用于在整个中枢神经系统中传播蛋白质的方法和材料与流程

1.本公开涉及一种用于在中枢神经系统组织中传播蛋白质(如酶)的方法，通过在白质束中沉积包含编码所述蛋白质的核苷酸的神经干细胞或神经前体细胞来进行，其中所述神经干细胞或神经前体细胞分泌酶。


背景技术：

2.溶酶体是在大多数真核细胞中发现的细胞器，通常称为细胞的回收中心，因为它们将不需要的物质加工并消化成细胞可以使用的物质。每个溶酶体被膜包围，所述膜通过质子泵在内部维持酸性环境。溶酶体含有分解如核酸、蛋白质和多糖的大分子的多种水解酶(酸性水解酶)。
3.当缺陷或缺失特定的溶酶体酶导致细胞中大分子积累时，发生溶酶体疾患(lsd)。lsd包括先天性单基因疾病，如由单一溶酶体酶活性缺陷引起的粘多糖贮积症(mps)。然而，lsd的治疗选择仍然有限。例如，酶替代疗法对纠正外周器官的酶缺陷有效，但对中枢神经系统无效。此外，通过全身途径输注酶不能充分穿过血脑屏障以在脑中临床有效。因此，需要治疗方法来治疗中枢神经系统(cns)中由缺失蛋白质(如lsd中涉及的缺失酶)引起的疾病和疾患。


技术实现要素：

4.本公开提供一种用于在中枢神经系统组织(例如脑或脊髓)中传播蛋白质(如酶)的方法，通过在白质束中沉积包含编码所述蛋白质的核苷酸的神经干细胞或神经前体细胞来进行，其中所述神经干细胞或神经前体细胞分泌酶。有利地，神经干细胞或神经前体细胞是迁移的，沿着白质束移动，同时分泌缺失蛋白质，然后所述缺失蛋白质被中枢神经系统的细胞摄入。
5.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述酶是溶酶体酶。
6.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述溶酶体酶是n-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)。
7.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞是迁移性神经干细胞。
8.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞能够进行至少60次细胞倍增。
9.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞是人神经干细胞。
10.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞是源自诱导多能干细胞的神经祖细胞。
11.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞
是粘附性的。
12.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述中枢神经系统组织是脑。
13.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述中枢神经系统组织是脊髓。
14.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞源自胎儿皮层组织。
15.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞用cmyc-er条件性永生化。
16.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞被编程为分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。
17.本公开还提供在有需要的受试者的中枢神经系统组织(例如脑)中治疗神经退行性疾病的方法，所述神经退行性疾病是由于缺乏蛋白质(如溶酶体酶)，通过神将经干细胞施用于中枢神经系统中一个或多个白质束来进行，所述神经干细胞表达受试者的中枢神经系统中缺陷的蛋白质。
18.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经退行性疾病是mps iiia(mps3a)。
19.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述酶是溶酶体酶。
20.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述溶酶体酶是n-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)。
21.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞通过脑内移植而沉积。
22.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述中枢神经系统组织是脑。
23.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，将神经干细胞沉积至中枢神经系统组织中的步骤包括将所述细胞注射至双侧放射冠、内囊、胼胝体和小脑的白质束中。
24.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，使用八个注射路径(injection track)将神经干细胞沉积至双侧放射冠、内囊、胼胝体和小脑的白质束中。
25.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，注射分两个阶段进行。
