鉴定西瓜心室数的分子标记、方法、引物对、试剂盒及其应用

1.本发明涉及鉴定西瓜心室数的分子标记、方法、引物对、试剂盒及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域。


背景技术：

2.西瓜(citrullus lanatus)为葫芦科西瓜属一年蔓生草本植物，在我国及世界范围内广泛栽培，是世界上重要的水果型蔬菜之一。心室数对西瓜果实形状具有很大影响，普通栽培种西瓜多为3心室或者4心室，果实为椭圆形和圆形；饲用西瓜一般为5心室西瓜，果实呈扁圆形。心室数是影响果实形状的关键性状，对西瓜的商品性具有较大影响。在多数园艺作物中，clv3是影响心室数的主要基因，本发明在前期研究中发现，西瓜中clv3并不是导致其心室数发生变化的主要基因。因此，为了培育相应性状的西瓜或鉴定西瓜心室数，亟需找到影响西瓜心室数的关键基因。
3.caps分子标记是由于酶切位点处发生单碱基突变，致使酶切后产生片段长度多态性的一种分子标记，该类标记在基因组中分布广泛，操作简便，结果易于观察，在相同物种不同材料中具有普遍适用性。


技术实现要素：

4.为了更好地培育相应形状的西瓜或鉴定西瓜心室数，获得与西瓜心室数紧密连锁的染色体区段及分子标记，本发明提供了一种与西瓜心室数紧密连锁的分子标记，所述分子标记为核苷酸序列如seq id no.1所示的685bp核苷酸片段或核苷酸序列如seq id no.2所示的685bp核苷酸片段；所述seq id no.1与5心室性状紧密连锁，所述seq id no.2与3心室性状紧密连锁。
5.本发明还提供了引物对和限制性内切酶mspⅰ在鉴定西瓜心室数中的应用，所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组dna获得扩增产物，再利用限制性内切酶mspⅰ酶切扩增产物，根据酶切产物来鉴定西瓜心室数。
6.进一步地限定，所述西瓜基因组dna取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。
7.进一步地限定，所述鉴定西瓜心室数为3心室或5心室。
8.本发明还提供了一种鉴定西瓜心室数的方法，该方法包括如下步骤：
9.(1)提取待测西瓜的基因组dna；
10.(2)以步骤(1)获得的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得pcr产物；所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物；
11.(3)用限制性内切酶mspⅰ对步骤(2)获得的pcr产物进行酶切，获得酶切产物；
12.(4)通过检测酶切产物，判断西瓜的心室数。
13.进一步地限定，步骤2)所述的pcr扩增程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
14.进一步地限定，步骤(4)所述判断方法为利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据pcr产物是否存在可以被限制性内切酶切开的片段，判断西瓜心室数，若酶切产物具有或者包含一条685bp的片段，则判断西瓜具有3心室性状；若pcr产物可以被切开且酶切产物中不具有685bp的片段，则判断西瓜具有5心室性状。
15.本发明还提供了上述方法在西瓜心室数辅助鉴定、辅助育种及西瓜心室数筛选中的应用。
16.本发明还提供了一种用于鉴定西瓜心室数性状的试剂盒，所述试剂盒含有引物对和限制性内切酶mspⅰ；所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物。
17.本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，该方法利用所述引物对对西瓜基因组dna进行扩增，获得pcr产物，再利用限制性内切酶mspⅰ对获得的pcr产物进行酶切。
18.本发明还提供了上述试剂盒在西瓜心室数辅助鉴定、辅助育种及西瓜心室数筛选中的应用。
19.本发明的有益效果：
20.本发明在明确西瓜心室数遗传规律基础之上，利用基因组重测序和bsa-seq等技术快速获得了与西瓜心室数紧密连锁的染色体区段，在区段内开发caps分子标记，在遗传群体中进行验证，最终开发出了与西瓜心室数紧密连锁的分子标记，该分子标记可应用于西瓜果实形状分子育种。
21.本发明利用亲本重测序数据开发和获得的与西瓜心室数性状紧密连锁的分子标记设计引物对及选择限制性内切酶。由于3心室和5心室西瓜材料基因组片段中存在的单碱基突变不同，不存在突变的位点会被限制性内切酶mspⅰ切开。因此通过引物对对西瓜幼苗基因组dna进行pcr扩增，及利用限制性内切酶mspⅰ对扩增产物进行酶切，最终通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物的鉴定即可对3心室和5心室西瓜材料进行区分。本发明所公开的分子标记及鉴定方法在苗期提取待测西瓜样本的基因组dna即可实现西瓜心室数的鉴定，操作简便，育种准确度及效率高，为西瓜果实形状分子标记辅助选择育种提供了行之有效的育种工具及技术。
