一种降解纤维素和耐盐碱性的菌株及应用

1.本发明涉及纤维素降解和耐盐碱性菌的筛选和应用技术领域，更具体地说是涉及一种降解纤维素和耐盐碱性的菌株及应用


背景技术：

2.我国每年产生6.3亿多吨农作物秸秆，约占世界秸秆总产量的20～30％。秸秆作为主要的农业废弃物，富含丰富的纤维素资源，却存在着难降解和难以资源化的问题。传统方法主要将其焚烧处理，效率低、耗能大且易造成环境污染。秸杆堆肥是解决秸秆污染和秸秆利用率低下的有效技术方法。施用秸秆有机肥能有效培肥土壤，提高土壤质量，改善农作物品质。秸秆有机肥是利用木质纤维素降解菌分泌的多种高活性酶(例如纤维素降解酶类)，在适合条件下，将秸秆中难以降解的木质纤维素等物质转化成可被植物利用的营养元素。
3.盐碱化是导致全球耕地土壤退化的主要原因之一，加快土壤改良可在一定程度上利用盐碱化耕地并减少土壤盐碱化程度。生物改良措施被公认为是比较有效且环境友好的方法。使用微生物有机肥可显著改善盐碱地的土壤性质，菌剂的使用可有效地促进农作物在盐碱化土壤中对营养物质的吸收和利用，进而促进其快速生长，说明有机肥中的菌剂发挥了其耐盐碱的益生功能。因此，分离获得耐盐碱性良好的微生物对盐碱地改良及新型菌剂的开发具有重要意义。
4.因此，如何提供一种降解纤维素和耐盐碱性的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种降解纤维素和耐盐碱性的菌株。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种降解纤维素和耐盐碱性的菌株，所述菌株命名为树状微杆菌ssf12，分类命名为树状微杆菌(microbacterium arborescens)，于2022年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25296，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号
8.所述的树状微杆菌ssf12在发酵产纤维素酶中的应用。
9.所述的树状微杆菌ssf12在发酵秸秆堆肥中的应用。
10.优选的，通过产纤维素酶对秸秆发酵，所述纤维素酶包括滤纸酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。
11.优选的，所述纤维素降解菌发酵产纤维素酶的酶活分别为：滤纸酶活为33.45u/ml，内切葡聚糖酶活力为24.92u/ml，外切葡聚糖酶活力为31.88u/ml，β-葡聚糖苷酶活为29.11u/ml。
12.所述的树状微杆菌ssf12在改良盐碱地中的应用。
13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明分别以cmc-na、从农田土壤中
筛选纤维素降解细菌，通过菌株形态特征、生理生化特性以及16srdna序列分析结果得出ssf12鉴定为树状微杆菌。滤纸酶活为33.45u/ml，内切葡聚糖酶活力为24.92u/ml，外切葡聚糖酶活力为31.88u/ml，β-葡聚糖苷酶活为29.11u/ml，而且具有较强的耐盐性性能，可用于后续的土壤改良和促进作物生长中。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
15.图1附图为纤维素分解菌ssf12的形态学鉴定图；a：菌株ssf6的生长形态；b：菌株ssf6的革兰氏染色特征；c：菌株ssf6在lb cmc-na培养基上的降解圈；
16.图2附图为geniii鉴定板鉴定结果图：
17.图3附图为ssf12菌株电泳图；
18.图4附图为菌株ssf12的系统发育树；
19.图5附图为葡萄糖标准曲线图；
20.图6附图为菌株酶活力测定图。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.土壤样品：
23.土壤样品采集于内蒙古自治区农田腐殖质土壤。土壤样品使用“五点法”进行采样，即在采样区域对角线中心处，刮去土地表层1cm左右的土壤，取50g左右的土壤样品置于无菌自封袋中，在对角线上选择4个与中心样点距离相等的点进行取样。将取好的5份样品等量混合均匀，保存于实验室4℃冰箱中备用。
24.实验试剂及设备
25.主要实验试剂具体见表1，设备具体见表2。
26.表1试剂与设备总表
[0027][0028][0029]
表2主要仪器及设备
[0030][0031][0032]
培养基：
[0033]
牛肉膏蛋白胨富集培养基：牛肉膏3.00g，蛋白胨10.00g，nacl 5.0g，定容1l，ph值＝7.0，121℃20min
