肺癌治疗疗效相关的生物标志物的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及肺癌治疗疗效相关的生物标志物。


背景技术：

2.肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，致死率高达27％。根据临床和组织病理学特征可将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中80-85％是非小细胞癌。传统的肿瘤治疗模式如手术、放疗、化疗等依然是肿瘤治疗的主要方式，20世纪后半叶，建立在肿瘤分子生物学基础上的靶向治疗的出现使得肿瘤学发生重大变革，人们越来越重视根据肿瘤的生物学特征来选择合适的治疗方法。吉非替尼、铂类药物等以其高效、特异的优点成为了肿瘤治疗新的方向。同时，随着疾病进展，耐药问题不可避免的出现也成为了制约肿瘤药物疗效的瓶颈，人们期待能够发现可以预测肺癌患者药物敏感性的标记物为患者提供个体化治疗。
3.微小rna(microrna，mirna)是一种具有调控功能的内源性短rna，长度约为22个核苷酸，可通过碱基互补配对，结合体内靶基因的mrna，参与mrna的翻译抑制或裂解，进而在动植物体内发挥重要的调控作用。mirna在多种实体恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡的调控中起重要作用，并可能参与肿瘤细胞对顺铂敏感性的调控。因此，研究mirna在预测肺癌患者对含铂药物敏感性中的应用，对实现肺癌患者的个性化治疗具有重要意义。


