各1条序列，符合
靶区域的拷贝数≥200的条件。
51.在一些实施方案中，所述参数还包括以下的一种或多种：tm值、靶区域的匹配分值、序列长度、非靶匹配数；当在每组中期备选序列中作选取时，以如下原则作选取：tm值越高，和/或靶区域的匹配分值越高，和/或非靶匹配数越小，则优先选取。
52.在一些实施方案中，所述靶区域的匹配分值≥10000；在一些实施方案中，当聚类得到的组超过一组时，不同组选出的各条序列间tm值差异≤10℃，不同组选出的各条序列长度相差≤10nt；在一些实施方案中，当以blast工具获取匹配分值时，所述匹配分值为total score值。
53.一方面，本技术提供了一种验证/确定所述的方法所获得的探针模板序列或探针序列的方法，将所述的方法所获得的探针模板序列或探针序列进行验证。
54.在一些实施方案中，所述的验证方法为fish。
55.在一些实施方案中，在验证前对所述探针模板序列或探针序列进行荧光标记；在一些实施方案中，在探针序列的5’端、3’端或中间的任意碱基标记1个或多个荧光基团；在一些实施方案中，所述荧光基团选自alexa fluor，德克萨斯红(texasred)，香豆素，荧光素(fitc)，四甲基异硫氰酸罗丹明(tritc)，羧基四甲基罗丹明(tamra)，cy3，cy3.5，cy5，cy7，platinumbright，pacific green，oregon green，pacific blue，pacific orange，6-羧基荧光素(6-fam)，2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(joe)，四氯-6-羧基荧光素(tet)，六氯-6-甲基荧光素(hex)，羧基-x-罗丹明(rox)和atto系列荧光基团中的至少一种。
56.一方面，本技术提供了一种设计探针的方法，包括以下步骤：
57.1)如所述的方法获得一条或多条探针模板序列或探针序列；
58.2)如所述的方法验证步骤1)获得的一条或多条探针模板序列或探针序列或它们的互补序列。
59.一方面，本技术提供了一种合成探针的方法，包括以下步骤：
60.1)如所述的方法获得一条或多条探针模板序列或探针序列；
61.2)如所述的方法验证步骤1)获得的一条或多条探针模板序列或探针序列；
62.3)根据步骤2)获得的验证后的一条或多条探针模板序列或探针序列或它们的互补序列，进行合成。
63.一方面，本技术提供了一种筛选人染色体着丝粒探针模板序列或探针序列的方法，包括以下步骤：
64.向序列比对服务器发送多条序列查询请求，各所述序列查询请求分别携带有一条初始备选序列，所述初始备选序列为从目标染色体的α卫星序列中获取的长度为40-90nt的序列片段；
65.获取所述序列比对服务器服务器返回的各所述初始备选序列对应的各匹配对象；
66.获取各所述匹配对象的第一匹配数和第二匹配数，所述第一匹配数据为对应的匹配对象分布在靶区域的匹配数，所述第二匹配数为对应的匹配对象分布在非靶区域的匹配数；
67.当任意一所述匹配对象的所述第二匹配数和所述第一匹配数的相对量小于预设比例时，将所述任意一所述匹配对象对应的初始备选序列被确定为中期备选序列；
68.对各所述中期备选序列进行参数筛选，将参数符合预设条件的中期备选序列确定
为探针模板序列或探针序列。
69.一方面，本技术提供了一种筛选人染色体着丝粒探针模板序列或探针序列的装置，所述装置包括：
70.请求发送模块，用于向序列比对服务器发送多条序列查询请求，各所述序列查询请求分别携带有一条初始备选序列，所述初始备选序列为从目标染色体的α卫星序列中获取的长度为40-90nt的序列片段；
71.对象获取模块，用于获取所述序列比对服务器返回的各所述初始备选序列对应的各匹配对象；
72.匹配数获取模块，用于获取各所述匹配对象的第一匹配数和第二匹配数，所述第一匹配数据为对应的匹配对象在靶区域的匹配数，所述第二匹配数为对应的匹配对象在非靶区域的匹配数；
73.序列筛选模块，用于当任意一所述匹配对象的所述第二匹配数和所述第一匹配数的相对量小于预设比例时，将所述任意一所述匹配对象对应的初始备选序列被确定为中期备选序列；
74.探针获取模块，用于对各所述中期备选序列进行参数筛选，将参数符合预设条件的中期备选序列确定为探针模板序列或探针序列。
75.一方面，本技术提供了一种由如所述的方法获得的探针。