[0034]
筛选培养基：cmc-na 20.00g、na2hpo
4 2.50g、kh2po
4 1.50g、pe ptone 2.50g、yeast extract 0.50g、agar 20.00g，定容1l，ph值＝7.0，121℃20min。
[0035]
发酵培养基：cmc-na10.00g、kh2po
4 1.00g、mgso4·
7h2o 0.50g、(n h4)2so
4 2.00g、nacl 2.50g、yeast extract 2.50g、peptone 5.00g，定容1l，ph值＝7.0，121℃20min。
[0036]
滤纸条崩解培养基：(nh4)2so
4 3.00g、kh2po
4 1.00g、mgso4·
7h2o 0.40g、yeast extract 0.10g，定容1l，ph值＝7.0，121℃20min。
[0037]
cmc-na培养基(g/l)：k2hpo
4 1.00g，mgso4·
7h2o 0.25g，yeast extract 2.00g，agar 15.00g，加入cmc-na 2.00g，定容1l，121℃20min，与微晶纤维素配置方法相同，待k2hpo4、mgso4·
7h2o、酵母提取物融化并沸腾后，缓慢加入cmc-na，可以溶解但速度较慢，然后加入琼脂糖，全部溶解后，放入高压灭菌锅灭菌。
[0038]
试剂配制
[0039]
dns显色试剂(3,5二硝基水杨酸)：按照农业部标准dns试剂配制；柠檬酸缓冲溶液、葡萄糖标准溶液：按照qb2583—2003标准配制：称取3,5-二硝基水杨酸(10
±
0.1g)，置于约600ml水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中，磁力搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200g，苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g。待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤，储存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
[0040]
刚果红染液：称取0.10g刚果红，定容至100ml；
[0041]
nacl溶液：称取5.85gnacl，定容至100ml。
[0042]
whatman滤纸条：将干净无淀粉的whatman滤纸裁剪为1
×
6cm的纸条。
[0043]
1％葡萄糖标准液：精确称取干燥的0.1g葡萄糖，用去离子水定容至10ml，现用现配。
[0044]
0.1mol/l ph4.5的柠檬酸缓冲液：称量9.6g无水柠檬酸和2.7g氢氧化钠，在搅拌的同时加入到900ml的蒸馏水中，最后加蒸馏水定容至1l。测试ph值，用柠檬酸或氢氧化钠稀释溶液调整到ph＝4.5。
[0045]
实施例1纤维素降解菌的筛选
[0046]
1)富集培养
[0047]
1g土样于99ml无菌水中摇匀，取5ml接入牛肉膏蛋白胨富集培养基中，37℃、180r/min培养24h～48h；
[0048]
2)初筛
[0049]
取1ml富集培养液用pbs缓冲液进行等比稀释，分别吸取稀释度为10-4
～10-8
倍的菌液200μl涂抹于筛选培养基上，重复3个，37℃培养24h～48h。挑取各稀释梯度培养基中不同形态的单菌落于筛选培养基中，37℃培养24h～48h，用刚果红溶液染色1h，弃染液，最后用nacl溶液洗涤1h。筛选透明圈直径比值(d/d)较大的1株菌株。
[0050]
3)复筛
[0051]
将初筛纯后的菌分别接种于cmc-na培养基，37℃培养24h后，将cmc-na培养基用刚果红染色1h，氯化钠溶液洗涤1h，使用游标卡尺测量培养基中菌落的透明圈直径(d，cm)与菌落直径(d，cm)，计算d/d二者的比值，以其比值大小作为判定细菌降解纤维素能力的指标，见表3；
[0052]
表3菌落在cmc-na培养基上的降解圈直径d/d测定结果
[0053][0054]
ssf12降解圈直径较大，选取降解圈比值大的菌株接种到发酵培养基，37℃、180r/min培养48h，取10ml发酵液于离心管中，4℃、7000r/min离心20min，制备粗酶液。
[0055]
4)纤维素降解菌的鉴定
[0056]
形态学鉴定
[0057]
对过夜培养的纤维素降解菌进行革兰氏染色，以鉴定其染色特性。
[0058]
1.涂片经火焰固定，加(结晶紫溶液)溶液a染1分钟，用清水冲去染液。
