一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台及制备方法

一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法
技术领域
1.本发明涉及登革病毒ns1基因片段(denv-ns1)的分子生物学检测领域，特别是一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法。


背景技术：

2.登革热(dengue fever,df)是一种经伊蚊传播的急性病毒性传染病，根据《中华人民共和国传染病防治法》规定，被列入乙类传染病，其所致感染病原为登革病毒(dengue virus,denv)。据who预计，每年有超过5000万人感染登革热，近25亿人面临感染风险，严重影响人类健康和经济发展。近年来，世界多国出现登革热疫情，发病率呈大幅度上升趋势，主要分布在东南亚、南美洲、非洲及东、西太平洋等地区。最近几年，我国多个省份如广东、云南、广西、福建、台湾和海南陆续发生登革热疫情。由于登革热发病早期无典型症状，疾病特征信息与其他发热疾病区别不明显，如诊治不当，严重者可导致死亡。目前尚无有效的疫苗可对登革热进行预防，因此对其早发现、早诊断、早治疗，提高治愈率，减轻患者痛苦及经济负担起到至关重要的作用。因此，开发一种简单、高灵敏、高特异性的分析方法来诊断denv具有非常重要的意义。denv是继黄热病毒后，于1903年被证实的第二个人类蚊媒病毒。分别在上世纪40年代中期和80年代中后期，先后分离出了4种血清型denv及完成全基因组序列的测定。denv属于黄病毒科黄病毒属，近似二十面体对称的多层足球状结构。由外至内，依次为包膜蛋白(e蛋白)，膜蛋白(m蛋白)、衣壳蛋白(c蛋白)和rna基因组。denv rna基因组长度约为10.6kb，包括四个区，5
′
端非编码区、结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区和3
′
端非编码区。非结构蛋白(包括7个，分别是ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)在denv传染人时起到重要作用，ns1蛋白由denv感染的细胞分泌产生，可作为denv感染的标志性抗原。目前，denv临床实验室检测主要包括分离培养法、血清免疫学方法和分子生物学方法。分离培养法检测对象为denv病原，血清学免疫学方法检测对象为denv抗原或抗体，分子生物学方法检测对象为denv核酸。分离培养法由于培养条件苛刻，实际应用较少；血清学免疫学方法需要制备相应抗原抗体，周期长。常用的分子生物学方法需要昂贵的检测仪器、专业的技术人员和严格实验室，不便于大范围推广。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法，检测成本低，无需复杂昂贵的大型仪器及专业人员即可实现裸眼对denv-ns1核酸检测，可用于denv感染筛查。
4.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
5.一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台，所述裸眼检测平台包括杂交液与aunrs溶液；
6.所述杂交液是通过采用dna探针h1和h2对denv-ns1序列进行杂交链式反应得到杂交反应液；向杂交反应液加入捕获探针、信号放大探针以及底物显色液；对杂交反应液进行
反应终止操作得到的；
7.所述aunrs溶液是通过向种子生长液中加入种子溶液搅拌均匀、孵育并纯化得到的；
8.所述裸眼检测平台在使用时采用aunrs溶液对杂交液进行aunrs蚀刻并观察结果。
9.进一步，所述裸眼检测平台在使用时取杂交液加入酶标板中，100μl/每孔，再加入aunrs溶液，100μl/每孔，37℃孵育10min，裸眼观察和拍照记录实验结果。
10.一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台的制备方法，包括杂交液的制备方法与aunrs溶液的制备方法；
11.所述杂交液的制备方法包括以下步骤：
12.s01：采用dna探针h1和h2对denv-ns1序列进行杂交链式反应得到杂交反应液；
13.s02：向杂交反应液加入捕获探针、信号放大探针以及底物显色液；