技术实现要素：

4.为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种以mirna为代表的生物标志物，其在预测肺癌患者对含铂药物敏感性中具有较高的敏感度和特异性。
5.本发明的第一方面提供了一种预测肺癌患者对含铂药物敏感性的生物标志物，所述生物标志物包括mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667。
6.进一步，所述mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667选自以下组中的至少一种：mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667初始mirna，mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667前体mirna，成熟mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667，所述mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667初始mirna能在人细胞内被剪切并表达成成熟mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667，所述mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667前体mirna能在人细胞内被剪切并表达成成熟mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667。
7.进一步，所述mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667是成熟mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667。
8.进一步，所述mir-3667选自mir-3667-5p。
9.本发明的第二方面提供了检测本发明第一方面所述的生物标志物的试剂在制备预测肺癌患者对含铂药物敏感性的产品中的应用。
10.进一步，所述产品采用高通量测序、定量pcr或基于探针杂交方法检测样本中mirna或其前体的转录情况。
3137、mir-3202和/或mir-3667，所述mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667前体mirna能在人细胞内被剪切并表达成成熟mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667。
35.进一步，所述mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667是成熟mir-31、mir-3137、mir-3202和/或mir-3667。
36.进一步，所述mir-3667选自mir-3667-5p。
37.在本发明中，“mirna”是短的、天然存在的rna分子，并应该具有本领域技术人员所理解的通常含义。术语“mirna”或“mir”或“微小rna”是指长度为17至25个核苷酸的非编码rna，其与编码rna杂交并调节编码rna的表达。17-25个核苷酸的mirna分子可通过天然的加工途径(例如使用完整的细胞或细胞裂解物)或通过合成的加工途径(例如使用分离的加工酶，如分离的dicer，argonaut或rna酶iii)而从mir前体获得。所理解的是所述17-25个核苷酸的rna分子也可通过生物或化学合成直接产生，而未经从mir前体加工。
38.术语“mirna分子”是指代表mirna的任何核酸分子。此定义中所包括的是天然mirna分子、pre-mirna、pri-mirna，核酸序列与天然形式以及其中一个或多个核酸被一个或多个dna核苷酸和/或核酸类似物替代或代表的核酸序列相同的mirna分子。
39.术语“mir前体”，“pre-mirna”或“pre-mir”是指具有发夹结构的非编码rna。在某些实施方案中，pre-mirna是初级mi-rna转录物的剪切产物，或者“pri-mir”是由双链rna特异性核糖核酸酶(已知为drosha)产生的，但pre-mirna也可直接通过生物学或化学合成而不经从pri-mir加工而产生。一般地，成熟mirna分子的长度是21至22个核苷酸，尽管已经报告了16和多至27个核苷酸的长度。mirna各自从较长的前体rna分子(“前体mirna”)加工。前体mirna自非蛋白质编码基因转录。前体mirna具有两个使得它们能够形成茎-环或折回样结构的互补性区，其在动物中受到称作dicer的核糖核酸酶iii样核酸酶酶切割。经加工的mirna通常是茎的一部分。
40.本发明所用术语“患者”或“受试对象”是指治疗受体。包括哺乳动物和非哺乳动物患者。在本发明的一些实施方案中，患者是哺乳动物，如人、犬、鼠、猫、牛、绵羊、猪或山羊。在本发明的具体实施方案中，患者是人。
41.本发明提供了上述生物标志物在制备预测肺癌患者对含铂药物敏感性的产品中的应用。
42.在本发明的一些实施方案中，所述产品采用高通量测序、定量pcr或基于探针杂交方法检测样本中mirna或其前体的转录情况。
43.在本发明中，高通量测序(high-throughput sequencing)又称下一代测序技术(next generation sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(roch gsflx sequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illumina genome analyzer)和abi的solid测序仪(abi solid sequencer)。
44.术语“定量pcr”(“qpcr”)是指使用聚合酶链反应以同时扩增且定量目标dna和/或rna的实验方法。定量使用多种化学物质(包含例如green的荧光染料或塔克曼(taqman)探
针的荧光报导子寡核苷酸探针)执行，且实时定量通过测量在一或多个扩增周期之后反应中的扩增dna和/或rna来执行。
45.本发明提供了一种预测肺癌患者对含铂药物敏感性的产品，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。
46.在本发明中，所述试剂盒包括针对上述生物标志物的引物或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于上述生物标志物的部分或全部序列；所述试纸包括针对上述生物标志物的引物或探针。
47.本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
48.试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
49.在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是dna、rna或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知mirna序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个mirna的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于mirna的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的trna也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。
50.在本发明的一些实施方案中，术语“引物”是指寡核苷酸，当在诱导引物延伸产物的合成的条件下，例如在核苷酸和聚合诱导剂(如dna或核糖核酸聚合酶)的存在下且在合适温度、ph、金属离子浓度以及盐浓度下放置所述寡核苷酸时，所述寡核苷酸用以引发互补核酸链的合成。
51.在本发明的一些实施方案中，术语“探针”是指包括多核苷酸的结构，其含有与存在于目标核酸分析物(例如，核酸扩增产物)中的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区可由dna和/或rna和/或合成核苷酸类似物构成。探针的长度通常与其用于专一性检测目标核酸的所有或部分目标序列兼容。
52.本发明还提供了一种预测肺癌患者对含铂药物敏感性的风险评估系统，所述系统包括信息获取单元、检测单元、计算单元、评估单元和结果显示单元。
53.在本发明的一些实施方案中，所述信息获取单元用于执行获取受试者检测信息的操作，所述的检测信息包括所述生物标志物的表达水平。
54.在本发明的一些实施方案中，所述检测单元用于检测上述生物标志物的表达水平。
55.在本发明的一些实施方案中，所述计算单元利用上述生物标志物的表达水平计算
3667-5p、mir-1182、mir-378b和mir-492在对含铂药物治疗有反应组(r)中的肺癌患者中上调表达。
78.实施例2 mirna在预测肺癌患者对含铂药物敏感性中的应用
79.2.1 roc曲线分析
80.利用r语言的proc包绘制mirna的roc曲线，并计算auc值，分析mirna的诊断效能，mirna的auc值如表1所示。
81.表1 mirna的auc值
[0082][0083]
对上述mirna进行基因联合，对各个基因进行logistics回归分析，计算四个基因联合对预测肺癌患者对含铂药物敏感性的特异性、敏感度。
[0084]
结果显示，mir-31、mir-3137、mir-3202和mir-3667-5p联合对预测肺癌患者对含铂药物敏感性的准确性高于单个基因(图3)，auc值较高，为0.810，表明mir-31、mir-3137、mir-3202和mir-3667-5p联合可应用于预测肺癌患者对含铂药物敏感性中。
[0085]
而mir-3137、mir-1182、mir-378b和mir-492联合对预测肺癌患者对含铂药物敏感性的准确性低于单个基因(图4)，auc值为0.645，较单个基因(mir-3137)有所下降，说明并不是任意四个mirna联合后都能提高预测肺癌患者对含铂药物敏感性的准确性。
[0086]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。