一种即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法及应用与流程

技术特征：
1.一种即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)脐带供体筛选；(2)初代细胞分离：剥离华通氏胶，剪碎，接种至培养容器中，进行初代细胞分离；(3)初代细胞传代：对经步骤(1)处理分离得到的初代细胞进行2次传代培养，得到p2代细胞；(4)将p2代细胞与冻存液均匀混合，冻存，细胞检验合格，冻存的p2代细胞即为主细胞库；(5)对所述主细胞库进行复苏，并对复苏后的细胞进行2次传代培养，得到p5代细胞，将p5代细胞与所述冻存液均匀混合，冻存，细胞检验合格，冻存的p5代细胞即为所述工作库；步骤(5)中传代培养得到的所述p5代细胞的数量为10
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数量级/根脐带；所述工作库构建过程中用到的原辅料均为药用级。2.根据权利要求1所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脐带供体筛选包括对所述脐带供体进行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒、梅毒螺旋体、巨细胞病毒、人类嗜t细胞病毒、人乳头瘤病毒和eb病毒检测；步骤(2)包括：将脐带组织放入生物安全柜中，洗涤后使用无菌手术器械去除脐静脉和脐动脉，剥离华通氏胶后，将华通氏胶剪碎呈2-3mm3大小的块状，接种到培养瓶中进行组织块培养，37℃、5％co2培养箱中培养至细胞80％-90％融合，消化，即可分离得到初代细胞；采用组织块培养进行所述初代细胞分离；所述组织块培养时，前5d静置培养，以后每3d更换一次培养基。3.根据权利要求1所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，步骤(2)、(3)和(5)中，所采用的培养基包括msc-t4基础培养基和终浓度为1％-10％的血小板裂解液。4.根据权利要求1所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中，传代培养时，所述脐带间充质干细胞的接种密度为8000-12000cells/cm2；步骤(3)和(5)中，所述传代培养在37.0℃、5.0％二氧化碳培养箱中进行，每次传代培养至细胞达80％-90％融合后，消化，进行下次传代培养。5.根据权利要求4所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，所述消化包括：a.向待消化细胞中加入tryple select，室温消化2-7min；b.加入pbs，终止消化；c.对经步骤b处理所得的细胞悬液进行离心；d.离心结束后，pbs重悬细胞，并取样计数；步骤c中，所述离心的离心力为400-450g，离心时间为5-10min。6.根据权利要求1-5任一项所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，所述冻存液包括下述体积百分比的组分：二甲基亚砜5-8％、谷胱甘肽注射液0.5-1％、羟乙基淀粉氯化钠注射液10-20％、氨甲环酸注射液0.5-1％、人血白蛋白注射液15％、维生素c注射液1.5％和右旋糖酐注射液25-30％，余量为10％葡萄糖注射液；
所述谷胱甘肽注射液通过将无菌谷胱甘肽冻干粉溶解于10％葡萄糖注射液后制备得到，所述谷胱甘肽注射液中谷胱甘肽的浓度为0.6％；所述羟乙基淀粉氯化钠注射液中，羟乙基淀粉的浓度为0.06g/ml，氯化钠的浓度为0.009g/ml；所述氨甲环酸注射液中，氨甲环酸的浓度为0.1g/ml；所述人血白蛋白注射液中，人血白蛋白的浓度为20％；所述维生素c注射液中，维生素c的浓度为0.1g/ml；所述右旋糖酐注射液中，右旋糖酐的浓度为6％；所述葡萄糖注射液中葡萄糖的浓度为0.1g/ml。7.根据权利要求6所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，所述冻存液包括下述体积百分比的组分：二甲基亚砜5％、谷胱甘肽注射液1％、羟乙基淀粉氯化钠注射液15％、氨甲环酸注射液1％、人血白蛋白注射液15％、维生素c注射液1.5％和右旋糖酐注射液25％，余量为10％葡萄糖注射液。8.根据权利要求6所述的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法，其特征在于，细胞的冻存密度为(2-5)
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106cells/ml；所述冻存的方法为：向待冻存细胞中加入2-8℃保存的所述冻存液对细胞进行重悬，对得到的细胞悬浮液进行程序降温冻存。9.一种即用型临床级脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述注射液由脐带间充质干细胞工作库细胞和生理盐水混合后得到；所述脐带间充质干细胞工作库细胞通过对脐带间充质干细胞工作库进行复苏后得到，所述脐带间充质干细胞存在于复苏后的冻存液中；所述脐带间充质干细胞工作库采用如权利要求1-8中任一项所述的方法构建得到。10.根据权利要求9所述的即用型临床级脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述冻存液与所述生理盐水的体积比为1:(3-4)；所述复苏在37℃水浴中进行；或通过常温融化复苏；复苏后的所述脐带间充质干细胞工作库细胞在常温条件下存放48h内的细胞活率≥80％。

技术总结
本发明属于细胞库构建技术领域，具体涉及一种即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法及应用。本发明的构建方法包括下述步骤：(1)脐带供体筛选；(2)初代细胞分离；(3)初代细胞传代，得到P2代细胞；(4)将P2代细胞冻存，即为主细胞库；(5)对主细胞库进行复苏，并传代培养，将P5代细胞冻存即为工作库。本发明的即用型临床级脐带间充质干细胞工作库的构建方法中用到的原辅料均为药用级，有助于实现脐带间充质干细胞的临床应用；此外，本发明的方法得到的P5代细胞的数量可达10


技术研发人员：黄莹之 张俊克 潘娜 林洁 范晓聪 陈立府
受保护的技术使用者：宁波希诺赛生物科技有限公司
技术研发日：2022.08.18
技术公布日：2022/11/11