一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引物、检测试剂盒和物种鉴定方法

1.本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引物、检测试剂盒和物种鉴定方法。


背景技术：

2.赭鹿花菌(gyromitra infula(schaeff.)qu
é
l.)是一种易被误食的有毒蘑菇，在我国不同地区夏秋季均有分布，与可食用的马鞍菌(粗柄马鞍菌helvella macropus(pers.)p.karst.)极为相似，易与其混淆发生误食中毒。它含有鹿花菌素和水解产物甲基联胺，可溶解和破坏红细胞，进而引起急性溶血。赭鹿花菌中毒事件一旦发生，快速检测和鉴定赭鹿花菌对于蘑菇中毒事件的调查、中毒患者的救助就会显得尤为重要和迫切(李海蛟等，2020)。
3.蘑菇中毒在临床治疗和法医学分析过程中，需要从剩余物、煮熟的蘑菇、呕吐物或者胃提取物中取得样本用于检测。由于高温、高压和胃液的消化会引起dna的降解和碎片化(goldstein and desalle,2003)。meusnier等人发现coi序列中短于250bp的基因片段鉴定成功率在90％以上，因此提出使用“mini-barcode”的方法来解决处理过后的样品dna降解问题。随后，越来越多的研究学者表明短于300bp的基因片段不会影响对降解的dna的检测反而比全长的基因序列更容易扩增。目前基于dna mini-barcode技术，韩建萍课题组首次提出了中药材分子身份证的概念。分子身份证指一段极短(20-50bp)且物种特异的dna序列，该序列仅存在于目标物种的基因组中，用于鉴定混合dna样品中的某种特定样品。由于分子身份证技术具有鉴定效率高、特异性强等特征，因此，非常适用于有毒蘑菇的鉴定及快速检测。
4.然而分子身份证越段其携带的特异性的dna分子信息越少，对成功准确鉴定物种越困难。目前尚未有关于准确表征赭鹿花菌的分子身份证的报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引物、检测试剂盒和物种鉴定方法，可以快速准确地检测中毒事件中的有毒蘑菇是否含有赭鹿花菌，为后续快速治疗提供依据。
6.本发明提供了一种赭鹿花菌分子身份证，赭鹿花菌分子身份证的核苷酸序列如seq id no:1所示或与seq id no:1互补的序列。
7.本发明提供了一种特异性扩增所述赭鹿花菌分子身份证的引物，包括核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物。
8.本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌的检测试剂盒，包括所述引物和检测试剂。
9.优选的，所述检测试剂包括pcr扩增用试剂。
10.优选的，所述检测试剂盒还包括阳性标准品；
11.所述阳性标准品为所述赭鹿花菌分子身份证。
12.本发明提供了一种赭鹿花菌的物种鉴定方法，包括以下步骤：
13.1)提取待检测样本的基因组dna；
14.2)以步骤1)中所述基因组dna为模板，用所述引物进行pcr扩增，得到pcr产物；
15.3)将所述pcr产物进行电泳和测序，得到122bp的序列判断待检测样本为赭鹿花菌。
16.优选的，步骤2)中pcr扩增的反应体系总体系为25μl，包括12.5μl的2
×
taq pcr master mix12.5μl，2μm上游引物和2μm下游引物各1μl，2μl10ng/μldna模板，余量的ddh2o。
17.优选的，步骤2)中pcr扩增的反应程序为94℃4min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，34个循环；72℃10min。
18.本发明提供了所述赭鹿花菌分子身份证、所述引物或所述检测试剂盒在鉴别赭鹿花菌和近缘种中的应用。
19.优选的，所述近缘种包括以下一种或几种：鹿花菌、大鹿花菌、弹性马鞍菌、羊肚菌、波地钟菌、胶陀螺和粗柄马鞍菌。
20.本发明提供了一种赭鹿花菌分子身份证，核苷酸序列如seq id no:1所示或与seq id no:1互补的序列。本发明将赭鹿花菌及其亲缘种中筛选一段能够特异性鉴定赭鹿花菌的分子身份证，利用所述分子身份证便于快速准确地检测中毒事件中的有毒蘑菇是否含有赭鹿花菌，对中毒后的针对性治疗和诊断具有重要意义。
