使用原代心肌细胞构建心肌缺血再灌注胰岛素抵抗模型的构建方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及使用原代心肌细胞构建心肌缺血再灌注胰岛素抵抗模型的构建方法。


背景技术：

2.心肌缺血再灌注损伤是导致心功能障碍甚至导致死亡的重要病理生理机制之一。目前公认的心肌缺血再灌注损伤的发病机制包括氧自由基损伤、钙超载、程序性细胞死亡、心肌胰岛素抵抗等。心肌胰岛素抵抗是心肌缺血再灌注损伤的始动机制之一。在心肌缺血再灌注损伤的病理状态下，心肌组织和细胞对生理水平的胰岛素敏感性降低，导致心肌组织能量代谢紊乱，出现一系列严重的代谢并发症，导致器官和组织的不可逆损伤，这不仅增加了患者的发病率和死亡率，还制约了医疗资源的合理分配。因此，建立心肌缺血再灌注损伤胰岛素抵抗模型，深入研究其病理生理改变，是当前研究人员亟需攻破的难题之一。
3.目前常用的心肌缺血再灌注损伤胰岛素抵抗模型包括动物模型及心肌细胞系模型。现阶段的疾病模型均存在一定的缺陷。首先，动物模型在建模过程中，实验操作难度高，需要具备经验丰富的手术操作技巧，并且动物体内如神经、内分泌、应激反应等多种干扰因素对实验产生干扰，影响实验结果的准确性，并且动物模型的经济成本高，实验周期长，实验效率低；第二，心肌细胞系实验模型。心肌细胞系属于来源于原代心肌细胞的、可以连续培养及传代的细胞，经济成本低，效率较高，且实验操作相对简单。但此类细胞的生物学特性仍不同于原始心肌细胞，并且随着传代次数增加，细胞系会丢失心肌的生理特性，影响实验有效性和准确性。因此，寻找一种新的心肌缺血再灌注损伤胰岛素抵抗模型方法非常必要。
4.原代心肌细胞的分离及培养是心血管实验中的基本技术和方法，也是目前最为理想的体外实验研究模型，它不仅可以自主搏动，并且保留了在体心肌中的生物学功能。而且，体外培养的心肌细胞均一性好，不受机体神经、体液、内分泌等因素的干扰。成年大鼠的心肌细胞为终末细胞，不具备分裂增殖的能力，培养出的心肌细胞活力较差，纯度低。目前应用较多的为出生7天内的乳鼠的心肌细胞，此类心肌细胞具有部分增殖能力，且心肌组织中所含胶原较少，组织消化相对容易，分离后的心肌细胞纯度高，易于贴壁存活，细胞状态好，可为后续实验开展打下良好基础。


技术实现要素：

5.为了解决现阶段模拟心肌缺血再灌注损伤胰岛素抵抗的实验模型为实验动物模型，而动物模型存在经济成本高，实验周期长，实验操作技术要求高，体内干扰因素多等弊端的技术缺陷与不足，本发明提供了一种使用原代心肌细胞构建心肌缺血再灌注胰岛素抵抗模型的构建方法。
6.本发明采用的技术解决方案是：一种使用原代心肌细胞构建心肌缺血再灌注胰岛
素抵抗模型的构建方法,包括以下步骤：（1）原代心肌细胞的培养：取sd大鼠，在无菌环境条件下开胸获取心脏；pbs液清洗心脏，剪碎心肌至1mm3大小的组织块，使用胰蛋白酶浸泡软化组织，使用含edta胰蛋白酶消化4-6次，直至组织块基本消化完全，使用完全培养基中和胰酶，细胞网筛过滤后，收集细胞悬液接种于培养皿中，差速贴壁法去除心肌成纤维细胞，所得的含原代心肌细胞悬液于培养皿中培养，同时每皿加入5-溴脱尿苷以抑制成纤维细胞生长；（2）造模：原代心肌细胞培养48h后，更换为含血清的低糖dmem培养基培养，在37℃含氧气浓度小于等于1%的缺氧条件的培养箱中以无糖培养基培养，后迅速更换为含血清的低糖dmem培养基在37℃含5% co2的复氧条件培养箱中培养，得到心肌缺血再灌注胰岛素抵抗模型。
7.所述的sd大鼠为新生1-3天乳鼠。
8.所述的步骤（2）中含氧气浓度小于等于1%的条件为含1% o2、94%n2、5% co2的三气条件下。
9.所述的步骤（2）中缺氧条件时间为4h，复氧条件时间为15-30min。
10.所述的构建方法还包括实验模型的鉴定：实验细胞造模完成后，预冷pbs液，清洗3次，4组细胞培养皿中加入ripa细胞裂解液4℃条件下静止30min，细胞刮板挂下细胞置于eb管中，4℃条件下12000 rpm离心20min，所得上清液用于western blot检测胰岛素抵抗标志蛋白glut4表达。
11.所述的含血清的低糖为d-葡萄糖。
12.所述的d-葡萄糖的浓度为1000mg/l。
13.所述的含edta胰蛋白酶的终浓度为0.08%。
14.所述的实验模型的鉴定还包括心肌损伤标志物ldh、2-nbdg葡萄糖摄取率检测。
15.本发明的有益效果是：本发明提供了一种使用原代心肌细胞构建心肌缺血再灌注胰岛素抵抗模型的构建方法，从sd新生乳鼠获取原代心肌细胞，通过氧糖剥夺后复氧的实验方法模拟在体心肌缺血再灌注实验模型。此模型经济成本低，实验周期短，干扰因素少，直接反应器官组织的病理生理变化，相比动物模型具有更好的稳定性。
附图说明
16.图1为乳鼠原代心肌细胞荧光鉴定图。
