一种固定化复合己酸菌及其制备方法和应用

1.本发明属于酿酒微生物及酿酒技术领域，具体涉及一种固定化复合己酸菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.己酸菌指一类经培养可以产己酸的微生物，是窖泥中重要的功能菌。浓香型白酒的特征香气物质是己酸乙酯，主要由窖泥中的己酸菌代谢生成的己酸与酵母代谢生成的乙醇经酯化反应生成的。窖泥中己酸菌的含量及产己酸能力决定着窖泥品质的好坏，影响着浓香型白酒的品质。应用己酸菌液进行窖池的养护或人工窖泥的培养，能够为窖泥补充高活性的己酸菌，提高窖泥的生物活性，进一步提高白酒品质。
3.使用传统液体游离培养，己酸菌的培养周期较长，己酸菌需要培养5-6天才能进入产酸期，产酸期约为3-4天。而且作用时间短、生产成本高。固定化微生物的培养技术，自上世纪八十年代兴起。具有培养速度快、周期短、成本低、工艺简单、能够重复利用等优势，被许多工厂应用以生产己酸菌液。
4.目前己酸菌固定化方法多采用琼脂、聚乙烯醇、海藻酸钠等物质作为固定化材料，固定化的己酸菌多为窖泥种子液或纯种己酸菌。如谢国排等人(“琼脂固定化窖泥己酸菌培养技术研究”，酿酒，2016年12月)公开了使用琼脂固定化克氏梭状杆菌产己酸的方法；钟国辉等人(“固定化己酸菌新材料研究报告”，酿酒，2009年3月)公开了使用聚乙烯醇(pva)包埋法和活性炭吸附法制备固定化己酸菌的方法，固定化菌株为克氏梭状芽孢杆菌；专利cn1033644(一种固定化已酸菌的制备及应用于浓香型曲酒酿制的新方法)公开了使用sio2、al2o3、fe2o3作为载体固定化己酸菌的方法；张捷(“己酸菌细胞固定化技术在浓香型白酒生产中的应用”，酿酒，1999年1月)公开了使用海藻酸钠作为载体制备固定化己酸菌的方法。但固定化的窖泥种子液菌群结构不明确，易受环境因素导致菌群结构失调，而且不同批次窖泥等所含菌群不一致导致不同批次固定化窖泥种子液效果不一。固定化纯种己酸菌的产己酸能力在窖池的应用过程中易受环境因素影响。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种固定化复合固体己酸菌的制备方法及应用。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.第一方面，本发明提供一种固定化复合己酸菌的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)纯种己酸菌液的制备：将己酸菌种子液按培养基5％-10％(v/v)的接种量接种于乙醇乙酸钠培养基内，装液量为80％-95％，33℃-35℃下静置培养5-7天；
9.(2)酵母菌液的制备：添加耐高温活性干酵母于ypd培养基内,恒温下摇床内培养，然后转接于ypd培养基相同条件下放大培养；
10.(3)复合己酸菌液的制备：将纯种己酸菌液与酵母菌液进行混合；
11.(4)吸附载体的制备：取杏鲍菇，切碎，洗净，灭菌即得；
12.(5)复合己酸菌的吸附：将处理好的吸附载体浸入制备好的复合己酸菌液，进行充分吸附；
13.(6)包埋液的制备：将琼脂溶于水中，加热融化，灭菌即得；
14.(7)将已吸附己酸菌的杏鲍菇载体均匀浸入包埋液中，凝固后得到固定化复合己酸菌。
15.进一步，所述步骤(1)中，所述己酸菌为速生梭菌jsj-1cctcc m 2020881。该葡萄糖抑制型耐氧己酸菌为专利zl202110311823.6公开的菌种，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc m 2020881，其分类命名c1ostridium celerecrescens jsj-01(保藏日期：2020年12月9日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学)。
16.进一步，所述步骤(1)中，培养己酸菌用的乙醇乙酸钠(es)培养基质量份的组成如下：酵母膏1-1.5份、无水乙酸钠0.3-0.6份、mgso4·
7h2o 0.02-0.04份，k2hpo
4 0.03-0.06份，(nh4)2so
4 0.03-0.06份，蒸馏水100份，然后无菌操作加入无水乙醇2-2.5份和干热灭菌后的caco
3 0-1.5份。