[0059]
2.加(碘液)溶液b染1分钟，水洗。
[0060]
3.加(95％乙醇)溶液c，不时摇动玻片约10-30秒，至无紫色脱落为止，水洗。
[0061]
4.加(沙黄复染液)溶液d，染1分钟，水洗。
[0062]
5.干后油镜镜检。阳性菌呈紫色、阴性菌呈淡红色。
[0063]
干燥后，用油镜观察。先低倍镜再高倍镜。油镜使用结束后，要及时用擦镜纸擦干净镜头，避免香柏油残留。
[0064]
结果如图1，ssf12的菌落黄色且表面光滑，需氧生长，革兰氏染色阳性，显微镜下菌体为不规则杆状，单个存在或成对排列。
[0065]
纤维素分解菌的生理生化鉴定
[0066]
采用biolog gen iii microstation自动微生物鉴定系统对ssf6菌株进行生理生化分析。geniii鉴定板共有96个孔，其中包括71个碳源、23个化学敏感物质、1个阴性、1个阳性对照。ssf12菌株在geniii鉴定板上的显色变化如图2所示，阳性结果有63种，阴性结果17种，处于“边界值”的反应有16个；其中碳源利用测试的阳性反应有50个，阴性反应有9个；化学敏感性测试的反应有12个，阴性反应有7个。表4所示，反应菌株在geniii鉴定板上糖醇底物的阳性反应有22个，阴性反应有2个；表5所示，菌株在geniii鉴定板中氨基酸底物的反应中为阴性的反应共1个，阳性反应有5个；表6所示，菌株在geniii鉴定板中抗生素底物的阳性反应有5个，阴性反应有6个。
[0067]
表4 ssf12菌株在geniii鉴定板中糖醇类反应结果
[0068][0069][0070]
表5 ssf12菌株在geniii鉴定板中氨基酸反应结果
[0071][0072]
表6 ssf12菌株在geniii鉴定板中抗生素反应结果
[0073][0074]
分子生物学鉴定
[0075]
细菌基因组dna提取方法(细菌基因组dna提取试剂盒dp302)。
[0076]
1.取细菌培养液1-5ml，10,000rpm离心1min，尽量吸净上清。
[0077]
2.向菌体沉淀中加入加入180ul缓冲液。缓冲液体系(1ml)为：tris-hcl 20ul；edta ph＝8.0 4ul；trition 12ul；无菌水964ul；溶菌酶0.02g。
[0078]
3.加入缓冲液后，37℃处理30min以上。
[0079]
4.向离心管中加入20ul proteinase k溶液，混匀。
[0080]
5.加入220ul缓冲液gb，振荡15s，70℃放置10min(水浴锅)，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。
[0081]
6.加220ul无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。
[0082]
7.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
[0083]
8.向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前请检查是否加入无水乙醇)，放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
[0084]
9.向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前检查是否加入无水乙醇)，放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
[0085]
10.重复步骤811.将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于新的离心管中，室温放置数分钟(5min)，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0086]
12.向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200ul(本实验100ul)洗脱缓冲液te，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
[0087]
分离菌株的16srdna通过利用通用引物进行扩增，
[0088]
f：5
’‑
agagtttgatcctggctca-3’；r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’；
[0089]
