一种用于AR-inducedOD诊断和预后判别的靶点及治疗方法与流程

一种用于ar-induced od诊断和预后判别的靶点及治疗方法
技术领域
1.本发明涉及过敏性鼻炎嗅觉障碍诊疗技术领域，具体涉及一种用于ar-induced od诊断和预后判别的靶点及治疗方法。


背景技术：

2.过敏性鼻炎，又称变应性鼻炎(allergic rhinitis,ar)是一种常见的非感染性鼻部疾病，与免疫球蛋白e(immunoglobulin e,ige)介导的免疫炎症反应有关，影响全球10％到40％的人群。ar一直都是临床上引起嗅觉障碍(olfactory dysfunction,od)的重要和常见原因之一，流行病学数据显示ar患者出现od的概率在10％
–
88％之间，雪上加霜的是od出现后又会促进ar的进展，严重影响患者生活质量。ar引发od(ar-induced od)机制，目前仍不清楚。
3.临床研究发现作为嗅觉传导第一中继站的嗅球在ar引发od的过程中具有重要作用，且越来越多的研究发现ar嗅球中的神经炎症与ar-induced od的发生发展密切相关。小胶质细胞是神经炎症反应的主效应细胞，其表达的p2x7受体(p2x7 receptor,p2x7r)被认为是免疫炎症通路上关键的调节器，且发现p2x7r和过敏性气道疾病及od有关。那么嗅球小胶质细胞上的p2x7r是否能成为ar-induced od的治疗新靶点，目前未见相关报道。因此，有必要探究嗅球小胶质细胞p2x7r在ar-induced od中的作用，为ar-induced od的诊疗提供新思路。


技术实现要素：

4.针对现有ar-induced od机制及诊疗方面存在的不足，提供用于ar-induced od诊断和预后判别的靶点，通过该靶点可以为ar-induced od的诊疗提供新思路。
5.本发明的目的是通过以下技术措施达到的：一种用于ar-induced od诊断、治疗和预后判别的靶点，所述用于ar-induced od诊断、治疗和预后判别的靶点为p2x7r。
6.进一步地，所述用于ar-induced od诊断、治疗和预后判别的靶点为嗅球p2x7r。
7.进一步地，所述用于ar-induced od诊断、治疗和预后判别的靶点为嗅球小胶质细胞p2x7r。
8.进一步地，一种治疗方法，所述治疗方法包括能够使ar-induced od患者的p2x7r、嗅球p2x7r、嗅球小胶质细胞p2x7r恢复正常的手段。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供嗅球小胶质细胞p2x7r在ar-induced od中的应用。本发明通过使用卵清蛋白建立ar-induced od小鼠模型。血清elisa测定ige、白细胞介素-5(interleukin-5,il-5)，并结合挠鼻行为学观察评定ar建模的成败。埋藏食物小球实验(buried food pellet test,bfpt)评估小鼠的嗅觉功能改变。药理学拮抗剂在体应用和离体细胞条件性培养的方法明确小胶质细胞p2x7r的关键作用。使用qpcr、western blotting检测iba1、gfap、p2x7r、il-1β、il-1ra变化。使用免疫荧光染色联合sholl分析评估小胶质细胞形态学变化。证实p2x7r是鼻黏膜上皮细胞感受变应原刺激后激
活嗅球小胶质细胞引发od的直接作用分子，抑制小胶质细胞p2x7r可能是改善ar-induced od的新策略，即小胶质细胞p2x7r是ar-induced od诊疗中可以应用的靶点。
10.下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
附图说明
11.图1是本发明实验的整体设计概述图。
12.图2是ova诱导ar小鼠模型的鉴定与嗅觉功能变化评估。
13.图3是不同分组小鼠嗅球中胶质细胞标志物的变化和il-1系统促炎因子il-1β、抗炎因子il-1ra间的平衡变化，以及这些变化之间的相关性评估。
14.图4不同分组小鼠嗅球中p2x7r的变化，以及p2x7r特异性拮抗剂bbg使用后不同分组小鼠寻找埋藏食物颗粒时间间隔、iba1、il-1β和il-1ra的变化。