附图说明
22.图1为实施例1中西瓜心室数主效基因的初步定位结果图；
23.图2为实施例1中母本(3心室)和父本(5心室)、f1代和f2代pcr产物的利用限制性内切酶进行酶切后的电泳结果图，其中，泳道1、2和3依次为母本、父本和f1代的酶切结果，4-24泳道为f2代单株酶切结果。
具体实施方式
24.以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、实验方法及试剂等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和市场常规产品，本发明没有特别限制内容。
25.基因组dna的提取方法：
26.基因组dna提取方法参照murray等(1980)的方法(murray m.,thompson w.f.,rapid isolation of high molecular weight plant dna[j].nucl.acid.res.,1980,8:668-673.)，并在此基础上进行改良。
[0027]
具体步骤如下：
[0028]
①
将采集的幼嫩真叶用无菌水洗净擦干后，取0.2g放入1.5ml离心管中，加入液氮充分研磨至白色粉末，加入800μl 65℃预热的2％的ctab溶液(2％ctab，100mmol/l tris-hcl ph＝8.0)，1.4mol/l nacl，20mmol/l edta ph＝8.0，2％β-巯基乙醇)充分混匀，65℃水浴1h，每隔10min轻摇一次。
[0029]
②
取出离心管，待冷却至室温，13000rpm离心10min。贴壁吸出上清液置于新离心管中，为防止机械剪切力损坏dna，转移所用的枪头需提前用剪刀减去尖端部分，扩大吸液口。
[0030]
③
贴壁加入750μl氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，充分混匀，静止10min后，13000rpm离心10min。
[0031]
④
取出离心管，采用上述相同的处理方法用枪头贴壁吸出700μl上清液置于新离心管中。
[0032]
⑤
贴壁加入700μl氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，轻轻摇动离心管使溶液充分和混合，静止10min后13000rpm离心10min。
[0033]
⑥
贴壁吸出650μl上清液置新管中，加入2μl rnase(10mg/ml)混匀，放置37℃水浴2h。
[0034]
⑦
贴壁加入650μl氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，充分混合，静止10min后13000rpm离心10min。
[0035]
⑧
贴壁吸出550μl上清液置新管中加入-20℃预冷的550μl异丙醇(贴壁加入)，盖紧离心管盖，上下颠倒数次后置于-20℃冰箱静止60min。
[0036]
⑨
取出离心管，于离心机中13000rpm离心10min，小心弃去上清液，保留离心管底部沉淀物。
[0037]
⑩
用预冷的70％乙醇清洗沉淀三次，并将离心管置于超净工作台中，无菌风吹干后加入200μl ddh2o溶解，于-20℃中保存备用。
[0038]
实施例1：与西瓜心室数紧密连锁的分子标记及其获取方法
[0039]
a.供试材料的选取：所述的供试材料包括母本(3心室)、父本(5心室)、f1代、f2代和自然群体。
[0040]
所述的母本材料为：西瓜品种w1-17，栽培西瓜，3心室，西瓜品种w1-17公开于朱娜娜.ems诱变西瓜突变体库的构建及表型分析[d].东北农业大学，2015；
[0041]
所述的父本材料为：西瓜品种zxg1555，饲用西瓜，5心室，西瓜品种zxg1555引进于中国农业科学院郑州果树研究所国家西甜瓜中期库；
[0042]
所述的f1代为：以上述两材料为亲本进行杂交获得的f1代；
[0043]
所述的f2代群体为：上述f1代自交获得的f2代群体，共86株。
[0044]
b.供试材料心室数确定：于开花期采集子房，每个单株至少采集5个子房，横切后观察心室数。
[0045]
根据步骤b中的调查结果表明：f1代表现为3心室，f2代单株中，具有3心室类型的单株与5心室类型单株的分离比例，经卡方检验符合3:1的分离比例，说明西瓜心室数存在主效单基因，且3心室类型表现为显性性状。
[0046]
c.利用bsa-seq及遗传连锁分析方法，获得与西瓜心室数紧密连锁的染色体区段。
[0047]
在f2世代中选择具有3心室和5心室性状单株各10株，分别提取各单株dna，调节dna浓度一致后等量混合，构建3心室和5心室基因池，进行bsa-seq分析；根据bsa-seq分析结果结合两亲本基因组重测序数据，在bsa-seq分析结果的染色体区段内开发caps分子标记，在f2代进行遗传连锁分析，缩短定位区间，最终将西瓜心室数主效基因定位在西瓜基因组7号染色体上约244kb范围内，西瓜心室数主效基因的初步定位结果图见图1。
