用于梅花鹿亲子鉴定和个体识别的分子标记、引物及应用

1.本发明属于动物亲子鉴定及个体识别领域，具体涉及到一种用于梅花鹿亲子鉴定和个体识别的分子标记、引物及应用。


背景技术：

2.梅花鹿(cervusnippon)，属哺乳纲(mammalia)、偶蹄目(artiodactyla)、鹿科(cervidae)、鹿属(cervus)。目前中国境内有6个梅花鹿亚种，包括台湾亚种、东北亚种、华北亚种、山西亚种、四川亚种和华南亚种。我国梅花鹿驯养历史悠久，丰富的梅花鹿资源为早期的捕捉驯化提供了条件，最早可追溯到公元前的商朝时期，人工养殖也有300余年的历史，中国饲养的梅花鹿主要来源于东北亚种。据相关数据显示，我国现在饲养梅花鹿总量约为110万头，吉林省养殖数量最多，饲养量约占全国的50％。经过多年的人工培育，已通过国家畜禽委员会鉴定的梅花鹿有7个品种和一个品系，分别为敖东梅花鹿、四平梅花鹿、东丰梅花鹿、兴凯湖梅花鹿、双阳梅花鹿、东大梅花鹿、西丰梅花鹿和长白山梅花鹿培育品系。
3.梅花鹿育种工作都是在一些基层单位进行，存在缺少专业指导、缺乏育种资料记录和系谱记录不清的问题。养殖企业为了进一步提高鹿的生产能力，盲目引进其他品种血源，导致品种间无序杂交，这已威胁到种质资源的安全和后续的梅花鹿育种工作。
4.梅花鹿亲子鉴定和个体识别技术的开发与应用，可以纠正系谱错误，辅助建立完整的系谱档案，对梅花鹿的科学选种保种、品种改良及配种计划的制定等具有重要意义。目前在人类和其他家畜的亲子鉴定和个体识别研究中，微卫星分子标记技术是应用最多的。
5.微卫星又称为短串联重复序列或简单重复序列(simple sequence repeats,ssr)，由1～6个核苷酸为基本重复单元的核心序列及其两侧的保守侧翼序列构成，均匀分布于整个基因组中。微卫星标记的多态性在于核心序列，核心序列重复次数越多，对应的微卫星位点变异性就越强，等位基因数就越多。重复序列两侧的保守序列是微卫星特异性的体现，常常用来设计引物。微卫星作为理想的分子标记，具有以下特点：(1)丰富度高，微卫星在基因组中分布广泛、数量丰富，大约平均每5～10kb就存在1个微卫星。人类基因组中存在100万个微卫星位点，大约占到基因组总量3％；(2)呈共显性遗传，符合孟德尔遗传定律，能够较容易区分纯合基因和杂合基因；(3)多态性程度高，微卫星重复次数越多，越容易突变，具有的多态性就越高，而且四碱基重复微卫星突变率比二碱基微卫星更高；(4)所需dna的量少，对dna质量要求较低。微卫星可以利用不同来源的dna样品，如粪便、毛皮、毛发、组织等易降解或已降解的样品均可以采用微卫星进行分析；(5)由于微卫星侧翼序列相对保守，具有一定的通用性，可应用于近缘物种的扩增。此外，微卫星标记还具有分型简单、操作便捷、应用成本相对低等特点，因此，微卫星在探究群体遗传多样性、遗传图谱构建、亲缘关系鉴定及标记辅助育种等研究中广泛应用。
6.目前国内已有的鹿科动物的亲子鉴定研究方法是基于简化基因组测序的原始数据筛选到的10个高多态性微卫星位点，10个位点中6个是二碱基重复、4个是四碱基重复，在扩增重复单元为二碱基或三碱基重复时，除pcr产物主带以外还会出现比主带小的影子带，
它的存在使微卫星位点的等位基因的正确读取复杂化，易读取出不存在的等位基因。所以，现有的梅花鹿亲子鉴定方法不利于等位基因分型，在双亲基因型均未知的情况下累计排除概率仅为95.45％，远低于国际亲子鉴定通用值0.9973，不能满足实际应用。


技术实现要素：

7.鉴于上述梅花鹿亲子鉴定中存在的问题，本发明对梅花鹿分子标记做了更深入的研究，开发了一组更好的高多态性位点。本发明的16个高多态性位点，包括15个四碱基重复位点和1个六碱基重复位点。本发明能够彻底解决目前梅花鹿亲子鉴定方法存在的不能精准鉴定的问题，充分满足实际检测的需要。
8.本发明，首先，提供了一组用于梅花鹿亲子鉴定和个体识别的ssr标记，所述ssr标记位点信息如下：
9.表1 16个微卫星位点信息
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本发明还提供用于梅花鹿亲子鉴定和个体识别的引物组，包括16对引物对，所述引物对序列分别如seq id no.1-32所示；所述引物组用于扩增权利要求1所述ssr标记。所述引物5’端带有荧光标记(fam、hex、tamrad和rox)，引物具体信息如表2。
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表2 16个微卫星引物信息