76.一方面，本技术提供了一种染色体着丝粒探针，所述探针的长度为40-90nt，所述探针的序列对应于目标染色体靶区域的拷贝数≥200；在一些实施方案中，所述探针的序列对应于目标染色体着丝粒靶区域的拷贝数≥200；在一些实施方案中，所述探针的靶区域匹配分值≥10000。
77.一方面，本技术提供了一种染色体着丝粒探针组，包括一条或多条所述的染色体着丝粒探针，各条探针间tm值差异≤10℃，各条探针序列长度相差≤10nt。
78.在一些实施方案中，所述目标染色体选自1-22号，x，和y染色体中的一条或多条；在一些实施方案中，所述目标染色体选自6、7、8、10、11、12、16、17、18、x染色体中的一条或多条。
79.在一些实施方案中，本技术提供了所述的探针或所述的方法筛选的序列在检测染色体拷贝数异常疾病中的应用；在一些实施方案中，所述疾病包括21三体综合征、13三体综合征、18三体综合征、klinefelter综合征、turner综合征、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、获得性囊性肾病、肾乳头状癌、髓母细胞瘤中的至少一种。
80.在一些实施方案中，本技术提供了所述的方法筛选的序列，作为对照探针，可以与疾病基因的特异(lsi)fish探针一同使用。包括cep17/her2基因检测探针可特异检测位于17号染色体的her2基因的异常扩增，cep7/c-met基因检测探针可特异检测位于7号染色体的c-met基因的异常扩增，cep7/egfr基因检测探针可特异检测位于7号染色体的egfr基因的异常扩增，cep17/p53可特异检测位于17号染色体的p53基因的缺失或扩增。
81.在一些实施方案中，本技术提供了所述的方法筛选的序列在crispr/talen基因组编辑实验中鉴定目的染色体的拷贝数中的应用。
[0082]“染色体”：是真核细胞在有丝分裂或减数分裂时dna存在的特定形式，由染色质丝螺旋缠绕，逐渐缩短变粗形成。
[0083]“着丝粒”：是指中期染色体的两条姐妹染色单体的连接处，位于染色体的主缢痕处，着丝粒将两条染色单体分为短臂(p)和长臂(q)，由高度重复的异染色质组成，其主要成分为dna和蛋白质。
[0084]“α卫星序列”：是一种包括人在内的灵长类每条染色体着丝粒区的串联重复序列，并存在着等级结构，其最小重复单位是171bp，它既有染色体特异性，又具有染色体间的同源性。不同染色体着丝粒的α卫星dna序列存在差别，构成了一个家族。
[0085]“荧光探针”：即核酸探针，是一段带有荧光标记，且顺序已知的，与目的序列互补的核酸序列(dna或rna)，通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从基因组中把目的序列显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：
①
应是单链，若为双链，必须先行变性处理。
②
应带有容易被检测的荧光标记。
[0086]“荧光原位杂交”：fluorescence in situ hybridization，简称fish，是将直接或间接标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交，经洗涤后直接在荧光显微镜下观察，对特定基因或核酸序列进行定位、定性、或定量的技术。
[0087]“tm值”：melting temperature，是指吸光值增加到最大值的一半时的温度，是一段序列的解链温度或熔点。
[0088]“一致性(identity)”是具体比对序列的简单一致程度，不考虑比对序列的起源和功能。
[0089]“相似度(similarity)”：比较的序列间含相同或相似碱基的数量及比例；是比对序列功能或特点的趋同程度，不考虑序列的具体起源。
[0090]
在一些情况下，“相似度”的程度可以由“一致性”进行体现和判断。
[0091]
在一些实施方案中，本技术涉及的术语包括以下定义：
[0092]“初始备选序列”：从目标染色体的α卫星序列中，通过1～10nt/位移的方式按特定序列长度进行截取的去除完全相同的序列。
[0093]“查询基准序列”：在进行基因组序列相似性比较分析时，输入的原始序列。
[0094]“匹配对象”：查询基准序列通过基因组序列相似性比较分析(例如blat)得到的与基准序列相似度高的匹配对象；
[0095]“中期备选序列”：对初始备选序列进一步筛选得到的满足非靶匹配数低于一定值或比例的序列。
[0096]“靶匹配数”：查询基准序列在进行基因组序列相似性比较分析(例如blat)中目标染色体着丝粒序列区域的匹配对象数(在blat中为匹配结果数matches或hits)。