14.s03：对杂交反应液进行反应终止操作得到杂交液；
15.所述aunrs溶液的制备方法包括以下步骤：
16.(1)制备种子液与种子生长液；
17.(2)所述种子生长液中加入种子溶液搅拌均匀并孵育得到aunrs溶液；
18.(3)对aunrs溶液进行纯化。
19.进一步，所述捕获探针为磁性纳米颗粒-链霉亲和素捕获探针(mbs-sa)。
20.进一步，所述信号放大探针为辣根过氧化物酶-链霉亲和素信号放大探针(hrp-sa)；
21.进一步，所述底物显色液为elisa底物显示液，所述elisa底物显示液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物溶液；所述底物显色液中tmb浓度为250μg/ml。
22.进一步，所述步骤s03的反应终止操作是向杂交反应液加入终止液；
23.所述终止液为elisa终止液，所述elisa终止液为2m硫酸溶液。
24.进一步，所述种子液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入氯金酸(haucl4)溶液以及硼氢化钠溶液制得的。
25.进一步，所述种子生长液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入5-溴水杨酸溶液、硝酸银(agno3)溶液、氯金酸(haucl4)溶液以及抗坏血酸(aa)溶液制得的。
26.进一步，所述步骤(2)中孵育得到的aunrs溶液为酒红色溶液。
27.本发明的有益效果是：
28.一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法解决了检测过程中存在依赖大型仪器、高成本、需专业人员检测等问题，其检测成本低，无需复杂昂贵的大型仪器及专业人员即可实现裸眼对denv-ns1核酸检测，可用于登革病毒感染筛查。
附图说明
29.图1是本发明的检测原理示意图；
30.图2是实施例二的裸眼检测结果图；
31.图3是实施例三的裸眼检测结果图。
具体实施方式
32.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
33.需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。下述所涉及的实施方案如若无特殊指明，均为常规方法。下述实施方案所涉及的材料、试剂等，若无特殊说明，可从商业途径获取。
34.实施例一：
35.如图1所示，一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台，所述裸眼检测平台包括杂交液与aunrs溶液；
36.所述杂交液是通过采用dna探针h1和h2对denv-ns1序列进行杂交链式反应得到杂交反应液；向杂交反应液加入捕获探针、信号放大探针以及底物显色液；对杂交反应液进行反应终止操作得到的；
37.所述aunrs溶液是通过向种子生长液中加入种子溶液搅拌均匀、孵育并纯化得到的；
38.所述裸眼检测平台在使用时采用aunrs溶液对杂交液进行aunrs蚀刻并观察结果。
39.所述dna探针h1和h2为发卡型生物素化dna探针h1和h2。
40.取离心管中的杂交液加入酶标板中，100μl/每孔，再加入aunrs溶液，100μl/每孔，37℃孵育10min，裸眼观察和拍照记录实验结果。
41.酶标板为elisa酶标板；酶标板的材质为聚苯乙烯微孔板。
42.一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台的制备方法，包括杂交液的制备方法与aunrs溶液的制备方法；
43.所述杂交液的制备方法包括以下步骤：
44.s01：采用dna探针h1和h2对denv-ns1序列进行杂交链式反应得到杂交反应液；
45.将dna探针h1和h2稀释后与denv-ns1序列进行杂交链式反应(hcr)；
46.将dna探针h1和h2用ph 8.0的te缓冲液稀释，稀释后的终浓度为1μm，按照100μl/每管，加入1.5ml的离心管中，再加入denv-ns1序列，室温下杂交40min得到杂交反应液。
47.s02：向杂交反应液加入捕获探针、信号放大探针以及底物显色液；
48.s0201：向杂交反应液加入捕获探针；
49.加捕获探针：取杂交反应液100μl加入新的1.5ml的离心管中，再加入捕获探针3μl，室温下静置15min。