pcr扩增的反应体系(25μl)包括：premixtaqtm12.5μl，上、下游引物(10pmol/l)各1μl，细菌基因组dna(1μg/μl)3μl，ddh2o7.5μl。反应条件为：94℃5min；94℃变性30s，55℃45s，72℃2min，35个循环；72℃10min。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，胶回收产物与pmd19-t载体连接并转入trans-t1感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌落pcr鉴定，将阳性克隆送南京金斯瑞生物有限公司进行测序。
[0090]
结果表明pcr条带单一且清晰，其大小约为1500bp，与预期的大小相符(图3)。利用ncbi上的blast程序进行16srdna序列相似性比对，应用mega7.0构建系统进化树，结果显示
(图4)，菌株ssf12与菌株microbacterium arborescens strain nd21的序列相似性最高(99％)。根据菌株形态特征、生理生化特性以及16s rdna序列分析结果，将菌株ssf12鉴定为树状微杆菌(microbacterium arborescens)，所述菌株命名为树状微杆菌ssf12，分类命名为树状微杆菌(microbacterium arborescens)，于2022年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25296，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0091]
实施例2
[0092]
纤维素酶总活性的测定
[0093]
分别吸取1g/l的葡萄糖标准溶液0～1.2ml(0.0/0.2/0.4/0.6/0.8/1.0/1.2)，中间间隔0.2ml后，加去离子水至2.00ml，加入3.00ml dns试剂，混匀沸水浴煮沸5min，冷水冷却，用去离子水定容至20.00ml，在540nm处测定其吸光度。以吸光度为x轴，葡萄糖的含量为y轴，绘制标准曲线。见图5。该标准曲线的回归方程为：y＝0.5952x 0.01517，r2＝0.9923，表明该标准曲线具有良好的线性关系，因此符合要求，可以作为纤维素酶活力测定的标准曲线。将反应液放入紫外分光光度计中测定吸光度，根据标准曲线测定葡萄糖含量，进而计算纤维素酶酶活。
[0094]
纤维素酶活力的计算
[0095]
酶活力定义：底物为羧甲基纤维素钠，ph值为6，反应条件为50℃水浴恒温加热30min，定义每30min催化羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的纤维素酶量为一个酶活力单位，
[0096][0097]
式中：m为依据标准曲线方程计算的葡萄糖含量，mg；
[0098]
n为酶液稀释倍数；v为酶液体积，ml；
[0099]
t为培养时间，min；5.56为1mg葡萄糖的μmol数，1000/180＝5.56。
[0100]
采用滤纸酶活力(fpa)的测定。往25ml具塞比色管中加入1cm
×
5cm的滤纸条(约0.1g)，加入1.00ml 0.1mol/lph4.5的柠檬酸缓冲液浸没滤纸条，加入1.00ml粗酶液(空白组为1.00ml灭活粗酶液)，50℃下静置30min，加入3.00ml dns试剂，混匀沸水浴煮沸5min，冷水冷却，定容至20.00ml，混匀后在540nm处测定其吸光度。每管重复3次。
[0101]
eg或cx酶(内切β-1,4-葡萄糖苷酶)活性的测定
[0102]
采用羧甲基纤维素(cmc)酶活性测定方法。往25ml具塞比色管中加入1.00ml粗酶液(空白组为1.00ml灭活粗酶液)和1.00ml1％的cmc-na溶液(0.1mol/l ph＝4.5的柠檬酸缓冲液)，50℃下静置30min，加入3.00ml dns试剂，混匀沸水浴煮沸5min，冷水冷却，用去离子水定容至20.00ml，混匀后在540nm处测定其吸光度。每管重复3次。
[0103]
cbh或c1酶(外切β-1,4-葡萄糖苷酶)活性的测定
[0104]
采用微晶纤维素(mcc)酶活性测定法。往25ml具塞比色管中加入1.00ml粗酶液(空白组为1.00ml灭活粗酶液)和1.00ml 1％浓度的微晶纤维素溶液(0.1mol/l ph＝4.5的柠檬酸缓冲液)，50℃下静置30min，加入3.00ml dns试剂，混匀沸水浴煮沸5min，冷水冷却，定容至20.00ml，混匀后在540nm处测定其吸光度。每管重复3次。
[0105]