15.图5与derp1处理后的鼻粘膜上皮细胞的条件培养基共同培养时，p2x7r抑制对小胶质细胞的影响。
16.图6临床转化应用的机制图展示。
具体实施方式
17.本发明的第一个方面，提供一种用于ar-induced od诊断、治疗和预后判别的靶点，所述靶点为p2x7r；进一步所述靶点为嗅球p2x7r；再进一步所述靶点为嗅球小胶质细胞p2x7r。其中，所述靶点的评估具体包括使用实时聚合酶链反应、蛋白免疫印迹、活体分子影像标记等手段方法检测患者外周血、鼻黏膜和嗅球等部位中p2x7r的变化以对ar-induced od进行诊疗。
18.本发明的第二个方面，提供一种治疗方法，所述治疗方法包括能够使ar-induced od患者的p2x7r、嗅球p2x7r、嗅球小胶质细胞p2x7r恢复正常的手段，该手段可以是药物、干细胞治疗及康复理疗类方式等。
19.既往研究发现给予tlr4选择性抑制剂tak-242或多巴胺d2受体激动剂喹吡罗可以改善嗅球神经炎症而改善ar-induced od，而这两种药物针对的受体并非小胶质细胞主要表达。相比较，本发明却证实通过抑制嗅球神经炎症而实现改善ar-induced od的作用点在于小胶质细胞p2x7r，这能使ar-induced od的防治更加精准。
20.构建ova诱导的ar小鼠模型
21.6-8周龄c57bl/6小鼠(体重大约为22-25g)购买自ji'nan pengyue laboratory animal breeding co.,ltd.。动物购买、饲养及后续实验均已通过伦理委员会批准，且所有实验用鼠均达到spf级。造模如下：第1-14天，ar组隔天腹腔注射含有40μg ova(a8040，索莱宝公司)和2mg氢氧化铝的200μl(77161，thermo fisher公司)生理盐水进行致敏；对照(ctrl)组给予注射等量的生理盐水。从第21天时开始，ar组每天给予5％ova(生理盐水稀释)雾化30分钟，雾化结束后给予50mg/ml ova每只每侧10μl滴鼻，连续1周进行激发；ctrl组给予相应处理，仅是使用雾化液和滴鼻液改为同等量的纯生理盐水。
22.ar模型评估
23.通过对比ar组和ctrl组两组间血清ige、il-5含量及5min挠鼻次数的差异来评估模型是否成功，其中血清ige、il-5含量测定按照制造商的操作说明使用市售elisa试剂盒
进行。
24.嗅觉功能评估
25.使用bfpt评估各组小鼠的嗅觉功能，即从小鼠被随机放置于测试盒子中开始，记录其找到食物小球并用它的前爪或牙齿抓住食物小球的时间，如果5min内小鼠未找到食物小球，则将其时间记录为300s。
26.药物处理
27.根据实验设计，部分ar小鼠会给予腹腔注射brilliant blue g(bbg)(b0770,sigma-aldrich公司)以拮抗p2x7r，bbg的终浓度为100mg/kg/只小鼠，共计14天。
28.样本收集
29.在行为测试后，将小鼠麻醉，先眼球取血，获得血清用以检测ige和il-5，然后处死小鼠后立即获取小鼠的嗅球组织，-80℃冰箱保存备用。
30.细胞培养与处理
31.人鼻粘膜上皮细胞株hnepc复苏后于含有10％胎牛血清、100iu/ml青霉素、100μg/m l链霉素的rp-mi-1640培养基中，37℃、5％co2条件下培养。待细胞生长至80％～90％以上密度后给予屋尘螨过敏原derp1(xpb91d3a2.5，greer公司)40μg/ml处理24小时，收集上清制作条件性培养基(conditioned medium,cm)备用。
32.人小胶质细胞系hmc3复苏后使用含10％胎牛血清、1％的双抗加入到dmem/f12完全培养基在37℃、5％co2细胞培养箱培养。待细胞生长至60％～70％以上密度后给予p2x7r抑制剂jny-47965567(hy101418，mce公司)预处理2小时，然后加入derp1处理hnepc获得的cm继续培养24小时(其中部分hmc3会被置于盖玻片上培养)。
33.实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction)