[0048]
d.候选caps标记开发。
[0049]
根据两亲本重测序数据，开发caps分子标记，在f2代分离群体中对各单株进行基因分型，结合表型数据，判断基因型与表型的符合度。结果表明，该区段内存在一处snp位点的变化(g
→
a)与西瓜心室数紧密连锁。
[0050]
本发明获得的与西瓜心室数紧密连锁的分子标记为核苷酸序列如seq id no.1所示的685 bp核苷酸片段或核苷酸序列如seq id no.2所示的685 bp核苷酸片段；所述seq id no.1与5心室性状紧密连锁，所述seq id no.2与3心室性状紧密连锁。
[0051]
seq id no.1：
[0052]
gatgctgcctccgatgttagcagacccaaggatgttagagaaaaagatagtttgtgtcacgaggatgccaaagcaccagatgctgtggaagaggaagacaagaggtcctcaaaggatgtttcttgccatctaattgaagctgaagacagaaaagaagaaaaagatttggttattcacaaatatgccaagccatcaaaaggtgcgaaaaataataaaacaaaggtgcatgacaagccatcggcaaagtcccgggaaaataaaaaatgctctgtgaatattcagaaccaggaatttggtgcctgtgtttctttccctccaggttcaaggttaacaactgtagcagatattgaactgacggcagacgatgttggtcatgccctgcagttcttagaattctgtgcagcttttggaaaggtttgtgtgtcattttgtttcaattaattattaaactaaaatttgctgaatcctccaactaagtctttgttcacttttgaattaaaattttactgacacaatcatgcagtatcgagttagaatagttaggatagtttttttgagttacaataataaaacaaaggtatgtgtgttattatcttttactagaagtttaaatgttaatcaaataccattgattaaaggccaatcttaaatcaagaattctgtcgctcttcggagaacgcaacac
[0053]
seq id no.2：
[0054]
gatgctgcctccgatgttagcagacccaaggatgttagagaaaaagatagtttgtgtcacgaggatgccaaagcaccagatgctgtggaagaggaagacaagaggtcctcaaaggatgtttcttgccatctaattgaagctgaagacagaaaagaagaaaaagatttggttattcacaaatatgccaagccatcaaaaggtgcgaaaaataataaaacaaaggtgcatgacaagccatcggcaaagtcccaggaaaataaaaaatgctctgtgaatattcagaaccaggaatttggtgcctgtgtttctttccctccaggttcaaggttaacaactgtagcagatattgaactgacggcagacgatgttggtcatgccctgcagttcttagaattctgtgcagcttttggaaaggtttgtgtgtcattttgtttcaattaattattaaactaaaatttgctgaatcctccaactaagtctttgttcacttttgaattaaaattttactgacacaatcatgcagtatcgagttagaatagttaggatagtttttttgagttacaataataaaacaaaggtatgtgtgttattatcttttactagaagtttaaatgttaatcaaataccattgattaaaggccaatcttaaatcaagaattctgtcgctcttcggagaacgcaacac
[0055]
实施例2：用于鉴定西瓜心室数的引物对及限制性内切酶的获取
[0056]
利用亲本重测序数据开发与西瓜心室数性状紧密连锁的caps分子标记设计引物对及选择限制性内切酶。
[0057]
具体操作为：在实施例1所述初步定位区间内，依据两亲本测序数据存在的snp差异，利用snp2caps软件查找存在酶切位点的差异序列，进行引物对设计。分别提取实施例1中父本、母本、f1代、f2代和自然群体内各单株基因组dna，利用引物对对获得的父本、母本、f1代和f2代群体内各单株基因组dna进行pcr扩增，再利用限制性内切酶mspⅰ对上述各自的pcr扩增产物进行酶切反应，得到各自的酶切产物。
[0058]
上述引物对中上游引物序列为watermelon carpel number-f(seq id no.3)：5
’‑
gatgctgcctccgatgttag-3’；
[0059]
下游引物序列为watermelon carpel number-r(seq id no.4)：5