50.洗涤：将离心管放置于磁力架上，吸出杂交反应液，用洗涤液洗涤离心管3次。
51.所述洗涤液为含0.1％的tween20，0.01m，ph为7.4的pbs缓冲液(pbst)；
52.所述捕获探针为磁性纳米颗粒-链霉亲和素捕获探针(mbs-sa)；
53.s0202：向杂交反应液加入信号放大探针；
54.加信号放大探针：取信号放大探针100μl，加入杂交反应液所在的离心管中，室温下静置15min。
55.洗涤：将离心管放置于磁力架上，吸出杂交反应液，洗涤3次。
56.所述信号放大探针为辣根过氧化物酶-链霉亲和素信号放大探针(hrp-sa)；
57.s02003：向杂交反应液加入底物显色液；
58.向杂交反应液所在的离心管中加入底物显色液100μl，室温下静置10min。
59.底物显色液为elisa底物显示液，elisa底物显示液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物溶液；底物显色液中tmb浓度为250μg/ml。
60.s03：对杂交反应液进行反应终止操作得到杂交液；
61.向杂交反应液所在的离心管中加入终止液；
62.终止液为elisa终止液，elisa终止液为2m硫酸溶液，终止液的加入量为50μl/每管。
63.所述aunrs溶液的制备方法包括以下步骤：
64.(1)制备种子液与种子生长液；
65.制备种子液：
66.十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入氯金酸(haucl4)溶液以及硼氢化钠溶液；
67.在锥形瓶中，加入十六烷基三甲基溴化铵(ctab)加热充分溶解得到十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液，然后加入适量氯金酸(haucl4)溶液，搅拌混匀，将量取的硼氢化钠溶液混入，溶液逐渐变成金黄色，再继续搅拌5min，37℃水浴中静置30min，待种子液变为茶褐色即可使用；
68.制备种子液时，氯金酸溶液中的氯金酸与ctab溶液中的ctab的摩尔比为1:500；氯金酸溶液中氯金酸与硼氢化钠溶液中的硼氢化钠的摩尔比为1:20。
69.制备种子液时，氯金酸溶液的摩尔浓度为0.5mmol/l；ctab溶液的摩尔浓度为0.2mol/l；硼氢化钠溶液的摩尔浓度为0.01mol/l。
70.加入的硼氢化钠溶液，为冰水新鲜配置的硼氢化钠溶液，温度不可过高。
71.制备种子生长液：
72.十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入5-溴水杨酸溶液、硝酸银(agno3)溶液、氯金酸(haucl4)溶液以及抗坏血酸(aa)溶液。
73.在500ml烧杯中，加入十六烷基三甲基溴化铵(ctab)加热充分溶解得到ctab溶液后，混入5-溴水杨酸溶液，充分搅拌混匀，加入量取的硝酸银(agno3)溶液混匀后，加入配备好的氯金酸(haucl4)溶液混匀，颜色逐渐变为金黄色后，加入新鲜配制的抗坏血酸(aa)溶液，混匀60s溶液颜色由橘红色变成无色。
74.在所述种子生长液的制备中，氯金酸溶液的摩尔浓度为1mmol/l；ctab溶液的摩尔浓度为0.09mol/l；5-溴水杨酸溶液的摩尔浓度为0.02mol/l；抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.060mol/l；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为0.004mol/l。
75.所述种子生长液中氯金酸与ctab、硝酸银、抗坏血酸、5-溴水杨酸的最终摩尔比大致分别为1:90、1:4、1:60、1:20。
76.(2)所述种子生长液中加入种子溶液搅拌均匀并孵育得到aunrs溶液；
77.所述种子生长液中加入种子溶液，继续搅拌1min～2min，再放入37℃温箱中静置12h，得到酒红色溶液，即为aunrs溶液；
78.(3)对aunrs溶液进行纯化。
79.将步骤(2)中制备得到的aunrs溶液通过高速离心纯化得到aunrs；离心纯化后用纯水定容至50ml。
80.高速离心纯化是在转速为12000rpm/min、温度为25℃下离心15min。
81.所述aunrs溶液(金纳米棒溶液)的特征吸收峰是横向吸收峰520nm左右，纵向吸收峰720nm左右。