[0097]“非靶匹配数”：查询基准序列在进行基因组序列相似性比较分析(例如blat)中非目标染色体的序列区域和/或目标染色体的非着丝粒序列区域的匹配对象数(在blat中为匹配结果数matches或hits)。
[0098]“拷贝数”：即重复次数，指序列在基因组中的重复次数，对应为查询基准序列在靶区域的匹配数；在一些实施例中，具体是指序列在blast工具查询得到的在靶区域的number of matches参数值。
[0099]“匹配分值”：当用blast进行查询时，是该备选序列在blast工具查询得到的在靶区域的total score值。
[0100]“序列长度”：是指该备选序列的碱基数。
[0101]“聚类分析”：即多序列比对，通过多个类似长度的生物序列的比对，分析不同的序列间的相似程度或一致性；常用软件有clustal omega、emboss cons、kalign、kalign、mafft、muscle、mview、t-coffee、webprank等。
[0102]“中期fish”：是在秋水仙碱处理后，染色体停滞在细胞分裂中期的细胞上进行的荧光原位杂交。
[0103]“间期fish”：是在处于细胞分裂间期的细胞上进行的荧光原位杂交。镜下观察，对特定基因或核酸序列进行定位、定性、或定量的技术。
[0104]
α-卫星dna(alpha satellite dna)是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着丝粒dna(centromere dna，cen-dna)家族，由171bp的单体为单位组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝粒dna区域，其中大部分序列高度保守，但是在每条染色体上，其保守序列仍具有一定的差异性(willard hf，chromosome-specific organization of human alpha satellite dna.am j hum genet.1985，37(3)：524-532)。
[0105]“染色体计数探针(cep)”或“着丝粒探针”是使得细胞中特定染色体的数目被计数的任何探针。染色体计数探针通常识别并结合特定染色体的着丝粒附近(称为“着丝粒周围”)或着丝粒处的区域，通常是重复dna序列(例如，α卫星dna)。染色体的着丝粒通常被认为代表该染色体，因为着丝粒是细胞分裂过程中可靠分离(faithful segregation)所需的。可以通过比较对应于特定基因座的信号数(拷贝数)与对应于着丝粒的信号数，而将特定染色体区域的缺失或扩增，与其通常存在于其内的整个染色体(异倍体)的丢失或增加，相区别。一种用于进行这种比较的方法是将代表基因座的信号数除以代表着丝粒的信号数。小于一的比率表明该基因座的相对丢失或缺失，并且大于一的比率表明该基因座的相对增加或扩增。类似地，比较可以在相同染色体上的两个不同基因座、例如染色体的两个不同臂上进行，以表明染色体内的不平衡增加或丢失。代替染色体的着丝粒探针，本领域技术人员将认识到染色体臂探针可以替代地用于接近于全染色体缺失或增加。然而，此类探针在计数染色体时是不准确的，因为对于此类探针的信号损失并不总是表明整个染色体的丢失。
[0106]
如本文所使用的术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合。当在两个或多个项目的列表中使用时，术语“和/或”表示所列出的项目中的任何一个可以单独使用，或者可以使用两个或多个所列出的项目的任何组合。例如，如果组合物，组合，构造等被描述为包括(或包含)组分a，b，c和/或d，则该组合物可以单独包含a；单独包含b；单独包含c；单独包含d；包含a和b的组合；包含a和c的组合；包含a和d的组合；包含b和c的组合；包含b和d的组合；包含c和d的组合；包含a，b和c的组合；包含a，b和d组合；包含a，c和d的组合；包含b，c和d组合；或a，b，c和d组合使用。
附图说明
[0107]
图1为中期备选序列库的综合参数筛选流程图；
[0108]
图2为实施例3中17号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0109]
图3为实施例3中cep17探针检测hek293细胞中期fish结果代表性图像(a、b、c、d代表特异性的cep17信号点)；