17.进一步，所述步骤(2)中，按5％(v/v)的接种量进行放大培养。
18.进一步，所述步骤(2)中，ypd培养基的质量份组成如下：酵母膏1份、蛋白胨2份、葡萄糖2份、蒸馏水100份。
19.进一步，所述步骤(2)中，干酵母的添加量为ypd培养基质量的0.05％-0.1％；培养温度为34℃，摇床转速为200r/min，培养时间为16h。
20.进一步，所述步骤(2)中，干酵母为安琪耐高温活性干酵母。
21.进一步，所述步骤(3)中，乙酸菌液与酵母菌液按体积比1:1.5-2进行混合。
22.进一步，所述步骤(4)中，杏鲍菇切成1-2cm3的方块。
23.进一步，所述步骤(4)中，灭菌为130-135℃下干热灭菌，灭菌时间为1-2h。
24.进一步，所述步骤(5)中，吸附载体质量与己酸菌液体积的比例为0.3-0.5g:10-12ml。
25.进一步，所述步骤(5)中，吸附温度为30-35℃，吸附时间为24-48h。
26.进一步，所述步骤(6)中，琼脂和水的质量比为1:14-16；灭菌温度为115℃，灭菌时间为15-20min。
27.进一步，所述步骤(7)中，凝固温度为20-25℃。
28.第二方面，本发明提供利用第一方面方法所制备的固定化复合己酸菌。
29.第三方面，本发明提供第二方面固定化复合己酸菌在发酵生产己酸中的应用。
30.进一步，固定化复合己酸菌在发酵产己酸方面的应用为将固定化复合己酸菌添加至含乙醇和有机酸的发酵体系中发酵产己酸。
31.第四方面，本发明提供第二方面固定化复合己酸菌在发酵生产浓香风味白酒中的应用。
32.进一步，固定化复合己酸菌在白酒酿造领域的应用指将固定化复合己酸菌或固定化复合己酸菌发酵液应用于培养人工窖泥、提高窖泥品质或无窖泥生产浓香风味白酒。
33.更进一步，固定化复合己酸菌生产培养人工窖泥通过以下步骤实现：选取质量较好的泥土，蒸煮后，加一定量水。然后加入es培养基，泥土质量3％-6％的固定化复合己酸菌
或固定化复合己酸菌发酵液，搅拌均匀后加保鲜膜密封，33-35℃下静置培养30-50天。
34.更进一步，固定化复合己酸菌应用于无窖泥生产浓香风味白酒通过以下步骤实现：将粮食清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后加入大曲和清蒸后的稻壳，按生粮质量的3％-8％加入制备好的固定化复合己酸菌(或固定化复合己酸菌发酵液)，密封进行发酵，固态发酵30-45天。将发酵结束的糟醅进行蒸馏得到无窖泥浓香风味白酒。
35.本发明具有以下有益效果：
36.(1)本发明采用吸附-包埋的复合固定化方法对己酸菌进行了固定。吸附时以杏鲍菇作为固定化材料，为己酸菌的细胞固定化提供了一种新的固定化载体。杏鲍菇吸水性及持水性强，能够很好地吸附菌液。另外，杏鲍菇结构致密，内部存在的多孔结构能够为微生物的生长提供空间。通过吸附作用，己酸菌能够被固定在杏鲍菇上。较游离细胞相比，固定化己酸菌也能够保护菌株不受外界环境的影响。杏鲍菇和己酸菌均为菌类，己酸菌在杏鲍菇载体上具有更好的结合力，更容易吸附，也不会被己酸菌降解。单一的吸附法菌株易流失，本发明在吸附法的基础上进一步使用琼脂进行包埋，固定化效果更好。对微生物无毒、固定化工艺简单、固定化效果好。
37.(2)本发明采用菌群结构明确的复合己酸菌液，对环境具有更强的适应性。复合己酸菌液为速生梭菌(c.celerecrescens)jsj-1与安琪耐高温酵母的混合液。速生梭菌(c.celerecrescens)jsj-1为一株高产、耐氧、葡萄糖抑制产己酸的己酸菌，与安琪耐高温酵母复配使用，能够缓解葡萄糖对c.celerecrescens jsj-1产己酸的抑制作用，且酵母利用葡萄糖生成的乙醇能够为c.celerecrescens jsj-1提供产己酸的底物乙醇。酵母为兼性厌氧的微生物，c.celerecrescens jsj-1为可耐受一定氧气的厌氧菌，酵母与c.celerecrescens jsj-1共存时酵母利用氧气能为c.celerecrescens jsj-1创造更有利的生存环境。
38.(3)本发明制备的固定化己复合酸菌可应用于发酵产己酸，也可以应用于白酒酿造，能够显著提高酒中己酸和己酸乙酯含量，效果稳定。
具体实施方式
39.下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