26.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，第一阶段包括在仰卧位以六个路径将神经干细胞注射至大脑中，然后在第一阶段注射后约2-8周以两个小脑路径注射神经干细胞。
27.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述神经干细胞包含载体，所述载体包含：(a)人n-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)编码序列；和(b)ef1a启动子，其中所述载体是慢病毒载体，并且其中包含所述载体的神经干细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约20倍至约300倍。
28.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，人sgsh编码序列包含人工分泌信号序列，其中与sgsh的天然分泌信号序列相比，所述人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约20％至约200％。
29.在上述或下述实施方案中的每一个或任一个的一些实施方案中，所述人sgsh编码序列是重组人sgsh编码序列。
附图说明
30.当配合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及以下具体实施方式。为了说明本公开的目的，示于附图中的是目前优选的实施方案。然而应理解的是，本公开不限于所示的精确布置、实施例和手段。
31.图1：假设的细胞注射途径，以使用最少的双侧穿透达到最大的细胞扩散。蓝色点表示每个注射路径中最远端的细胞沉积。
32.图2：hk532.sgsh中的sgsh活性。hk532细胞用慢病毒载体转导并扩增，所述慢病毒载体在cag启动子下表达人sgsh编码序列。测量来自病毒转导和无病毒对照培养物的条件培养基和细胞裂解物的sgsh活性。
33.图3：mps3a.sgsh中的sgsh活性。hnsc培养物源自mps iiia患者的ipsc。用慢病毒(lv)载体转导细胞，所述载体表达优化了分泌和内吞作用的人sgsh的重组形式。在第三代慢病毒载体中使用ef1a启动子和优化的转导条件导致显著更高的lv滴度和sgsh表达。
34.图4：在狗中输注。使用为临床设计的立体定向平台、z-驱动器、插管组件和输注泵，向三只健康成年狗输注10、15和20ml的细胞悬浮缓冲液。输注体积为10ml的狗完全恢复，因此将狗的最大耐受输注体积设置为10ml或脑体积的10％。
具体实施方式
35.溶酶体疾患(lsd)如粘多糖贮积症(mps)是由溶酶体酶缺失或缺陷引起的遗传性、单基因、多系统、进行性代谢疾病。至少75％的lsd出现对人的中枢神经系统(cns)、认知和运动功能最具破坏性的影响。没有治愈性疗法来治疗根本的疾病。事实上，市场上或开发中的酶疗法无法跨越血脑屏障，只能治疗全身症状。因此，患有多种类型lsd的患者的预后仍然很差，lsd患者的预期寿命严重受限。
36.发明人已经发现，表达重组蛋白的人神经干细胞(hnsc)或神经前体细胞(包括神经祖细胞)可以直接移植至白质束中，在此它们沿着白质束迁移并以连续和持久的方式表达蛋白质(如酶)。有利地，神经干细胞或神经前体细胞可以用于在脑或脊髓中长期递送缺失或缺陷的蛋白质。缺失或缺陷的蛋白质可以在中枢神经系统的细胞(包括神经元和神经胶质)内被特异性吸收和积累。本文公开的神经干细胞或神经前体细胞也可以用于治疗和/或预防许多影响cns的单基因疾病，如mps iiia。
37.用于本公开的方法的神经干细胞具有迁移特性，尤其是当置于白质束中时。在一个实施方案中，将细胞沉积于横跨双侧放射冠、内囊、胼胝体和/或小脑束的白质束中，以最少的插管穿透实现最大的细胞扩散。
38.为了本公开的目的，术语“神经祖细胞”和“神经前体细胞”是指可以生成后代的细胞，所述后代是神经元细胞(如神经元前体或成熟神经元)或胶质细胞(如胶质前体、成熟的
星形胶质细胞、或成熟的少突胶质细胞)。通常，所述细胞表达一些具有神经谱系特征的表型标志物。
39.神经干细胞和前体细胞
40.提供了包含外源多核苷酸序列的神经干细胞和前体细胞，所述外源多核苷酸序列编码影响中枢神经系统的疾病或疾患中缺失或缺陷的蛋白质(如酶)。神经干细胞和前体细胞优选是稳定的，甚至在培养物中在超过60次细胞倍增之后不分化。神经干细胞可以是人神经干细胞，包括例如人胎儿神经干细胞。
41.在一个实施方案中，神经干细胞或前体细胞包含sgsh编码序列，sgsh是在mps iiia中缺失的酶。编码序列优选通过慢病毒载体稳定整合至条件永生化人神经干细胞系(hknsc)的染色体中。