17.图2为cck8检测原代心肌细胞缺氧时间点细胞活力结果。
18.图3 为cck8检测原代心肌细胞复氧时间点细胞活力结果。
19.图4为复氧条件下原代心肌细胞在各时间点的ldh值结果。
20.图5为复氧条件下原代心肌细胞在各时间点的glut4膜蛋白表达结果。
21.图6为细胞活力、心肌损伤标志物ldh、glut4膜蛋白表达结果。
22.图7为共聚焦显微镜检测原代心肌细胞摄取2-nbdg结果图。
23.图8为流式细胞仪检测原代心肌细胞摄取-2-nbdg结果图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1实验动物：2-3d的新生sd大鼠(贵州医科大学实验动物中心提供)48只。
26.药品与试剂：dmem低糖培养液、dmem高糖培养液、胰蛋白酶消化液、pbs液均为均为basalmedia公司产品；新生牛血清为四季青公司产品；5-brdu为mce公司产品；2-nbdg为安捷凯公司产品；胰岛素溶液为普诺赛公司产品；glut4抗体为abcam公司产品。
27.氧糖剥夺胰岛素抵抗原代心肌细胞模型的建立方法，包括原代心肌细胞培养、实验分组与造模、氧糖剥夺胰岛素抵抗心肌细胞模型的鉴定。具体步骤为：原代心肌细胞的培养：取sd大鼠新生1-3天乳鼠，在无菌环境条件下开胸获取心脏；pbs液清洗心脏3次，双抗液清洗1次，再次pbs液清洗3次，剪碎心肌至1mm3大小的组织块，使用终浓度为0.125%含edta胰蛋白酶浸泡心肌组织于4℃条件下软化8—12小时后弃胰酶，使用终浓度为0.08%含edta胰蛋白酶浸泡心肌组织，巴氏滴管轻轻吹打消化管底心肌组织，收集上清液于含有完全培养基的培养瓶中，重复此步骤消化4-6次，直至组织块基本消化完全。收集消化后的上清液，200目细胞网筛过滤去除杂质及纤维后，于1000rpm离心10 min，弃上清液，用含10%血清的高糖（d-葡萄糖4500mg/l）dmem培养基重悬细胞，吹打均匀后将细胞悬液接种于培养皿中，并于37℃含5% co2培养箱中培养90min，差速贴壁法去除心肌成纤维细胞。所得的含原代心肌细胞悬液以1
×
106密度接种于6cm培养皿中，放入37℃含5% co2培养箱以含10%血清的高糖（d-葡萄糖4500mg/l）dmem培养基培养，同时每皿加入终浓度为20-60umol/l的5-溴脱尿苷以抑制成纤维细胞生长。
28.实验分组与造模：原代心肌细胞培养48h后，更换为含血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基培养12h，之后随机分为4组，分别为对照组，胰岛素干预对照组，模型组，胰岛素干预模型组。对照组为原代细胞37℃含5% co2培养箱中培养；胰岛素干预对照组为终浓度为10-7
mmol/l的胰岛素溶液加原代细胞在37℃含5% co2培养箱中培养；模型组在37℃含1% o2、94%n2、5% co2的三气培养箱中以无糖培养基培养4h，后迅速更换为含血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基在37℃含5% co2培养箱中培养15-30min；胰岛素干预模型组在37℃含1% o2、94%n2、5% co2的三气培养箱中以无糖无血清培养基培养4h，后迅速更换为含10%血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基加终浓度为10-7
mmol/l的胰岛素溶液在37℃含5% co2培养箱中培养15-30min。
29.实验模型的鉴定：对照组，模型组，胰岛素干预模型组的细胞在模型建立后，收集细胞样本分别完成以下实验，具体方案为：1）收集4组实验细胞的上清培养液，行乳酸脱氢酶（ldh）检测；2）实验细胞造模完成后，预冷pbs液，清洗3次，4组细胞培养皿中加入ripa细胞裂解液4℃条件下静止30min，细胞刮板挂下细胞置于eb管中，4℃条件下12000 rpm离心20min，所得上清液用于western blot检测胰岛素抵抗标志蛋白glut4表达；3）实验细胞造模完成后，各组经pbs液洗涤后，加入2-nbdg避光于37℃含5% co2培养箱孵育40min，pbs洗涤心肌细胞后。流式细胞仪检测葡萄糖摄取率，荧光显微镜观察心肌细胞的葡萄糖摄取情况。
30.实验结果
（1）乳鼠原代心肌细胞的鉴定取密度约为50-70%的稳定贴壁原代心肌细胞pbs洗3次，每次5 min，用0.5% triton-x100室温通透细，通透时间约8min，
④
封闭：加入足够量的4%多聚甲醛封闭细胞，室温下封闭1 h；弃去封闭液，加入稀释后的ctnt抗体孵育，4℃过夜；吸弃一抗，用pbs缓冲液洗3次，每次5 min；加入稀释的二抗，避光、室温放置1 h。用洗涤缓冲液洗3次，每次5 min；用dapi溶液染核20 min；pbs洗3次，每次5 min；每张玻片上加5