40.下述实施例中所述份数无特殊说明均为质量份。实施例所述葡萄糖抑制型耐氧己酸菌为专利zl202110311823.6公开的菌种，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc m 2020881，其分类命名c1ostridium celerecrescens jsj-01(保藏日期：2020年12月9日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学)。
41.实施例1
42.固定化复合己酸菌的制备
43.(1)纯种己酸菌液的制备：取1支c.celerecrescens jsj-1甘油管，按培养基的5％(v/v)接种到es培养基内(酵母膏1份、无水乙酸钠0.3份、mgso4·
7h2o 0.02份，k2hpo
4 0.04份，(nh4)2so
4 0.05份，蒸馏水100份，然后无菌操作加入无水乙醇2份和干热灭菌后的caco30.8份)，装液量为90％，34℃下静置培养5天。然后将其按培养基5％(v/v)的接种量接种到1000份的es培养基内，装液量为90％情况下34℃静置培养6天，己酸菌菌浓度达到
105cfu/ml。
44.(2)酵母菌液的制备：添加培养基质量0.05％-0.1％的安琪耐高温活性干酵母于ypd培养基内(酵母膏1份，蛋白胨2份，葡萄糖2份，水100份),于34℃、转速为200r/min的摇床内培养16h，然后按培养基5％(v/v)的接种量转接于ypd培养基相同条件下放大培养,此时酵母菌浓度约为107cfu/ml。
45.(3)复合己酸菌液的制备：将纯种己酸菌液与酵母菌液按体积比1:2进行混合。
46.(4)吸附载体的制备：取40份杏鲍菇切成1cm3左右的方块，洗净，在130℃下灭菌1.5h，备用。
47.(5)复合己酸菌的吸附：将处理好的吸附载体浸入制备好的复合己酸菌液，于35℃下静置吸附24h。
48.(6)包埋液的制备：向1份琼脂中加入15份的水，加热至融化，然后置于高压蒸汽灭菌锅内于115℃下灭菌20min。
49.(7)将灭菌后的琼脂液取出后冷却至70℃，在喷洒医用酒精消毒后的浅盘内倒入1/3的琼脂液，将吸附己酸菌后的杏鲍菇载体均匀洒入，然后将剩余琼脂液倾倒于浅盘内，在20℃下静置25min至凝固，用酒精消毒后的小刀切成小块，得到固定化复合己酸菌。
50.实施例2
51.应用固定化复合己酸菌生产己酸菌液
52.按实施例1制备固定化复合己酸菌，按质量0.5％的添加量加入到灭菌后的es培养基内，装液量为容积的90％，34℃下静置培养10天，测得发酵液中己酸含量为14.86g/l。
53.实施例3
54.应用固定化复合己酸菌生产无窖泥浓香风味白酒
55.(1)固定化复合己酸菌的制备：按实施例1的方式制备固定化复合己酸菌，不同的是，es培养基中酵母膏添加量为1.5份，无水乙酸钠为0.5份，无水乙醇为2.5份。
56.(2)高粱蒸煮：取1000份高粱，用水清洗6-7遍，然后放入70℃左右的热水中浸泡18h，然后用凉水清洗4-5次。将清洗后的高粱在127℃下蒸30min，然后在热水中浸泡30min左右，之后用121℃复蒸20min。
57.(3)拌曲：将蒸好的高粱摊凉至30℃，加入生粮质量约20％的中高温大曲、5％清蒸后的稻壳，拌匀。
58.(4)加固定化复合己酸菌：取600份拌好曲的原料加入30份固定化复合己酸菌，拌匀。在槽车底部铺入20份的固定化复合己酸菌，然后加入约200份拌曲后的原料，铺平。然后将拌好固定化复合己酸菌的原料加入，铺平后将剩余的拌曲后的原料装入。
59.(5)槽车发酵：用一层塑料薄膜将槽车顶部封好，置于26℃下发酵35天。
60.(6)入甑蒸馏：将发酵好的酒醅装入酒甑进行蒸馏，上甑时甑两边的物料要高于中间约1cm-2cm。接酒时“掐头去尾”，原酒度数低于50％vol时停止接酒。
61.(7)白酒香气成分检测：使用气相色谱法检测白酒中的己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯。
62.表1白酒中四大酯类物质含量检测
[0063][0064]
如表1所示，使用固定化复合己酸菌生产的无窖泥浓香风味白酒中己酸乙酯含量可达到1082.39mg/l。
[0065]
对比例1
[0066]
