一种检测重组腺相关病毒宿主细胞DNA残留的方法与流程

技术特征：
1.一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取2-50μlraav病毒工艺中间品样品，用dnase i酶或无核酸酶水消化，使dnase i酶失活，加入10-20μl 10x prepgem酶缓冲液,1-20μlprepgem酶，加入无核酸酶水至总体积为100-200μl,轻轻吹打，混合均匀，孵育混合物，使prepgem酶裂解病毒，然后再孵育混合物，使酶失活；2)取1-10μl病毒裂解液样品，根据宿主细胞dna残留的含量，不稀释或稀释1-1000倍，加入12.5-15μl 2x pcr supermix，2-5μl引物探针，加入无核酸酶水，使pcr体系体积为25-30μl，将pcr反应体系转移入96孔板中，封膜96孔板，轻轻离心30秒，使液滴沉降到96孔板孔底，将96孔板放放置入实时荧光定量pcr仪进行pcr扩增，实时荧光定量pcr反应完成后，分析raav样品中hcd含量。2.根据权利要求1所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，所述raav病毒工艺中间品样品为hek293细胞裂解上清液。3.根据权利要求1或2所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，所述pcr扩增的条件为：a:50℃,2分钟；b：95℃,10分钟；c:95℃,15秒；d:58-62℃,60秒；e:重复c和d，40个循环；f:4℃,保持。4.根据权利要求1或2所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，步骤1)中，将所述混合物置于75℃，孵育5-15分钟，使prepgem酶裂病毒。5.根据权利要求1或2所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，步骤1)中，将所述混合物置于95℃，孵育2-10分钟，使酶失活。6.根据权利要求1或2所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，步骤2)中，用商业化试剂盒湖州申科cat.no.sk030207h100，检测raav病毒样品中的hcd含量。7.根据权利要求1或2所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，步骤2)中，用18s基因检测raav病毒样品中的hcd含量。8.根据权利要求1或2所述的一种检测重组腺相关病毒宿主细胞dna残留的方法，其特征在于，所述样品为raav病毒工艺终产品。

技术总结
本发明公开了一种检测重组腺相关病毒宿主细胞DNA残留的方法，本发明采用新型prepGEM酶裂解rAAV病毒样品，需要病毒样品量少，5-15分钟内裂解病毒，2-10分钟内使酶失活；病毒裂解液可以直接应用于实时荧光定量聚合酶链反应，准确检测rAAV病毒样品中HEK293宿主细胞DNA残留。本发明方法操作简便，所需步骤少，从处理病毒到获得宿主细胞DNA残留数据，只需要2.5小时。本发明检测方法所获得的HEK293宿主细胞DNA残留，数据稳定，方差比磁珠法和蛋白酶K裂解法都小。K裂解法都小。K裂解法都小。


技术研发人员：雷静 蒋鑫 王沁瑜 周园 欧国娟 徐刚明 郑艳军 程志茹 陈琪
受保护的技术使用者：上海药明生基医药科技有限公司
技术研发日：2022.08.10
技术公布日：2022/11/18