34.总rna用trizol试剂(ac0101-b，思科捷公司)提取，并用cdna合成试剂盒(ag0304，思科捷公司)转录。用sybr在7500实时pcr系统(美国应用生物系统公司)上进行定量聚合酶链反应(pcr)。使用pcr master mix试剂盒(ah0104，思科捷公司)和iba1、gfap、p2x7r、il-1β、il-1ra等的特异性引物(上海生工)扩增得到的cdna产物。所有结果均用gapdh内参引物标准化。
35.蛋白质免疫印迹检测
36.将小鼠嗅球组织或离体培养的人小胶质细胞hmc3细胞在冰冷的ripa缓冲液中均质化。匀浆在4℃下以12000rpm的转速离心20分钟。通过bca蛋白质分析试剂盒(ec0001，思科捷公司)测量蛋白质浓度。用含有150mm nacl、25mm tris、5mm edta、1％nonidet p-40、ph 7.5的裂解缓冲液，以及pmsf(ea0005，思科捷公司)和磷酸酶抑制剂(赛默科学公司，88667，美国)鸡尾酒片制备细胞裂解物。样品在8％-12％sds-page上分离，并转移到硝酸纤维素聚偏氟乙烯膜膜(nc)上。随后，在室温下，用10％脱脂奶粉在0.1％tris缓冲盐水和0.05％吐温-20(tbst)中封闭1小时。样品在4℃条件下与针对iba1、gfap、il-1β、il-1ra、p2x7r及内参蛋白的一抗体一起培养过夜；第二天回收一抗清洗膜后再次将膜在室温下与适当的hrp结合的抗兔/鼠igg二抗孵育1小时。样品在tbst缓冲液中洗涤三次，使用ecl试剂盒测量蛋白质密度，并通过image j软件(美国国立卫生研究院)进行定量。
37.免疫荧光染色
38.动物实验共染部分是准备小鼠嗅球冰冻切片用于免疫荧光染色。当免疫荧光染色
开始时，向脑切片中添加1
×
pbs，将其洗涤5分钟(重复三次)并在5％bsa中阻断1小时。添加以下一级抗体：iba1(ab178846，1:1000；英国abcam)，p2x7r(apr-004，1:200；以色列阿洛蒙实验室)。然后将脑切片置于4℃的冰箱中过夜。第二天洗涤三次，每次5分钟，其后在室温下添加alexa山羊抗兔fluor 488驴抗鼠igg(h l)(a212020423，1:10500；invitrogen碧云天生物科技公司，美国)和alexa fluor 555山羊抗鼠兔igg(h l)(a214290409，1:10500；碧云天生物科技公司invitrogen，美国)1小时。脑切片用pbs清洗三次，每次5分钟。添加4
′
，6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)，并将盖玻片安装在切片上。完成上述过程后，通过显微镜(德国蔡司公司axio日本奥林巴斯scope a1)观察并捕获脑切片。
39.离体细胞实验共染部分是将人小胶质细胞hmc3细胞在盖玻片上培养，收片后在pbs中洗涤，用4％多聚甲醛固定、0.25％的tritoxn-100破膜，10分钟，并在5％bsa中封闭1小时，其后操作同动物实验共染部分。
40.而备用于sholl分析的免疫荧光染色亦是将人小胶质细胞hmc3细胞在盖玻片上培养，收片、固定、封闭不变，孵育抗体时仅添加iba1一抗(ab178846，1:1000；英国abcam)，然后置于4℃的冰箱中过夜。在第二天洗涤三次，每次5分钟，其后在室温下加入山羊抗兔igg(h l)(a0423，1:500；碧云天生物科技公司)alexa fluortm 488驴抗鼠igg(h l)(a21202，1:1000；invitrogen，美国)，然后同样洗涤三次，直接用盖玻片在切片上封片以后续进行sholl分析。
41.sholl分析
42.对不同组别免疫荧光染色获得的人小胶质细胞hmc3细胞图像进行sholl分析以探究相关处理对其形态学变化的影响，即使用imagej中的sholl analysis插件对放射层iba1信号的最大投影图像进行分析，重点关注细胞的胞体和突起数据，本研究纳入的指标是ending radius。
43.统计分析
44.所有数据均以平均值
±