42.本公开提供一种载体，其包含：(a)人sgsh编码序列；和(b)ef1a启动子，其中所述载体是慢病毒载体(例如第三代慢病毒载体)，并且其中包含所述载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约20倍至约300倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约20倍至约30倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约30倍至约40倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约40倍至约50倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约50倍至约60倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约60倍至约70倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约70倍至约80倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约80倍至约90倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约90倍至约100倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约100倍至约150倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约150倍至约200倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约200倍至约250倍。在一个实施方案中，包含载体的细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约250倍至约300倍。
43.在一些实施方案中，人sgsh编码序列包含人工分泌信号序列，其中与sgsh的天然分泌信号序列相比，所述人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约20％至约200％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约20％至约30％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约30％至约40％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约40％至约50％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约50％至约60％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约60％至约70％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约70％至约80％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加
约80％至约90％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约90％至约100％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约100％至约150％。在一个实施方案中，与sgsh的天然分泌信号序列相比，人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约150％至约200％。
44.在一些实施方案中，人sgsh编码序列是重组人sgsh编码序列。在一些实施方案中，重组人编码sgsh编码序列通过引入一个或多个n264q替换而包含减少数量的糖基化位点，其中与包含重组人编码sgsh编码序列而所述序列不包含n264q替换的载体相比，一个或多个n264q替换的引入增强靶细胞对载体的内吞作用。
45.在一些实施方案中，约10％至约90％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约10％至约20％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约20％至约30％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约30％至约40％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约40％至约50％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约50％至约60％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约60％至约70％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约70％至约80％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。在一个实施方案中，约80％至约90％的表达的sgsh蛋白在24小时内分泌。
46.本公开提供了通过以下方式优化的载体：(i)用人工的、更有效的信号序列替换sgsh的天然分泌信号序列以增加sgsh分泌，和(ii)通过n264q替换减少sgsh编码序列中的糖基化位点以增强靶细胞内吞作用。在一个实施方案中，载体利用第三代lv来增加其效价(vectorbuilder,chicago)。
47.在一个实施方案中，用载体转染的细胞显示出比sgsh蛋白的生理活性高约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍的sgsh活性。在进一步的实施方案中，约20％至约50％的表达的sgsh蛋白在二十四小时内分泌(例如，进入条件培养基)。在另一个实施方案中，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的表达的sgsh蛋白在二十四小时内分泌。