[0110]
图4为实施例3中cep17探针检测hek293、sv-huc-1、mcf-7、a549四种不同细胞的细胞间期fish结果代表性图像；
[0111]
图5为实施例3中40倍物镜下mcf-7细胞间期fish图；
[0112]
图6为实施例3中单探针chr17-03与cep17的fish信号对比结果；
[0113]
图7为实施例4中本技术的cep17探针与商业探针的fish结果对比图；
[0114]
图8为实施例5中cep17探针在组织切片样本中验证fish图；
[0115]
图9为实施例6中不同长度的cep17探针在mda-mb-231细胞的验证fish图(图中的每一幅小图表示只验证具有相关长度的1条探针的结果)；
[0116]
图10-15为实施例7中7号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0117]
图11-12为实施例7中10号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0118]
图13为实施例7中18号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0119]
图14-15为实施例7中x染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0120]
图16为实施例8中6号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0121]
图17-18为实施例8中8号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0122]
图19为实施例8中11号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0123]
图20为实施例8中12号染色体待验证序列的探针特异性验证结果；
[0124]
图21为实施例8中16号染色体待验证序列的探针特异性验证结果。
具体实施方式
[0125]
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0126]
实施例1 17号染色体着丝粒探针的设计
[0127]
1)将人类基因组17号染色体所有α卫星序列，逐个碱基位移(1nt/位移)分割成50或51nt长度的序列，完全相同序列只保留一个，组成初始备选序列库。
[0128]
2)运用ucsc网站的blat工具对这些序列进行批量查询，得到符合“score≥20且identity≥70％”条件的匹配对象，进一步筛选这些匹配对象在17号染色体着丝粒区域(靶区域)的匹配对象数(靶匹配数)≥16且非靶匹配数≤12(非靶区域为非17号染色体着丝粒区域之外的其它区域)的初始备选序列，作为17号染色体中期备选序列库；
[0129]
3)对17号染色体中期备选序列库进行综合参数筛选：首先获取中期备选序列参数信息，得到包括tm值、拷贝数、序列长度、匹配分值、非靶匹配数等参数，选择拷贝数大于等于200的序列，再对所有中期备选序列进行聚类分析，按照“序列间有连续20个或以上碱基相同”的条件归为一组；按照拷贝数越高，非靶匹配数越小，tm值越高，匹配分值越高的排序从每组序列中选择一条序列；得到多条相对独特的待验证的序列组合，其综合参数如表1，序列如表2所示。
[0130]
表1 17号染色体待验证序列的综合参数
[0131][0132]
表2 17号染色体待验证序列
[0133][0134]
实施例2用于fish验证探针特异性的细胞玻片样本制备
[0135]
以mda-mb-231细胞玻片样本的制备为例，本发明涉及其它细胞系的细胞滴片的制备方法与之基本一致。
[0136]
1)当培养的mda-mb-231细胞贴壁生长面积达80％～90％时，若是制备中期细胞玻片，则往t75培养瓶中分别加入50μl 10mg/ml秋水酰胺(thermofisher，货号:15212012)溶液，轻轻混匀，37℃继续培养2～4小时；若是制备间期细胞玻片则直接开始下一步；
[0137]
2)弃去上清，分别加入5ml 1xpbs润洗瓶底，吸去pbs，加入2ml 0.25％trypsin-edta溶液(thermofisher，货号:25200056)，37℃孵育3～5min直至贴壁细胞脱落，加入5ml含10％fbs的rpmi-1640培养基(thermofisher，货号:61870036)，吹洗瓶底，将细胞悬液分