sem表示。所有统计分析均使用prism 8(graphpad软件，美国)进行。对于这两组，使用t检验进行统计分析。对于多个组，使用双向方差分析进行统计分析，然后进行tukey的事后分析。所有的统计比较都是基于≥3个生物学上独立的样本，并在不同的实验日复制。显著性由*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001表示，ns表示不显著。结果：
45.ar小鼠嗅觉功能减退
46.首先我们通过elisa测定发现ar组小鼠血清ige(图2a)和il-5(图2b)均较ctrl组小鼠显著升高；通过挠鼻行为学(图2c)观察发现5min时间内ar组小鼠挠鼻次数亦远远多于ctrl组。提示ova诱导的ar小鼠模型是成功的。在此基础上，我们进一步通过bfpt(图2d)发现，与ctrl组小鼠相比，ar组小鼠找到被埋藏的食物小球所花费的时间有所增加。提示ova诱导的ar小鼠有嗅觉功能减退。
47.ar小鼠嗅球出现小胶质细胞激活、il-1系统致炎/抗炎因子紊乱，并和嗅觉功能改变密切相关
48.为验证ar-induced od是否和嗅球内的神经炎症有关，我们通过qpcr、蛋白质免疫印迹检测了两组小鼠嗅球星形胶质细胞标志物gfap、小胶质细胞标志物iba1及il-1系统致炎因子il-1β和抗炎因子il-1ra。发现与ctrl组小鼠相比，ar组小鼠嗅球星形胶质细胞标志物gfap无统计学上的差异性改变(图3a、3b)；但小胶质细胞标志物iba1明显增多(图3c、
3d)；且同时伴il-1系统致炎因子il-1β的升高(图3e、3f)和抗炎因子il-1ra的下降(图3g、3h)；进一步线性相关分析提示小胶质细胞标志物iba1和il-1β、小鼠找到被埋藏的食物小球所花费的时间正相关(图3i、3j)。提示ar小鼠嗅球出现小胶质细胞主导的il-1系统致炎/抗炎因子紊乱，并和嗅觉功能改变密切相关。
49.小胶质细胞p2x7r参与嗅球神经炎症引发的ar小鼠嗅觉功能减退
50.既往研究表明：p2x7r在小胶质细胞激活和il-1β释放中具有核心作用；近期又有研究提示其和od有关。那么其是否会在上述嗅球小胶质细胞神经炎症引发的ar小鼠嗅觉功能减退中发挥重要作用呢？为明确这一问题，我们首先通过免疫荧光染色证实p2x7r在嗅球小胶质细胞中表达(图4a)。与此同时，通过qpcr、蛋白质免疫印迹检测，我们发现与ctrl组小鼠相比，ar组小鼠嗅球p2x7r明显增多(图4b、4c)。进一步我们通过给予p2x7r特异性拮抗剂bbg治疗后bfpt评估发现ar小鼠的嗅觉功能减退得到改善(图4d)；且通过qpcr、蛋白质免疫印迹检测发现给予bbg治疗后ar小鼠嗅球中异常改变的iba1(图4e、4f)、il-1β(图4g、4h)il-1ra(图4i、4j)等指标亦得到一定逆转；更重要的是，这些变化和通过qpcr、蛋白质免疫印迹检测发现的p2x7r(图4k、4l)变化结果是一致的。综合来看，以上这些结果证明小胶质细胞p2x7r在嗅球神经炎症引发的ar小鼠嗅觉功能减退中具有重要作用。
51.p2x7r是鼻黏膜上皮细胞感受变应原刺激后激活小胶质细胞的调节器
52.在体情况复杂，存在多种干扰，为进一步说明鼻部过敏反应引发嗅球小胶质细胞激活直接和p2x7r相关，我们又通过离体细胞培养的方法来简化模拟在体发生的情况，具体参见figure 1中细胞研究部分的操作和分组。首先，我们亦是通过免疫荧光染色证实p2x7r在hmc3中表达(图5a)，然后按照设定好的分组进行相关处理，并在不同处理后进一步基于免疫荧光染色进行sholl分析发现derp1处理hnepc后获得的cm可以激活hmc3使其发生形态学变化，表现为胞体变圆、突起缩短；而抑制其p2x7r后这种激活后的异常形态学变化得到一定逆转(图5b)。同时，通过蛋白质免疫印迹检测发现derp1处理hnepc后获得的cm可以使hmc3胞内il-1β增多和il-1ra减少，而给予抑制其p2x7r后其胞内这种il-1系统致炎/抗炎因子平衡得到一定程度恢复(图5c、5d)。这表明鼻黏膜过敏反应激活嗅球小胶质细胞神经炎症的作用分子是p2x7r(图6)。
53.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
54.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。