48.本公开还提供一种制备神经干细胞或神经前体细胞的方法，所述细胞包含编码中枢神经系统中缺失或缺陷的蛋白质的外源多核苷酸序列，通过以下进行：获得一种或多种人神经干细胞或前体细胞；将一种或多种神经干细胞或前体细胞铺在经组织培养处理培养皿上，所述培养皿用聚d-赖氨酸和纤连蛋白预包被；在生长培养基中培养一种或多种神经干细胞或前体细胞；扩增一种或多种神经干细胞以产生扩增的神经干细胞或前体细胞群；用编码永生化基因的病毒载体感染神经干细胞或前体细胞；并且用编码缺失或缺陷的蛋白质的另一种载体感染先前暴露于永生化构建体的神经干细胞或前体细胞。此类永生化神经干细胞或前体细胞和制备神经细胞的方法公开于美国专利号7,544,511中。
49.在一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞是多能的，使得每个细胞具有分化成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的能力。在另一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞是双能的，使得每个细胞具有分化成cns的三种细胞类型中的两种的能力。在另一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞至少包括体外生成神经元和星形胶质细胞或少突胶质细胞和星形胶质细胞的双能细胞，并且至少包括体内生成神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞的单能细胞。
50.生长条件可以影响细胞向一种或另一种细胞类型的分化方向，这表明细胞不必定向单一谱系发展。在有利于神经元分化的培养条件下，细胞(特别是来自人cns)在很大程度上是神经元和星形胶质细胞双能的，而向少突胶质细胞的分化是最小的。因此，所公开方法的分化细胞培养物可以产生神经元和星形胶质细胞。
51.在一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞从cns中分离。如本文所用，关于细胞的术语“分离的”是指处于与细胞天然存在的环境(例如细胞在生物体中天然存在的环境)不同的环境中的细胞，并且细胞从其自然环境中移除。
52.神经干细胞或神经前体细胞可以从对期望的神经元群具有天然神经原性的区域和从胚胎、胎儿、出生后、幼年或成年组织中分离。期望的细胞群可以包括具有特定神经元表型的细胞，其可以替代或补充在疾病进展过程中丢失或失活的这种表型。在一个实施方案中，神经祖细胞从脑室下区(svz)或齿状回(dg)的颗粒下区分离。在优选的实施方案中，神经祖细胞从脊髓中分离，所述脊髓中腹侧运动神经元的神经发生是显著的，并且所述神经祖细胞是在腹侧运动神经元的神经发生是显著的人胎儿发育的胎龄获得。
53.因此，在一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞在约6.5至约20周的胎龄从脊髓分离。优选地，神经干细胞在约七至约九周的胎龄从脊髓中分离。在另一个实施方案中，神经干细胞从胚胎脊髓组织中分离。在又一个实施方案中，神经干细胞从人中分离。应理解的是，可分离的神经干细胞群的比例可以随着供体的年龄而变化。细胞群的扩增能力也会随着供体的年龄而变化。
54.神经干细胞或神经前体细胞也可以从出生后和成年组织中分离。源自出生后和成年组织的神经干细胞在其分化成神经元和神经胶质的能力、以及其生长和分化特征方面在数量上是相当的。然而，从各种出生后和成年cns体外分离神经干细胞的效率可以远低于从胎儿组织中分离神经干细胞的效率，胎儿组织具有更丰富的神经干细胞群。然而，与源自胎儿的神经v细胞一样，所公开的方法能够使至少约30％的源自新生儿和成年来源的神经祖细胞在体外分化成神经元。因此，在源自胎儿的神经干细胞的情况下，可以如上所述使用出生后和成年组织。
55.在一个实施方案中，在显微镜下解剖人胎儿脊柱组织。分离出对应于下颈椎/上胸椎节段的组织区域。分离神经祖细胞，然后在含有纤连蛋白和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf；fgf-2)的培养基中，在包被聚-d-赖氨酸的培养容器上扩增。将细胞扩增，然后在不含防腐剂和抗生素的培养基中浓缩至期望的目标细胞密度，每微升约10000个细胞。浓缩细胞可以新鲜用于植入，或冷冻备用。
56.在另一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞源自胚胎干细胞或诱导多能干细胞。如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指从发育中的胚胎中分离的干细胞，其可以产生身体的所有细胞(例如外胚层、中胚层和/或内胚层细胞谱系的细胞)。如本文所用，术语“诱导多能干细胞”是指源自体细胞(例如分化的体细胞)的干细胞，其具有比体细胞更高的效力。胚胎干细胞和诱导多能干细胞能够分化成更多的成熟细胞。用于在体外使胚胎或诱导多能干细胞生长和分化成神经干细胞(nsc)的方法可以是例如daadi等人,plos one.3(2):e1644(2008)中描述的那些。
57.使用任何标准方法或技术，将编码缺失或缺陷的蛋白质(如酶)的多核苷酸序列转染至神经干细胞中。胞嘧啶脱氨酶蛋白的多核苷酸可以源自细菌、酵母、或其他生物。