别转移到一个15ml离心管中，1000rpm离心4min，弃去上清，得到细胞沉淀；
[0138]
3)往收获的细胞沉淀中，加入8ml 37℃预热的0.075m kcl低渗液，充分混匀，在37℃水浴箱中孵育15分钟；
[0139]
4)加入2ml新鲜的固定液(甲醇:冰乙酸＝3:1)充分混匀，以1800rpm，离心5min；
[0140]
5)弃上清，加入8～10ml固定液重悬细胞，1800rpm，离心5min，重复固定2次；
[0141]
6)弃去上清液，加入适量的固定液重悬细胞，将细胞悬液均匀的滴落在干净的载玻片上，放入60℃烤箱中烘烤1小时；
[0142]
7)将玻片浸入2xssc中，洗涤2次各3min，再依次用70％、85％、100％乙醇各洗涤2min，风干玻片，-20℃保存或进行下一步杂交实验。
[0143]
实施例3 17号染色体待验证序列的探针特异性验证
[0144]
1)将实施例1中的所有待验证的序列分别进行寡核苷酸合成并在5’端和3’端修饰标记alexa fluor 488荧光基团(绿色)或texas red荧光基团(红色)得到荧光探针，将每条探针稀释到2μm浓度，与杂交缓冲液(10％甲酰胺、20％硫酸葡聚糖、0.3m氯化钠、0.03m柠檬酸钠)以1:9比例混合用于fish；
[0145]
2)对实施例1所获得的探针分别进行fish性能验证，取实施例2中的细胞玻片样本，遵照常规方法优化探针浓度、杂交缓冲液组分、杂交温度、洗涤温度和杂交时间等实验条件，分析每条候选探针杂交结果，筛选在85℃变性5min，42℃杂交1h条件下特异性较好且信号强度较高的探针；结果如表3，其代表性结果如图2所示，结果可见在所有待验证探针中，有6条探针特异性较好，2条探针特异性一般，2条探针特异性较差。对于出现理论上序列特异性很高，但实际验证后的探针特异性较差的情况，可能由于染色体着丝粒区域序列的复杂性，已知人类基因组的着丝粒区域序列并不完善。
[0146]
表3 17号染色体待验证序列的fish探针特异性验证
[0147][0148]
注：“af488”表示alexa fluor 488荧光基团；“tred”表示texas red荧光基团；“3g”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有3个绿色信号；特异性评价等级划分：“ ”表示高倍镜下几乎所有细胞均无肉眼可见非特异性信号，“ ”表示高倍镜下可能部分细胞有微弱的非特异性信号，并且当进行常规优化杂交条件去除(如提高杂交温度或提高杂交后洗涤温度和增加洗涤时间等)；“ ”表示目标染色体
出现信号的同时，高倍镜下还可见很明显的非特异性信号。
[0149]
3)从步骤2)中探针验证结果可见单条探针信号较弱，为了增强荧光信号强度，一方面可以将多条经验证的特异性较好探针混合使用，一方面可以在合成时增加单条探针的荧光标记数量。本发明对同其中5条特异性较好的序列(chr17-01、chr17-02、chr17-03、chr17-05、chr17-06)的及其互补序列(chr17-01v、chr17-02v、chr17-03v、chr17-05v、chr17-06v)分别进行人工合成并在5’端、3’端及中间修饰6～7个alexa fluor 488荧光基团，如表4所示；
[0150]
表4 17号染色体特异性探针的增强荧光标记
[0151][0152][0153]
4)将合成的10条新的探针分别用te缓冲液溶解稀释至100μm浓度的储存液，再各取1μl混合后加190μl灭菌纯化水稀释至每条探针0.5μm的工作液，再将此工作液与杂交缓冲液(包含10％甲酰胺，20％硫酸葡聚糖，0.3m氯化钠，0.03m柠檬酸钠)按1:9的比例混合后，得到新的人17号染色体着丝粒探针(cep17)，-20℃避光保存。
[0154]
5)将实施列2制备细胞玻片样本从冰箱取出，晾干，同时将人17号染色体着丝粒探针(cep17)从-20℃冰箱取出室温，轻轻混匀；
[0155]
6)取制备的细胞玻片加入10μl人17号染色体着丝粒探针，加上合适大小的盖玻片盖住检测区域，用封片胶封闭盖玻片四周，防止探针溢出。封片过程若出气泡则将其轻轻挤出，以防影响杂交；
[0156]
7)放入原位杂交仪(雅培s-500)中85℃变性5min，42℃杂交1小时；
[0157]
8)杂交结束后用镊子小心的揭开封片胶，移去盖玻片，将玻片依次浸没在室温的2xssc中洗涤3min，50℃预热的杂交后洗涤缓冲液(0.4