β-1,4-葡萄糖苷酶活力测定
[0106]
往25ml具塞比色管中加入1.00ml粗酶液(空白组为1.00ml灭活粗酶液)和1.00ml1％浓度的水杨苷溶液(0.1mol/lph＝4.5的柠檬酸缓冲液)，50℃30min，加入3.00ml dns试剂，混匀沸水浴煮沸5min，冷水冷却，定容至20.00ml，混匀后在540nm处测定其吸光度。每管重复3次。
[0107]
结果见图6，菌株的4种酶活差别很大，菌株ssf12中滤纸酶活酶活为33.45u/ml，内切葡聚糖酶活力为24.92u/ml，外切葡聚糖酶活力为31.88u/ml，β-葡聚糖苷酶活为29.11u/ml。
[0108]
实施例3 ssf12菌株在秸秆降解的应用
[0109]
用破碎机粉碎的小麦秸秆，用蒸馏水清洗跑发后，放置到恒温烘干箱里，110℃烘干几小时至恒重。在三角瓶中加入200ml发酵培养基(kh2po
4 1.00g、mgso4·
7h2o 0.50g、(nh4)2so
4 2.00g、nacl 2.50g、yeast extract 2.50g、peptone 5.00g，定容1l，ph值＝7.0，121℃20min)，同时加入10g烘干的小麦秸秆及10ml菌液(1
×
10
10
cfu/ml)，做四组，每组3个平行，37℃200rpm振荡培养，每隔五天检测一次，重量变化的差值为小麦秸秆的平均降解率，见表7和表8；。
[0110]
表7菌液在秸秆降解的应用
[0111][0112]
表8不同比例的菌液对秸秆降解率
[0113][0114]
实施例4 ssf12菌株在秸秆堆肥中的应用
[0115]
秸秆1吨和含有1
×
108cfu/ml的树状微杆菌ssf12的液体发酵液50l进行充分混合，将混合好的物料加入到膜式堆肥仓中，堆肥仓盖子为膜式结构，可防水防止热量散失，初期温度可保持在32℃，含水率65％，55℃可保持15天，直至堆腐物颜色变为黑褐色、质地松软即为腐熟完成，共计50天。
[0116]
以自然发酵的秸秆堆肥为对照组，检测c/n比值。c/n比值可体现出堆肥腐熟程度，代表微生物对有机质的降解情况。ssf12组的c/n比值由最初的49.93，下降到18.16；对照组c/n比值由最初的54.12，下降到22.13，说明添加ssf12菌对秸秆堆肥腐熟都有明显的促进作用。
[0117]
实施例5耐盐碱性分析
[0118]
将菌液的浓度达到od600为0.5，此时按照2％接种到由nacl配制而成的盐浓度分别为4％、6％、8％和10％四个梯度的牛肉膏蛋白胨培养基中，平行3次。37℃180r/min恒温培养2～5d，观察长势并记录数据，每隔24h测od
600
值，测定5d。
[0119]
将菌液的浓度达到od600为0.5，此时按照2％接种到由naoh配制而成的ph分别为8、9、10和11四个梯度的牛肉膏蛋白胨培养基中，平行3次。37℃180r/min恒温培养2～5d，观察长势并记录数据，每隔24h测od
600
值，测定5d。见表9；
[0120]
表9 ssf12菌株耐盐和耐碱试验
[0121][0122]
随着盐浓度和ph的上升，菌株的吸光值呈现上升的趋势，到第4天后，菌株的吸光值趋于稳定。耐盐试验和耐碱试验结果发现，ssf12能在氯化钠浓度为10％和ph＝10条件下生长，说明ssf菌株均具有较强耐盐和耐碱的能力。
[0123]
实施例6堆肥盆栽试验
[0124]
盆栽试验目的是分析ssf12堆肥从播种期开始对高盐碱浓度下的植株生长情况的影响，对ssf12发酵堆肥促生情况进行分析。
[0125]
在每个花盆中装有等量的高盐碱浓度的土壤，播种10粒小麦种子后，分成三组，每组3个平行，第一组施加天然发酵的堆肥(天然发酵堆肥组)；第二组施加等量的ssf12菌发酵的堆肥(ssf12发酵堆肥组)；第三组用蒸馏水代替堆肥(无堆肥处理组)。
[0126]
播种后每两天观察种子的出苗情况并记录，计算出苗率。结果发现，与无堆肥处理组比较，施加堆肥处理的两组对小麦种子出苗率都有提高，其中ssf12发酵堆肥组的出苗率最高，达到了78.93％，比经过天然发酵堆肥的小麦出苗率58.46％高了近1.35倍，比无堆肥处理组的小麦出苗率39.36％高了近2.0倍。结果说明堆肥处理的两组可提高小麦的出芽率，其中ssf12发酵堆肥处理组可显著提高小麦的出芽率，能够明显降低土壤盐碱对小麦种子的毒害作用。
[0127]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0128]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。