58.当通过任何合适的人工操作方式将多核苷酸转移至细胞中时，或细胞是最初改变的细胞的后代并经遗传获得多核苷酸，则称神经干细胞或神经前体细胞为“基因改造/工程化的”、“转染的”或“基因转化的”。多核苷酸通常将包含编码感兴趣的蛋白质的可转录序列，这使得细胞能够以升高的水平表达所述蛋白质。如果改变的细胞的后代具有相同的改变，则称遗传改变是“可遗传的”。
59.如本文所公开，有数种标准分子生物学技术可以用于调节外源多核苷酸在神经干细胞中的表达。例如，可以使用不同的启动子来调节生长因子的表达水平和/或调节神经干细胞的何种后代将表达所述因子。例如，人泛素c(ubc)、pgk或cag启动子在本文公开的人神经干细胞的分化神经元和神经胶质后代中赋予不同的生长因子表达水平。另外或可选地，可以驱动表达并将其限制在神经干细胞的某些后代中。例如，人突触蛋白启动子可以用于将生长因子的表达导向神经干细胞的神经元后代。
60.可以优化培养方法，以实现来自不同区域和cns发育年龄的神经干细胞的单个细胞系的长期稳定扩增，同时保持其独特的祖细胞特性。在一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞可以根据美国专利号8,460,651、美国专利号8,236,299、美国专利号7,691,629、美国专利号5,753,506、美国专利号6,040,180或美国专利号7,544,511中所述的方法培养，其全部内容通过引用并入本文。
61.在一个实施方案中，将神经干细胞或神经前体细胞浓缩于溶液中，如上述临床可用的冬眠或冷冻溶液。在一个实施方案中，将神经干细胞或神经前体细胞浓缩至合适的细胞密度，其可以与用于施用细胞的细胞密度相同或不同。在一个实施方案中，用于施用的细胞密度可以从每微升约1000个细胞至每微升约1,000,000个细胞不等，这取决于以下因素：如注射部位、有益效果所需的最小剂量、和毒性副作用考虑。
62.可以将神经干细胞或神经前体细胞浓缩至每微升约1,000至约1,000,000个细胞的密度。在一个实施方案中，将神经干细胞或神经前体细胞浓缩至每微升约2000至约80000个nsc的密度。在另一个实施方案中，每微升约5000至约50000个神经干细胞或神经前体细胞用于有效治疗。在另一个实施方案中，使用每微升约10000至30000个神经干细胞或神经前体细胞。在优选的实施方案中，将神经干细胞或神经前体细胞浓缩至每微升约70000个神经干细胞的密度。
63.在另一个实施方案中，将神经干细胞或神经前体细胞浓缩至每微升约1000至约10000个细胞、每微升约10000至约20000个细胞、每微升约20000至约30000个细胞、每微升约30000至约40000个细胞、每微升约40000至约50000个细胞、每微升约50000至约60000个细胞、每微升约60000至约70000个细胞、每微升约70000至约80000个细胞、每微升约80000至约90000个细胞、或每微升约90000至约100,000个细胞。
64.在另一个实施方案中，将神经细胞浓缩至每微升约100,000至约200,000个细胞、每微升约200,000至约300,000个细胞、每微升约300,000至约400,000个细胞、每微升约400,000至约500,000个细胞、每微升约500,000至约600,000个细胞、每微升约600,000至约700,000个细胞、每微升约700,000至约800,000个细胞、每微升约800,000至约900,000个细胞、或每微升约900,000至约1,000,000个细胞。
65.本公开可以使用任何脊椎动物物种的神经细胞来实施。包括来自人以及非人灵长类动物、家畜、牲畜和其他非人哺乳动物的神经细胞。
66.通过在使具有期望表型的细胞富集的特殊生长环境(通过期望细胞的生长，或通过抑制或杀死其他细胞类型)中培养、分化或重编程神经细胞，来获得本公开的某些神经前体细胞。这些方法是wo 01/88104pct/us01/15861，适用于多种类型的神经细胞。
67.通常地，分化发生在包含合适的基板和添加了分化剂的营养培养基的培养环境中。合适的基板包括用带正电荷包被的固体表面，例如用碱性氨基酸，例如聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸和聚鸟氨酸包被。
68.可以用细胞外基质成分包被基板，例如用纤连蛋白包被。其他允许的细胞外基质包括(来自engelbreth-holm-swarm肿瘤细胞的细胞外基质)和层粘连蛋白。同样合适的是组合基板，如聚-d-赖氨酸与纤连蛋白、层粘连蛋白或两者组合。
69.任选地，可以根据表型特征对分化的细胞进行分选，以富集某些群。通常地，这将涉及将每个细胞与结合神经细胞特征性标志物的抗体或配体接触，然后将被特异性识别的细胞与群中的其他细胞分离。一种方法是免疫淘选，其中特异性抗体与固体表面偶联。将细胞与所述表面接触，不表达标志物的细胞被洗去。然后通过更剧烈的洗脱回收结合的细胞。其变化形式是亲和层析和抗体介导的磁性细胞分选。在典型的分选程序中，将细胞与特定的第一抗体接触，然后用与磁珠结合的第二抗免疫球蛋白试剂捕获。然后通过在磁场中收集珠来回收粘附性细胞。