21.本发明还提供一种特异性扩增所述赭鹿花菌分子身份证的引物，包括核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的反向引物。所述引物具有特异性检测赭鹿花菌的特点，同时所述引物对10ng/μl～1fg/μl进行pcr扩增反应，pcr扩增的检出限dna浓度为1fg/μl，远远低于许多传统的检测方法，fg数量级已经微乎其微，因此不需要在进一步深究，这足以满足实际的检测需求。
附图说明
22.图1为赭鹿花菌分子身份证blast比对结果；
23.图2为赭鹿花菌分子身份证特异性验证电泳结果图，用赭鹿花菌及其他几个近缘物种进行了特异性验证。m：master，1：赭鹿花菌，2：鹿花菌，3：大鹿花菌，4：弹性马鞍菌，5：羊肚菌，6：波地钟菌，7：胶陀螺，8：粗柄马鞍菌，0：ddh2o；
24.图3为赭鹿花菌分子身份证适用性验证结果，其中1-4泳道是用赭鹿花菌分子身份证特异性引物扩增所得到的电泳结果m:master，1:赭鹿花菌，2：水煮后的赭鹿花菌，3：水煮过后赭鹿花菌和羊肚菌混合物，4：水煮后经过胃液处理的赭鹿花菌和羊肚菌混合物，0：ddh2o；5-8泳道是使用its通用引物扩增所得到的电泳结果；m:master，5:赭鹿花菌，6：水煮后的赭鹿花菌，7：水煮过后赭鹿花菌和羊肚菌混合物，8：水煮后经过胃液处理的赭鹿花菌和羊肚菌混合物，0：ddh2o；
25.图4为赭鹿花菌分子身份证灵敏度验证电泳结果，m:master，1:10ng/μl，2:1ng/μl，3:0.1ng/μl，4:0.01ng/μl，5:1pgμl，6:0.1pg/μl，7:0.01pg/μl，8:1fg/μl，0:ddh2o。
具体实施方式
26.本发明提供了一种赭鹿花菌分子身份证，赭鹿花菌分子身份证的核苷酸序列如seq id no:1(aatgtgcgctgtcacacgagtcatcacgcct)所示或与seq id no:1互补的序列。
27.本发明提供了一种特异性扩增所述赭鹿花菌分子身份证的引物，包括核苷酸序列如seq id no:2(gcagtaattcccgccatata)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:3(acgggactctaactctatcc)所示的反向引物。
28.本发明提供了一种鉴定赭鹿花菌的检测试剂盒，包括所述引物和检测试剂。
29.在本发明中，所述检测试剂优选包括pcr扩增用试剂。本发明对pcr扩增用试剂没有特殊限制，采用本领域所熟知的pcr扩增用试剂即可。在本发明实施例中，采用2
×
taq pcr master mix进行pcr扩增，购自上海生工生物工程有限公司。
30.在本发明中，所述检测试剂盒优选还包括阳性标准品。所述阳性标准品为所述赭鹿花菌分子身份证。
31.本发明提供了一种赭鹿花菌的物种鉴定方法，包括以下步骤：
32.1)提取待检测样本的基因组dna；
33.2)以步骤1)中所述基因组dna为模板，用所述引物进行pcr扩增，得到pcr产物；
34.3)将所述pcr产物进行电泳和测序，得到122bp的序列判断待检测样本为赭鹿花菌。
35.本发明提取待检测样本的基因组dna。
36.本发明对提取待检测样本的基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可，例如ctab法或试剂盒法。
37.提取后的基因组dna进行浓度和纯度检测后，调整浓度备用。
38.得到基因组dna后，本发明以所述基因组dna为模板，用所述引物进行pcr扩增，得到pcr产物。
39.在本发明中，所述pcr扩增的反应体系总体系优选为25μl，包括12.5μl的2
×
taq pcr master mix12.5μl，2μm上游引物和2μm下游引物各1μl，2μl10ng/μldna模板，余量的ddh2o。pcr扩增的反应程序优选为94℃4min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，34个循环；72℃10min。本发明对所述pcr扩增的仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的pcr仪即可。