’‑
gtgttgcgttctccgaaga-3’。
[0060]
实施例3：一种鉴定西瓜心室数的方法
[0061]
一种鉴定西瓜心室数的方法，具体包括如下步骤：
[0062]
(1)提取待测西瓜样品叶片或其他组织的基因组dna。
[0063]
本发明的鉴定方法可以以不同时期的西瓜幼苗为材料，为不影响后续生长最佳时期，本实施例是以西瓜幼苗期(两叶一心期)的叶子为材料提取dna。
[0064]
(2)以步骤(1)获得的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得pcr产物；所述引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物。
[0065]
(3)用限制性内切酶mspⅰ对步骤(2)获得的pcr产物进行酶切，获得酶切产物。
[0066]
(4)依据酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果判断西瓜心室数，具体为：若酶切产物具有或者包含一条685 bp的片段，则判断西瓜具有3心室性状；若pcr产物可以被切开且酶切产物中不具有685 bp的片段，则判断西瓜具有5心室性状。
[0067]
上述pcr反应体系为：上下游引物各1μl(引物浓度为2pm)，dna模板2μl(浓度为30ng/μl)，10
×
pcr buffer 1μl(含mg
2
15mm)，dntp 0.15μl(浓度为10mm)，taq酶0.1μl(5u/μl)，无菌去离子水6.75μl。
[0068]
上述pcr反应程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
[0069]
上述酶切反应体系为：pcr产物5μl(浓度为0.1～0.5μg)，限制性内切酶0.3μl，buffer 1μl，去离子水9μl。
[0070]
上述酶切反应程序为：将上述混合产物于37℃水浴酶切2h后，于4℃保存。
[0071]
pcr扩增产物和酶切产物检测：分别取3μl pcr产物或酶切产物，加入1μl loading buffer，混匀后点入1％琼脂糖凝胶中，110v/500ma电泳，电泳时间为25-30min。
[0072]
利用本发明的鉴定方法可在西瓜幼苗期判断心室数，采样的时间点约为两叶一心时期；而采用常规育种需要在西瓜雌花开放后进行鉴定，西瓜雌花开放时，约为播种后60天左右，由此可见，利用本发明所述的鉴定方法可有效缩短育种时间，加快育种速度。
[0073]
实施例4：利用所获得的引物对对不同心室数的西瓜品种进行筛选
[0074]
为判断所开发的引物对鉴定西瓜心室数的准确性，选择实施例1所述的父本、母本、f1代西瓜幼苗和f2代西瓜幼苗的样品，按照实施例3所述的鉴定方法对各样品进行心室数鉴定，鉴定结果如图2所示，并于西瓜开花期采集子房，每个单株至少采集5个子房，横切后观察心室数。
[0075]
图2中泳道1、2和3依次为母本、父本和f1代的酶切结果，4-24泳道为f2代单株酶切结果，鉴定结果及对西瓜开花期子房心室数的观察结果表明，心室数鉴定结果与实际成熟果实的心室数100％一致，进而了说明本发明所述西瓜心室数鉴定方法的可行性和准确性。
[0076]
实施例5：一种用于鉴定西瓜心室数的试剂盒
[0077]
一种用于鉴定西瓜心室数的试剂盒包括如下试剂：watermelon carpel number-f(浓度为2pm)、watermelon carpel number-r(浓度为2pm)、10
×
pcr buffer(含mg
2
15mm)、dntp(浓度为10mm)、taq酶(5u/μl)、限制性内切酶mspⅰ和无菌去离子水。
[0078]
实施例6：一种用于鉴定西瓜心室数的试剂盒的使用方法
[0079]
(1)提取待测西瓜的基因组dna，并调节基因组dna浓度至30ng/μl。
[0080]
(2)按照如下pcr体系添加样品及试剂
[0081][0082][0083]
(3)进行pcr扩增，pcr程序如下：94℃预变性7min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
[0084]
(4)用限制性内切酶mspⅰ对步骤(3)获得的pcr产物进行酶切，获得酶切产物，上述酶切反应体系及程序为：pcr产物5μl(浓度为0.1～0.5μg)，限制性内切酶mspⅰ0.3μl，buffer 1μl，去离子水9μl，将上述混合产物于37℃水浴酶切2h后，4℃保存
[0085]
(5)利用1％琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)所得的酶切产物进行检测，通过检测结果判断西瓜的心室数，具体为：若酶切产物具有或者包含一条685bp的片段，则判断西瓜具有3心室性状；若pcr产物可以被切开且酶切产物中不具有685bp的片段，则判断西瓜具有5心室性状。
[0086]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。