ꢀµ
l防淬灭剂，用盖玻片封片；激光共聚焦显微镜下拍照，鉴定结果见图1。
31.（2）缺氧条件下原代心肌细胞活力检测将原代心肌细胞以密度约2
×
104个细胞数接种于96孔板，待细胞稳定贴壁生长48h后，更换为含血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基培养12h。96孔板中培养稳定的细胞更换为100ul缺氧液，于37℃含1% o2、94%n2、5% co2的三气培养箱中分别孵育1h，2h，4h，6h，8h；各时间点样本孵育完成后加入10ul cck8试剂在常规孵箱内孵育2h。酶标仪于450nm处检测吸光值。结果见图2。
32.（3）复氧条件下原代心肌细胞活力检测、损伤程度及标志蛋白变化检测细胞活力将原代心肌细胞以密度约2
×
104个细胞数接种于96孔板，待细胞稳定贴壁生长48h后，更换为含血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基培养12h。96孔板中培养稳定的细胞更换为100ul缺氧液，于37℃含1% o2、94%n2、5% co2的三气培养箱中孵育4h后，细胞换液为含10%血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基，于37℃含5% co2孵箱内分别孵育0min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,各时间点样本孵育完成后加入10ul cck8试剂在常规孵箱内孵育2h。酶标仪于450nm处检测吸光值。结果见图3。
33.b. ldh检测原代心肌细胞损伤将原代心肌细胞以密度约7
×
105个细胞数/孔接种于6孔板，待细胞稳定贴壁生长48h后，更换为含血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基培养12h。6孔板中培养稳定的细胞更换为2ml缺氧液，于37℃含1% o2、94%n2、5% co2的三气培养箱中孵育4h后，细胞换液为含10%血清的低糖（d-葡萄糖1000mg/l）dmem培养基，于37℃含5% co2孵箱内分别孵育0min,15min,30min,1h,2h,收集各时间点样本上清液行ldh测定。结果见图4。
34.c. western blot蛋白印迹法检测glut4膜蛋白表达将原代心肌细胞以密度约3
×
106个细胞数接种于10cm细胞培养皿，培养方法同上，于37℃含5% co2孵箱内分别孵育0min,15min,30min,1h,2h,收集各时间点样本后行western blot检测。简要步骤如下：培养皿中的心肌细胞经细胞裂解液充分裂解，离心去除细胞杂质获取膜蛋白。以bca法定量蛋白后，使用10%sds-page胶行蛋白电泳，电泳结束后使用0.22umpvdf膜行半干转膜，转膜结束后，tbst缓冲液洗膜3次，5min/次，5%新鲜脱脂牛奶室温下封闭1h，封闭完成后按照说明鼠稀释比例加入5%bsa液稀释的glut4一抗4℃过夜孵育；一抗孵育后tbst缓冲液洗膜3次，15min/次，加入稀释后的二抗室温孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，15min/次后，上机显色检测膜蛋白表达情况。结果见图5。
35.以上结果显示，原代心肌细胞在缺氧环境中，缺氧4h时心肌细胞活力较差，由此选择4h为建模缺氧时间点；在复氧环境中，复氧15-30min时心肌细胞损伤程度重，细胞活力差，胰岛素抵抗标志蛋白glut4膜蛋白表达量最低，由此选择复氧30min为建模时间点。在此
基础上，进一步印证氧糖剥夺后原代心肌细胞胰岛素抵抗模型。
36.（5）miri心肌ir模型鉴定在前期研究基础上，选择缺氧4h，复氧15-30min为时间点建立原代心肌细胞氧糖剥夺后复氧模型。cck8检测细胞活力、心肌损伤标志物ldh、glut4膜蛋白表达的实验步骤同上。流式细胞仪及共聚焦显微镜检测心肌细胞葡萄糖摄取率步骤如下：原代心肌细胞稳定培养后（方法同上），选取缺氧4h，复氧15-30min为时间点氧糖剥夺后复氧建模，建模完成后将终浓度为300umol/l的2-nbdg加入到pbs液覆盖的原代心肌细胞中，常规孵箱避光孵育30min，4%多聚甲醛固定后的原代心肌细胞行共聚焦显微镜观察荧光摄取情况及流式细胞仪检测2-nbdg葡萄糖摄取率。结果见图6-8。
37.各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
38.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。