40.得到pcr产物后，本发明将所述pcr产物进行电泳和测序，得到122bp的序列判断待检测样本为赭鹿花菌。
41.本发明对电泳和测序的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的电泳和测序方法即可。所述pcr扩增产物在2％的琼脂糖凝胶进行电泳。在本发明实施例中，所述测序委托上海生工生物工程有限公司完成。测序后，得到的测序结果进行拼接，去除两端质量不好的区域，得到的拼接结果为pcr扩增序列。将所述pcr扩增序列与所述赭鹿花菌分子身份证进行比对，得到序列相似度100％的的序列判断待检测样本为赭鹿花菌，反之不属于述赭鹿花菌。
42.本发明提供了所述赭鹿花菌分子身份证、所述引物或所述检测试剂盒在鉴别赭鹿花菌和近缘种中的应用。
43.在本发明中，所述近缘种优选包括以下一种或几种：鹿花菌、大鹿花菌、弹性马鞍菌、羊肚菌、波地钟菌、胶陀螺和粗柄马鞍菌。
44.在本发明实施例中，将赭鹿花菌和所述近缘种分别采用seq id no:2和seq id no:3所述引物进行扩增，扩增序列若含有赭鹿花菌分子身份证，则判断待测样本为赭鹿花菌，而近缘种无法扩增得到赭鹿花菌分子身份证。
45.下面结合实施例对本发明提供的一种赭鹿花菌分子身份证及其扩增引物、检测试剂盒和物种鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
46.实施例1
47.一种赭鹿花菌分子身份证的筛选方法
48.1.实验材料
49.本研究所使用的共8个蘑菇样品名称见表1。蘑菇样品均采自野外，以干标本的形式保存在吉林农业大学菌物标本馆(hmjau)内。所有样品都基于准确的形态学鉴定基础上进行了分子生物学验证其物种的真实性。
50.表1赭鹿花菌分子身份证所用到的蘑菇样品
[0051][0052][0053]
2.实验方法
[0054]
2.1dna提取、pcr扩增和sanger测序
[0055]
所有样品取10mg左右放置1.5ml的离心管加上2～3粒钢珠经过液氮干燥研磨成粉，然后根据说明书采用dna secure新型植物基因组dna提取试剂盒(tiagen，中国)进行总基因组dna的提取。dna的浓度和纯度采用nanodrop 2000超微分光光度计进行测量。测量后将dna的浓度稀释到10ng/μl进行下一步的研究。
[0056]
采用its1f/its4的通用引物(gardes m et al,1993)对8个蘑菇在pcr热循环仪中进行pcr扩增，其中pcr混合物包括12.5μl的2
×
taq master混合，两个引物各1μl，2μl的dna模板和8.5μl的ddh2o总体积为25μl。采用的its的扩增条件是在94℃下初始变性4min，然后30-34个循环，94℃40s，55℃40s，72℃50s，最后在72℃下延伸10min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳。结束后将其送到上海生工生物工程有限公司进行双向测序。
[0057]
将测序所获得双向序列使用软件sequencher 5.4.5进行拼接并去除掉两端质量不好的区域，最后对照序列色谱图逐一核查碱基的真实性，确保序列准确。
[0058]
赭鹿花菌分子身份证建立从ncbi genbank数据库下载鹿花菌属所有物种的its基因序列，使用aliview软件进行序列比对。寻找赭鹿花菌序列的特异性snp位点，选取含有
snp位点的赭鹿花菌序列为待定分子身份证，然后登录ncbi genbank数据库将含有snp位点的赭鹿花菌序列进行blast分析比对，若ncbi-blast上比对的结果为序列的相似度和覆盖度均为100％，则该序列可以定义为赭鹿花菌的分子身份证(图1)。
[0059]
在鹿花菌属近缘物种的its序列比对结果中发现，赭鹿花菌的特异性snp位点是位于序列第24位的“t”碱基，因此基于该snp位点，构建的赭鹿花菌分子身份证的序列为：aatgtgcgctgtcacacgagtcatcacg cct，长度为31bp。
[0060]
实施例2
[0061]
赭鹿花菌分子身份证的扩增引物设计及特异性验证
[0062]