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本发明还提供一种梅花鹿亲子鉴定或个体识别的方法，利用表2中的部分或全部作为引物，以梅花鹿基因组dna作为模板分别进行荧光引物pcr反应，获得带荧光的pcr产物，然后再进行毛细管电泳、基因分型，判断样本之间是否为亲子关系或是否来源于同一个体。
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进一步地，本发明还提供一种用于梅花鹿亲子鉴定和/或个体识别的试剂盒，所述试剂盒包括表2中的引物组。
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更进一步地，本发明还提供上述用于梅花鹿亲子鉴定和/或个体识别的试剂盒的使用方法，当待鉴定的两个亲本基因型均已知的情况下，可以用5-16对引物进行鉴定；所述5对引物为扩增mhl06、mhl25、mhl44、mhl30、mhl58位点的引物；所述方法当待鉴定的两个亲本基因型均已知的情况下，cpe-p》99.99％。
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当待鉴定的两个亲本其中一方基因型已知的情况下，可以用9-16对引物进行鉴定：所述9对引物为扩增mhl06、mhl25、mhl44、mhl30、mhl58、mhl02、mhl03、mhl84、mhl34位点的引物；所述方法，当待鉴定的两个亲本其中一方基因型已知的情况下，cpe-2》99.99％。
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当两个亲本基因型均未知的情况下，用全部16对引物进行亲子鉴定，cpe-1》99.98％。
[0021]
当用于梅花鹿个体识别时，可以采用5-8对引物对；所述5对引物为扩增mhl06、mhl25、mhl44、mhl30和mhl58这5个位点的引物对；当采用5对引物对时，pid《0.000001，pid(sib)为0.004446，可达到梅花鹿个体识别所需最少位点数；
[0022]
所述8对引物为扩增mhl02、mhl03、mhl06、mhl25、mhl30、mhl44、mhl58、mhl84这8个位点的引物对；当采用8对引物对时，累计个体识别率大于99.99％，累计全同胞识别率大于99.97％。
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有益效果：
[0024]
1、本发明基于全基因组筛选得到高多态性微卫星位点及其微卫星引物，用于梅花鹿亲子鉴定和个体识别。本发明包括15个四碱基重复位点和1个六碱基重复位点，研究表明随着重复单元碱基数的增加，pcr产物的主带以外的影子带会逐渐减少，多态性的区分会变得更加明显，基因分型结果更准确。本发明16个高多态性位点的多态信息含量在0.645～0.892之间，平均为0.7428，当所用位点数为16个时，三种结合排除概率分别为；0.999824、0.999999、大于0.999999，均大于国际亲子鉴定的通用值0.9973。
[0025]
2、本发明实际应用范围更广。本发明为提高微卫星引物的准确率和实用性，在验证引物时采集多个梅花鹿品种血样进行验证，充分证明了本发明引物的普遍适用性。可以在多个梅花鹿品种中使用，拓展了其应用范围。
[0026]
3、本发明应用于梅花鹿个体识别时，只需要5-8对引物即可，极大提高检测效率和节约成本。
[0027]
4、本发明具有实际应用价值。本发明所选的微卫星标记可提供的遗传信息丰富，位点组合具有很高的结合排除率，应用于亲子鉴定和个体识别工作，能够获得精准的结果。有助于在实际生产中构建系谱和明确家系，为梅花鹿选种育种提供依据。
附图说明
[0028]
图1为本发明16个ssr标记位点在染色体上的分布图。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所涉及的方法，如无特殊说明均为本领域常用方法，所涉及的试剂，如无特殊说明均可以从商业途径获得。
[0030]
实施例1、用于梅花鹿基因组的ssr标记的获得
[0031]
基于136个梅花鹿全基因组序列(基因组重测序数据由本实验室前期测得，梅花鹿基因组数据已上传gsa数据库)多态性微卫星位点的筛选步骤如下：
[0032]
(1)用misa软件识别到354766个微卫星位点；
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(2)用trf软件共识别到419115个微卫星位点；
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(3)对(1)(2)两个软件识别到的微卫星位点取交集，共得到61621个微卫星位点；