70.组织特异性基因产物的表达也可以在mrna水平上通过northern印迹分析、斑点印迹杂交分析进行检测，或在标准扩增方法中使用序列特异性引物通过逆转录酶引发的聚合酶链式反应(rt-pcr)进行检测。进一步的细节参见美国专利号5,843,780。本公开中列出的特定标志物的序列数据可以从公共数据库如genbank(url www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)获得。如果根据典型受控实验中的标准程序对细胞样品进行的测定导致清晰可辨的杂交或扩增产物，则称在mrna水平上的表达根据本公开中描述的测定之一是“可检测的”。对于在蛋白质或mrna水平上检测到的组织特异性标志物的表达，如果水平是对照细胞(如未分化的pps细胞、成纤维细胞、或其他不相关细胞类型)的至少两倍，优选多于10倍或以上，则认为所述表达为阳性。
71.还考虑了永生化细胞的其他方法，如用编码myc、sv40大t抗原或mot-2的dna转化细胞(专利5,869,243，国际专利申请wo 97/32972和wo 01/23555)。当细胞将用于治疗目的时，用癌基因或癌病毒产物转染不太合适。端粒化细胞在本公开的应用中特别令人感兴趣，其中具有可以增殖和维持其核型的细胞是有利的；例如，在药物筛选和治疗方案中，将分化的细胞施用于个体以增加cns功能。
72.根据本公开的神经细胞可以药物组合物的形式提供，所述药物组合物包含在足够无菌的条件下制备的用于施用于人的等渗赋形剂。对于药物制剂的一般原则，读者参考cell therapy:stem cell transplantation,gene therapy,and cellular immunotherapy,by-18-wo 01/88104pct/us01/15861g.morstyn w.sheridan编辑,cambridge university press,1996；和hematopoietic stem cell therapy,e.d.ball,j.lister p.law,churchill livingstone,2000。
73.还提供了神经干细胞系或神经前体细胞系，包括表达蛋白质(如酶)的稳定细胞系(例如，后代细胞在其核型、生长和分化特征上保持基本恒定)。某些稳定细胞系可以表达所述蛋白质至少五代、至少六代、至少七代、至少八代、至少九代、至少10代、至少15代、至少20
代、至少25代或至少30代。
74.在一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞表达溶酶体酶。在进一步的实施方案中，溶酶体酶选自：α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、α-n-乙酰葡糖胺酶、β-d-葡糖醛酸酶、β-葡糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、己糖胺酶a和/或b、α-岩藻糖苷酶、硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、α-或β-d-甘露糖苷酶、n-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-乙酰半乳糖苷酶、神经氨酸酶、天冬氨酸酰化酶、和组织蛋白酶a。
75.在另一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞表达抗体或其片段。
76.抗体或免疫球蛋白的一般结构是本领域技术人员熟知的。这些分子是异四聚体糖蛋白，通常为约150,000道尔顿，由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成，通常称为全长抗体。每条轻链通过一个二硫键共价连接至一条重链以形成异二聚体，并通过异二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键形成异四聚体分子。尽管轻链和重链通过一个二硫键连接在一起，但两条重链之间的二硫键数量因免疫球蛋白同种型而异。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链的氨基末端具有一个可变结构域(vh)，然后是三个或四个恒定结构域(ch1、ch2、ch3和ch4)，以及ch1和ch2之间的铰链区。每条轻链具有两个结构域，一个氨基末端可变结构域(vl)和一个羧基末端恒定结构域(cl)。vl结构域与vh结构域非共价结合，而cl结构域通常通过二硫键共价连接至ch1结构域。特定的氨基酸残基在定义抗体表位特异性的轻链和重链可变结构域之间形成界面(chothia等人,1985,j.mol.biol.186:651-663)。可变结构域在本文中也称为可变区。
77.可变结构域内的某些结构域在不同抗体之间非常不同，即是“高变(的)”。这些高变结构域含有直接参与每种特定抗体对其特定抗原决定簇(表位)的结合和特异性的残基。轻链和重链可变结构域中的高变性集中在三个区段中，其称为互补决定区(cdr)或高变环(hvl)。cdr由kabat等人,1991,在:sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md.中的序列比较定义，而hvl(本文也称为cdr)在结构上是根据可变结构域的三维结构定义的，如chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917所描述的。这两种方法导致cdr的识别略有不同。如kabat所定义，在轻链可变结构域中，cdr-l1约位于残基24-34，cdr-l2约位于残基50-56，cdr-l3约位于残基89-97；在重链可变结构域中，cdr-h1约位于残基31-35，cdr-h2约位于残基50-65，cdr-h3约位于残基95-102。涵盖特定cdr的确切残基数将根据cdr的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基包含特定cdr。因此，重链和轻链的cdr1、cdr2和cdr3定义了给定抗体的独特的功能特性。