(1)高粱蒸煮：取1000份高粱，用水清洗6-7遍，然后放入70℃左右的热水中浸泡18h，然后用凉水清洗4-5次。将清洗后的高粱在127℃下蒸30min，然后在热水中浸泡30min左右，之后用127℃复蒸30min。
[0067]
(2)拌曲：将蒸好的高粱摊凉至30℃，加入生粮质量约20％的中高温大曲、5％清蒸后的稻壳，拌匀。
[0068]
(3)槽车发酵：将拌好酒曲、稻壳后的物料装入槽车，用一层塑料薄膜将槽车顶部封好，置于26℃下发酵35天。
[0069]
(4)入甑蒸馏：将发酵好的酒醅装入酒甑进行蒸馏，上甑时甑两边的物料要高于中间约1cm-2cm。接酒时“掐头去尾”，原酒度数低于50％vol时停止接酒。
[0070]
(5)白酒香气成分检测：使用气相色谱法检测白酒中的己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯。
[0071]
表2对照组获得白酒中四大酯类物质含量检测
[0072][0073]
如表2所示，对比例1中未添加固定化复合己酸菌，己酸乙酯含量仅为16.88mg/l。使用固定化复合己酸菌无窖泥生产浓香风味白酒，酒中己酸乙酯较对照组有显著提升，己酸乙酯含量增加了1065.51mg/l。
[0074]
实施例4
[0075]
应用固定化复合己酸菌制备人工窖泥
[0076]
按实施例1的方式制备固定化复合己酸菌。
[0077]
选取1000份藕塘泥，加水至含水量为40％左右，放入蒸锅蒸120min。然后加入es培养基(酵母膏10份、无水乙酸钠5份、mgso4·
7h2o0.2份，k2hpo
4 0.5份，(nh4)2so
4 0.5份，无水乙醇20份和caco310份)和固定化复合己酸菌50份，混合均匀，用封口膜密封。在34℃下静置培养30天，每10天取样检测一次。
[0078]
表3窖泥培养过程中ph与丁酸、己酸含量的变化趋势
[0079][0080]
如表3所示，使用固定化复合己酸菌培养窖泥，第10天开始合成丁酸和己酸，培养
第30天己酸含量达到4.23g/l。
[0081]
将培养好的窖泥涂到槽车底部及四周，其余步骤与对比例1相同，将获得的白酒使用气相色谱进行检测。
[0082]
表4人工窖泥槽车发酵白酒中四大酯类物质含量
[0083][0084]
如表4所示，使用培养好的固定化复合己酸菌培养人工窖泥，人工窖泥培养好后涂布至槽车堆糟发酵后获得的白酒中己酸乙酯含量为2135.14mg/l，而对比例1中同样条件下在未涂布窖泥的槽车中发酵获得的白酒己酸乙酯含量仅为16.88mg/l。
[0085]
实施例5
[0086]
将实施例1中固定化复合己酸菌产己酸效果与复合己酸菌游离培养和利用琼脂法制备的复合己酸菌的产己酸效果进行对比。
[0087]
游离培养：按实施例1的方式将复合己酸菌液按培养基5％(v/v)的接种量直接接种到es培养基内培养10天，定期取样检测己酸。
[0088]
琼脂法固定复合己酸菌：按实施例1的方式制备好复合己酸菌液。向1份琼脂中加入15份的水，加热至融化，然后置于高压蒸汽灭菌锅内于115℃下灭菌20min。将灭菌后的琼脂液取出后冷却至70℃，将制备好的复合己酸菌液与琼脂液混合均匀，倒入医用酒精消毒后的浅盘内，在20℃下静置25min至凝固，用酒精消毒后的小刀切成小块，得到琼脂法固定复合己酸菌。将琼脂法固定的复合己酸菌按质量0.5％的添加量加入到es培养基培养10天，定期取样检测己酸。
[0089]
3种条件下的产己酸效果如下表所示。
[0090]
表1产己酸效果对比
[0091][0092]
与游离法培养己酸菌相比，固定化己酸的产酸效果更好，己酸的生成时间大大提前，本发明的固定化复合己酸菌培养5天便接近游离培养10天的己酸产量。并且固定化己酸菌培养时，己酸的最高产量较游离培养有显著提升。游离培养时，游离细胞直接与代谢产物接触，己酸大量积累对细胞有较强的抑制作用。本发明的固定化复合己酸菌经培养产己酸时，细胞被固定在载体内，在一定程度上能够保护己酸菌不受外界环境的干扰。
[0093]
与使用琼脂法直接包埋制备的固定化复合己酸菌相比，本发明的杏鲍菇吸附与琼脂法包埋相结合制备的固定化己酸菌产酸效果更好，己酸产量更高。
[0094]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。