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(4)筛选重复单元碱基数为4、5和6且重复次数大于等于4的位点，共得到11258个微卫星位点；
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(5)去除染色体双末端位点，剩余微卫星位点8915个；
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(6)使用hip-str软件对实验室前期获得的136个梅花鹿基因组重测序数据进行str检测并计算多态信息含量，保留多态信息含量大于0.7的位点，再根据染色体均匀分布原则进行筛选，共得到198个位点；
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(7)去除重复序列包含连续3个及3个以上碱基重复(如ttta)的位点，剩余143个微卫星位点；
[0039]
(8)结合上述获得的143位点和本课题组cn201710599880.2基于梅花鹿全基因组开发的str分子标记及其应用中的31个微卫星位点，从上述获得位点中选取均匀分布在不同染色体上的88个微卫星位点，用网络版primer3(http://primer3.ut.ee)设计引物。
[0040]
(9)88对引物中筛选出42对扩增条带清晰的引物，且扩增片段大小与目标片段一致。
[0041]
(10)用扩增效果良好的42对引物，对240个梅花鹿样本进行扩增、毛细管电泳分型。分型所得数据通过excel整理，人工矫正后，导入软件cervus3.0.7用allele frequencyanalysis程序，计算各个标记的多态信息含量、期望杂合度、观测杂合度和等位基因数，结果显示21个位点具有高度多态性(pic》0.5)，能够提供丰富的遗传信息。
[0042]
(11)将所得到的21个多态性位点按照pic降序排列后，依次计算三种结合排除概率，如表3所示。当位点数为5个时，结合排除概率3(cpe-p)》99.99％，即当两个亲本基因型均已知的情况下，就可以用这5个位点进行亲子鉴定；当位点数为9个时，结合排除概率2(cpe-2)》99.99％，即当两个亲本其中一方基因型已知的情况下，就可以用这9个位点进行亲子鉴定；当位点数为16个时，结合排除概率1(cpe-1)达到99.98％以上，在两个亲本基因型均未知的情况下，可用16个微卫星位点进行亲子鉴定分析。最终本发明选择了表1所示的16个微卫星位点，前述表1中列出了16个微卫星位点在染色体上的具体位置信息，包括重复碱基次数及重复的具体碱基，图1为16个微卫星位点在染色体上的分布图。
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表3 16个微卫星位点的结合排除概率分析结果
[0044]
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实施例2、梅花鹿亲子鉴定str标记的验证
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1引物合成
[0048]
合成用于梅花鹿亲子鉴定的16对微卫星引物，引物5’端带不同荧光标记(fam、hex、tamrad和rox)，引物具体信息如前述表2。
[0049]
2基因组dna提取
[0050]
采集具有人工系谱记录的103对亲子关系的梅花鹿血样(10ml/个)，使用高通量磁珠核酸提取仪提取血液基因组dna，用超微量分光光度计测定其浓度和纯度，合格后置于-20℃冰箱保存。
[0051]
3pcr扩增
[0052]
以梅花鹿基因组为模板，将上述16对引物进行pcr扩增，以建立梅花鹿亲子鉴定方法，pcr扩增条件如表4。
[0053]
表4 pcr扩增条件
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pcr反应体系如表5。
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表5 pcr体系
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4毛细管电泳基因分型
[0059]