78.每条重链和轻链内的三个cdr由框架区(fr)分隔，框架区含有的序列倾向于较不可变。fr和cdr从重链和轻链可变结构域的氨基末端至羧基末端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4的顺序排列。fr的主要为β折叠的构型使每条链内的cdr彼此非常接近，以及与来自另一条链的cdr非常接近。所得构象有助于抗原结合位点(参见kabat等人,1991,nih publ,no.91-3242,vol.i,pp.647-669)，尽管并非所有cdr残基都必须直接参与抗原结合。
79.fr残基和ig恒定结构域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合和/或介导抗体效应子功能。认为一些fr残基至少以三种方式对抗原结合具有显著影响：通过直接与表位非共价结合、通过与一个或多个cdr残基相互作用、和通过影响重链和轻链之间的界面。恒
定结构域不直接参与抗原结合，但介导各种ig效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。
80.基于恒定结构域的氨基酸序列，脊椎动物免疫球蛋白的轻链被分配至两个明显不同的类别kappa(κ)和lambda(λ)之一。相比之下，根据恒定结构域的序列，哺乳动物免疫球蛋白的重链被分配至五个主要类别iga、igd、ige、igg、和igm之一。igg和iga进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。天然免疫球蛋白的类别的亚基结构和三维构型是众所周知的。
81.抗体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(如可变结构域和表现出期望的生物活性的抗体其他部分，所述生物活性例如结合肿瘤特异性抗原)。
82.应理解的是，单克隆抗体可以通过本领域已知的任何技术或方法来制备，包括例如杂交瘤方法(kohler等人,1975,nature 256:495)或本领域已知的重组dna方法(参见例如美国专利号4,816,567)，或对使用噬菌体抗体文库重组产生的单克隆进行分离的方法，其使用clackson等人,1991,nature 352:624-628和marks等人,1991,j.molecular.biology.222:581-597中描述的技术。
83.嵌合抗体由来自一个物种(例如非人哺乳动物，如小鼠)的抗体的重链和轻链可变区和另一个物种(例如人)抗体的重链和轻链恒定区组成，并且可以通过以下方法获得：将编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体可变区的dna序列连接至来自第二物种(例如人)的抗体恒定区的dna序列，并用含有连接的序列的表达载体转化宿主，以允许其产生嵌合抗体。可选地，嵌合抗体也可以是这样的抗体，其中重链和/或轻链的一个或多个区或结构域与来自另一免疫球蛋白类别或同种型、或来自共有序列或种系序列的单克隆抗体中的相应序列相同、同源或是其变体。嵌合抗体可以包括此类抗体的片段，条件是抗体片段表现出其亲本抗体的期望生物活性，例如结合相同的表位(参见例如美国专利号4,816,567；和morrison等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855)。
84.术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，其中保留了可变区或功能能力，例如结合肿瘤特异性抗原。抗体片段的例子包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、scfv和scfv-fc片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、微型抗体，由抗体片段形成的双抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
85.全长抗体可以用酶(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理以生成有用的抗体片段。使用木瓜蛋白酶消化以产生两个相同的抗原结合抗体片段，称为“fab”片段，每个片段都具有单个抗原结合位点，和一个残留的“fc”片段。fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的ch结构域。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
86.fab'片段与fab片段的不同之处在于存在额外的残基，包括来自ch结构域c-末端处的抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。f(ab')2抗体片段是由铰链区中的半胱氨酸残基连接的成对fab'片段。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0087]“fv”片段含有完整的抗原识别和结合位点，所述位点由一个重链和一个轻链可变结构域紧密非共价结合的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用以在vh-vl二聚体表面上限定一个抗原结合位点。共同地，六个cdr赋予抗体以抗原结合特