×
ssc/0.1％np-40)中洗涤5min，37℃预热的灭菌纯化水中洗涤2min，暗室直立风干；
[0158]
9)在探针目标区域加入10μl的dapi复染液，盖上盖玻片，静置20min；
[0159]
10)荧光显微镜(nikon eclipse ci-l)下观察和分析结果：分析了4个不同组织来
源的细胞系(hek293、sv-huc-1、mcf-7、a549)样本，无论间期和中期细胞均获得明亮清晰的特异性信号，且背景较低，无非特异性信号杂点；其中图3为hek293细胞中期fish结果代表性图像，可见a、b、c、d对应的17号染色体上均有特异性信号，无非特异性信号；图4为4个细胞系间期fish结果代表性图像，可见信号清晰，背景较低。图5为40倍物镜下mcf-7细胞间期fish照片，各细胞可见清晰信号，说明本发明的cep17信号强度高。同时，组合后的增强探针cep17与原来的(chr17-01、chr17-02、chr17-03、chr17-05、chr17-06)任一单个探针相比，信号强度明显提高，其特异性保持不变(如图6所示，chr17-03与cep17的fish信号对比结果)，也从侧面反映了各个单一探针本身的特异性较好，保证了混合探针仍然具有较低的背景和较强的特异信号。
[0160]
实施例4 17号染色体着丝粒探针与商业探针性能比对验证
[0161]
为了充分验证本发明的17号染色体探针性能，与a公司和b公司的17号染色体探针采用同批次的mda-mb-231细胞样本进行测试，后两者按照其说明书方案进行探针杂交和洗涤。代表性图像如图7所示，可见a公司的探针背景较高，微弱可见非特异性信号，b公司的相对较好，但信号强度较弱，本发明的探针较前两者具有信号强度高，背景较低的优势；而且如果加入新的特异性探针，可以进一步增加荧光强度。
[0162]
实施例5 17号染色体着丝粒探针在石蜡组织样本中验证
[0163]
为了验证本发明的cep17探针在石蜡组织样本中的适应性，选取了3例非小细胞肺癌患者组织切片样本进行验证，按常规方法进行预处理，包括二甲苯脱蜡，硫氰酸钠高温水浴，胃蛋白酶消化等步骤，探针杂交与杂交后洗涤方案参照实施案例3所述，在3例组织切片中均可见清晰的特异性信号，图8为代表性图像，说明本发明的的探针可应用于石蜡组织样本。
[0164]
实施例6不同长度17号染色体着丝粒探针的获取及验证
[0165]
为了验证本发明探针在不同长度的适用性，将人类基因组17号染色体所有α卫星序列，逐个碱基位移分割成不同长度(45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或80nt)的序列，完全相同序列只保留一个。其它步骤与实施例1相同。
[0166]
得到不同长度的候选序列库，选取了一组序列相似度最高的不同长度的序列(皆包含核心序列seq id no:16：
[0167]
agcattcacagaaaactcttggtgacgactgagtttaactcacag)，如表5所示。针对表2中的每一条序列制备5’和3’端标记的荧光探针，在mda-mb-231间期细胞中各自进行fish性能验证，结果如图9所示，结果可见，所验证的这组不同长度的探针，特异性均较好，无明显非特异性信号，说明本发明的染色体着丝粒高特异性序列获取方法能够也适用于其它45～80nt长度的染色体着丝粒特异性探针获取。从结果也可以看到，在相同杂交条件下，长探针(例如：75nt)比短探针(例如：45nt)信号强度较高，原因可能是杂交过程中长探针与靶区域结合更稳定，且能耐受更剧烈的洗涤条件。
[0168]
然而，如表6所示，目标探针序列越长，按照本发明方法筛选得到的候选序列越少，意味着可用探针越少；相对而言，短的探针得到的候选序列越多，实际使用过程中可选择特异性探针数量更多，可以通过多条探针组合获得更好的信号强度。
[0169]
表5不同长度的探针序列
[0170][0171][0172]
表6 17号染色体按不同序列长度可筛选到的中期备选序列信息
[0173][0174]
实施例7用本发明的设计方法在7号、10号、18号、x染色体中验证
[0175]
7.1 7号、10号、18号、x染色体着丝粒探针探针的序列获取
[0176]
为了验证本发明的探针设计方法在其它染色体中的适用性，发明人先后对7号、10号染色体、18号染色体、x染色体按照实施例1中17号染色体着丝粒探针的设计方法先后进行了序列查找、筛选和分析，分别得到了这4条染色体对应的着丝粒探针待验证序列组，如下表7-表8。