利用cervus3.0.7软件中的simulation of parentage analysis功能进行父本鉴定模拟，设模拟子代数量为10000，在只有父本基因型的情况下，宽松(80％)和严格(95％)置信度下的匹配数均为9966，匹配比例达到99.66％；在母本基因型已知，进行父本匹配时，宽松(80％)和严格(95％)置信度下的匹配数均为9998，匹配比例达到99.98％。由此结果可知，这16个微卫星位点可用于后续的亲子鉴定，且鉴定结果可靠。继而用parentage analysis功能进行左家梅花鹿养殖场父本鉴别，结果如表6所示，左家梅花鹿养殖场的103只仔鹿均匹配到最佳父本，错配位点数≤1，匹配率达到100％。由此表明本发明的16对微卫星引物可用于梅花鹿亲子鉴定。
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表6子代父本鉴定结果
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注：亲子关系分配的置信度中，*表示严格的置信度
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实施例3、梅花鹿个体识别ssr标记的验证
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1基因组dna提取
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采集试验样本共50头梅花鹿个体，其中26头梅花鹿血样和新鲜茸皮样本，血液样本与茸皮样本编号对应；另外24头梅花鹿取血液和毛囊样本，24份毛囊样本随机编号为zj-1到zj-24。所有样本均来自中国农业科学院特产研究所国家级吉林梅花鹿种质资源保种场，使用天根生物科技有限公司微量样品基因组dna提取试剂盒(dp316)提取梅花鹿毛囊和茸皮基因组dna，操作步骤按照试剂盒说明书进行，用超微量分光光度计测定其浓度和纯度，合格后置于-20℃冰箱保存。
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2引物合成
[0071]
合成用于梅花鹿亲子鉴定的8对微卫星引物，引物5’端带不同荧光标记(fam、hex、tamrad和rox)，所述8对引物分别为扩增mhl02、mhl03、mhl06、mhl25、mhl30、mhl44、mhl58、mhl84位点的引物，引物具体信息如表2所示。
[0072]
3pcr扩增
[0073]
以梅花鹿基因组为模板，将上述8对引物进行pcr扩增，以建立梅花鹿个体识别方法，pcr扩增条件如表7。pcr扩增产物避光低温送至生工生物工程(上海)股份有限公司，用abi3730xl测序仪进行毛细管电泳基因分型，所得数据excel整理后用软件cervus3.0.7进行个体识别分析。
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表7 pcr扩增条件
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pcr反应体系如表8。
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表8 pcr体系
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4毛细管电泳基因分型
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利用上述微卫星位点基因分型数据，通过cervus3.0.7软件中的identity analysis功能进行个体识别鉴定。用5个位点对26只梅花鹿及其对应茸皮样本识别结果(表9)显示：所有个体血样与茸皮样本完全精准匹配，匹配正确率为100％。当用8个位点对24只梅花鹿及来源相同编号随机的24份毛囊样本进行识别结果(表10)显示：所有个体均匹配到唯一的毛囊样本，错配位点数为0。综上所述，当mhl06、mhl25、mhl44、mhl30和mhl58这5个位点相结合时，pid《0.000001，pid(sib)为0.004446，达到梅花鹿个体识别所需最少位点数。当用8个位点组合时，累计个体识别率大于99.99％，累计全同胞识别率大于99.97％，即使是群体中存在全同胞个体，无法识别的概率只有0.000243。若再增加位点，对识别率的提高也是微乎其微。通过验证，5个位点即可应用于实际中梅花鹿个体识别，在实际应用中根据待识别样本的情况，可增加位点。
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表9 26个梅花鹿血样与茸皮识别结果
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表10 24个梅花鹿血样与毛囊样本识别结果
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