82.一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法解决了检测过程中存在依赖大型仪器、高成本、需专业人员检测等问题，其检测成本低，无需复杂昂贵的大型仪器及专业人员即可实现裸眼对denv-ns1核酸检测，可用于denv感染筛查。
83.该检测方法特异性强、灵敏度高，裸眼检测范围2-40nmol/l；实现对denv浓度在2-40nmol/l进行半定量检测；操作简单、快速，适用于实时检测；易于快速筛查及在基层偏远和不发达地区使用进行现场快速筛查。
84.(1)合成一段denv-ns1靶序列，设计和合成两个靶序列的发夹引物(一个生物素化修饰)，基于杂交链式反应(hcr)，完成靶序列生物素化hcr扩增产物；
85.(2)利用磁珠链霉亲和素(mbs-sa)，构建识别生物素化hcr扩增产物的捕获探针；
86.(3)使用辣根过氧化物酶-链霉亲和素(hrp-sa)，作为结合生物素化hcr扩增产物的信号放大探针；
87.(4)将金纳米棒(aunrs)作为四甲基联苯胺(tmb)的显色纳米材料溶液，利用hrp催化tmb形成tmb
2
蚀刻aunrs显色得到可视化结果。aunrs具备特有的光学性质，当无色的tmb底物在遇到hrp以后被氧化成蓝色tmb
2
，加入终止液后，颜色变为黄色，在br-、酸性环境和ctab存在的情况下，tmb
2
可以使aunrs发生快速蚀刻，使溶液颜色发生肉眼可见的变化。
88.实施例二：
89.denv-ns1序列选用浓度分别为40nm、32nm、20nm、16nm、10nm、8nm、4nm、2nm、1nm和0nm的样品溶液denv-ns1-ia(5’agaaagtgaaaagaacgagacc 3’，苏州金唯智生物科技有限公司)。
90.采用实施例一的一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法依次对上述10份denv-ns1序列进行检测，完成对一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法的灵敏度测试，建立了登革病毒ns1基因片段快速裸眼检测标准曲线。
91.图2中，从左向右的10个酶标孔依次为上述10份从高到低浓度denv-ns1序列的检测结果。
92.从图2结果可以看出，不同denv-ns1-ia浓度反应产生不同颜色，浓度由高至低颜色变化依次分别为黄色
→
淡黄色
→
粉色
→
淡粉色
→
蓝色
→
淡蓝色
→
淡紫色
→
紫色
→
橘红色
→
酒红色，其中阴性对照未发生蚀刻反应，颜色无变化，由此可得裸眼检测效果可达到2nm，检测范围为2-40nmol/l。
93.实施例三：
94.denv-ns1序列依次选用随机序列(if)、单碱基错配序列(ib)、双碱基错配序列(ic)、单碱基缺失序列(id)、单碱基增加序列(ie)、阴性(加入等体积pbs缓冲液)和靶标序
列(ia)。
95.取6支1.5ml的离心管，每管分别加入经hcr反应及其它步骤处理过的反应液，所采用的denv-ns1序列依次为浓度为16nm的单碱基错配序列ib、双碱基错配序列ic、单碱基缺失序列id、单碱基增加序列ie、随机序列if，其中阳性对照为靶标序列ia，将以上不同种类靶标序列以及阳性对照管，各取100μl，其它步骤采用实施例一的一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法依次进行检测，完成对一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法的特异性实验。
96.图3中，从左向右的7个酶标孔依次为上述7份denv-ns1序列(随机序列(if)、单碱基错配序列(ib)、双碱基错配序列(ic)、单碱基缺失序列(id)、单碱基增加序列(ie)、阴性(加入等体积pbs缓冲液)和靶标序列(ia)的检测结果。
97.结果如图3所示，只有加入碱基未变化的靶标序列ia的阳性对照孔存在颜色变化，可知该孔发生aunrs蚀刻现象。因此可以证明一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法对denv-ns1-ia具有很好的特异性。
98.以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。