[0177]
表7 7号、10号、18号、x染色体的待验证序列的综合参数
[0178]
[0179][0180]
表8 7号、10号、18号、x染色体的待验证序列
[0181]
[0182]
[0183][0184]
7.2 7号、10号、18号、x染色体待验证序列的探针特异性验证
[0185]
将表8的各染色体待验证序列参考实施例3中的方法在mcf7或mda-mb-231细胞玻片样本中进行了探针特异性验证，具体验证步骤同17号染色体。验证结果如表9及图10-图15所示，本发明的方法在7号、10号、18号、x染色体均获得了较好或一般的特异性寡核苷酸探针，说明本发明的染色体着丝粒高特异性探针的制备方法不仅仅适用17号染色体高特异性寡核苷酸的探针获得，也能拓展到其它染色体特异性寡核苷酸探针的获取。
[0186]
表9 7号、10号、18号、x染色体待验证序列的fish探针特异性验证
[0187]
[0188][0189]
注：“af488”表示alexa fluor 488荧光基团；“tred”表示texas red荧光基团；“2g”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有2个绿色信号；“2r”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有2个红色信号；“3r”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有3个红色信号；特异性评价等级划分：“ ”表示高倍镜下几乎所有细胞均无肉眼可见非特异性信号，“ ”表示高倍镜下可能部分细胞有微弱的非特异性信号，并且当进行常规优化杂交条件去除(如提高杂交温度或提高杂交后洗涤温度和增加洗涤时间等)；“ ”表示目标染色体出现信号的同时，高倍镜下还可见很明显的非特异性信号。
[0190]
实施例8用本发明的设计方法在6号、8号、11号、12号、16号染色体中验证
[0191]
8.1 6号、8号、11号、12号、16号染色体着丝粒探针探针的序列获取
[0192]
发明人进一步对6号、8号、11号、12号、16号染色体按照实施例1中17号染色体着丝粒探针的设计方法先后进行了序列查找、筛选和分析，分别得到了这5条染色体对应的着丝粒探针待验证序列组，如下表10-表11。
[0193]
表10 6号、8号、11号、12号、16号染色体的待验证序列的综合参数
[0194]
[0195][0196]
表11 6号、8号、11号、12号、16号染色体的待验证序列
[0197]
[0198][0199]
8.2 6号、8号、11号、12号、16号染色体待验证序列的探针特异性验证
[0200]
将表11的各染色体待验证序列参考实施例3中的方法在mcf7或mda-mb-231细胞玻片样本中进行了探针特异性验证，具体验证步骤同17号染色体。验证结果如表12及图16-图21所示，本发明的方法在6号、8号、11号、12号、16号染色体均获得了较好或一般的特异性寡核苷酸探针，说明本发明的染色体着丝粒高特异性探针的制备方法也能拓展到其它染色体特异性寡核苷酸探针的获取。
[0201]
表12 6号、8号、11号、12号、16号号染色体待验证序列的fish探针特异性验证
[0202][0203]
注：“af488”表示alexa fluor 488荧光基团；“tred”表示texas red荧光基团；“3g”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有3个绿色信号；“2g”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有2个绿色信号；“2r”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有2个红色信号；“3r”表示该细胞目标染色体着丝粒探针的主要fish信号模式，单一细胞核中有3个红色信号；特异性评价等级划分：“ ”表示高倍镜下几乎所有细胞均无肉眼可见非特异
性信号，“ ”表示高倍镜下可能部分细胞有微弱的非特异性信号，并且当进行常规优化杂交条件去除(如提高杂交温度或提高杂交后洗涤温度和增加洗涤时间等)；“ ”表示目标染色体出现信号的同时，高倍镜下还可见很明显的非特异性信号。
[0204]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。