选取赭鹿花菌its序列上包括分子身份证的一部分，使用ncbi的“primer-blast”进行引物设计，并对所设计引物的特性(发夹结构、引物二聚体、退火温度等)进行分析和综合评价，将所设计的引物通过ncbi的“primer-blast”在理论上进行特异性验证，再通过实验进行验证最终确定了一对性能最佳的引物序列，详情见表3。
[0063]
表3赭鹿花菌分子身份证特异性引物
[0064][0065]
赭鹿花菌分子身份证特异性验证
[0066]
为了验证赭鹿花菌分子身份证的特异性，设置1个阳性对照(赭鹿花菌)，7个阴性对照(包括赭鹿花菌的近缘物种、形态相近的易混种，物种信息见表2)和1个空白对照(ddh2o)进行pcr扩增反应。赭鹿花菌分子身份证的pcr反应总体系为25μl，其中包括12.5μl的2
×
taq pcr mastermix 12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，2μl的dna模板浓度为10ng/μl，最后用ddh2o补足至25μl。该反应的pcr扩增程序为94℃4min，(94℃40s，55℃30s，72℃30s)34个循环，最后在72℃下延伸10min，4℃保存。扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
[0067]
表2赭鹿花菌分子身份证特异性验证所用到的蘑菇样品
[0068][0069]
[0070]
特异性验证结果见图2所示。电泳结果显示只有赭鹿花菌泳道的条带单一明亮(如图2所示)，且都扩增出来的目的基因片段长度为122bp左右，这说明本研究所设计的赭鹿花菌分子身份证引物具有良好的特异性。
[0071]
实施例3
[0072]
赭鹿花菌分子身份证适用性验证
[0073]
为了进一步验证赭鹿花菌分子身份证引物的适用性，将模拟蘑菇加工和人体消化的过程对水煮后和胃液消化过的赭鹿花菌及其赭鹿花菌混合物(赭鹿花菌和羊肚菌制成)进行验证。其中人工胃液是由0.05g氯化钾，0.42g氯化钠和0.32g胃蛋白酶组成，并用去离子水定容至100ml。用2mol/l的盐酸来调节ph至3.0左右(minekus et al,2014)。称取蘑菇干样品10mg至于离心管中加温水泡发1h后至于100℃水浴10min，水浴过后将离心管中的水倒掉换成人工胃液置于37℃中孵育4h。在进行dna提取和pcr扩增。分成两组进行pcr扩增，一组用its通用引物进行扩增，一组用赭鹿花菌分子身份证引物进行扩增。扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳验证。其中电泳电压为110v，电泳时间为25min。
[0074]
赭鹿花菌分子身份证引物适用性验证如图3所示。结果表明，将干蘑菇样品进行发泡后采用水煮和人工胃液消化进行处理，用its通用引物扩增的产物5号泳道未处理的赭鹿花菌的电泳条带单一明亮6、7、8号泳道均出现浅弱模糊的条带，经过测序没有得到完整的基因序列。这说明蒸煮和人工胃液消化处理会使样品的dna会发生一定程度的降解，无法的得到质量较好的基因序列，而用赭鹿花菌分子身份证特异性引物，无论是处理过的样品还是未处理过的蘑菇样品在电泳图上均可以看到单一且明亮的条带。产物长度在100bp-200bp之间。将扩增产物切胶回收后进行测序，可以得到赭鹿花菌的分子身份证序列，这表明本研究所设计的赭鹿花菌分子身份证特异性引物可以针对dna降解严重的样品可以进行有效鉴定。
[0075]
实施例4
[0076]
赭鹿花菌分子身份证灵敏度验证
[0077]
为了验证本研究所设计的赭鹿花菌分子身份证引物的灵敏度，使用灭菌去离子水对赭鹿花菌dna原液进行10倍梯度稀释。然后对不同稀释倍数的赭鹿花菌dna原液使用min-f/min-r进行pcr扩增反应，反应的体系和反应条件不变，扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
[0078]
灵敏度验证电泳结果见图4所示。如图4所示，1-8号泳道均出现单一明亮的条带，赭鹿花菌分子身份证特异性pcr扩增的检出限为1fg/μl。这远远低于许多传统的检测方法，fg数量级已经微乎其微，因此不需要在进一步深究，这足以满足实际的检测需求。证明本研究设计的赭鹿花菌分子身份证特异性引物灵敏度极高。
[0079]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。