异性。
[0088]“单链fv”或“scfv”抗体片段是包含抗体的vh和vl结构域的单链fv变体，其中所述结构域存在于单个多肽链中。单链fv能够识别和结合抗原。scfv多肽还可以任选地含有位于vh和vl结构域之间的多肽接头，以促进形成scfv结合抗原的期望的三维结构(参见例如pluckthun,1994,在the pharmacology of monoclonal antibodies,vol.113,rosenburg和moore编辑,springer-verlag,new york,pp.269-315)。
[0089]“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含重链可变结构域(v.sub.h)，其连接至同一多肽链中的轻链可变结构域(v.sub.l)(v.sub.h-v.sub.l或v.sub.l-v.sub.h)。双抗体更全面地描述于例如holliger等人(1993)proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 90:6444-6448中。
[0090]
其他公认的抗体片段包括那些包含一对串联fd区段(vh-ch1-vh-ch1)以形成一对抗原结合区的抗体片段。这些“线性抗体”可以是双特异性或单特异性的，例如描述于zapata等人1995,protein english.8(10):1057-1062中。
[0091]“人源化抗体”或“人源化抗体片段”是特定类型的嵌合抗体，其包含免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其能够与预定抗原结合，并且包含一个或多个具有基本为人免疫球蛋白的氨基酸序列的fr和一个或多个具有基本为非人免疫球蛋白的氨基酸序列的cdr。这种通常称为“输入”序列的非人氨基酸序列通常取自“输入”抗体结构域，特别是可变结构域。通常，人源化抗体至少包括非人抗体的cdr或hvl，其插入在人重链或轻链可变结构域的fr之间。
[0092]
在另一方面，抗体可以包含基本所有的至少一个(通常是两个)可变结构域(如fab、fab'、f(ab')2、fabc和fv片段中含有的)，在其中所有或基本所有的cdr对应于非人免疫球蛋白的cdr，特别是在本文中，所有cdr是如下文详述的小鼠或人源化序列，并且所有或基本所有的fr是人免疫球蛋白共有序列或种系序列的fr。在另一方面，抗体还包含免疫球蛋白fc区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白fc区的至少一部分。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变结构域。适当时，抗体还可以包含重链的ch1、铰链、ch2、ch3、和/或ch4区中的一个或多个。
[0093]
抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白(包括igm、igg、igd、iga和ige)和任何同种型(包括igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。例如，恒定结构域可以是补体固定恒定结构域，其中期望人源化抗体表现出细胞毒活性，并且同种型通常是igg1。在不期望这种细胞毒活性时，恒定结构域可以是另一种同种型，例如igg2。
[0094]
抗体也可以与前药偶联。“前药”是药学活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比，其对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并且能够被酶促激活或转化为更具活性的形式。参见例如wilman,1986,“prodrugs in cancer chemotherapy”,在biochemical society transactions,14,pp.375-382,615th meeting belfast；和stella等人,1985,“prodrugs:a chemical approach to targeted drug delivery”,在“directed drug delivery”,borchardt等人(编辑),pp.247-267,humana press。有用的前药包括但不限于：含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、d-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、任选取代的含苯氧基乙酰胺的前药、和任选取代的含苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他可以转化为更具有活性的无细胞毒性药物的5-氟尿苷前药。
[0095]
可以衍生成前药形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于：烷化剂类(alkylating agents)，如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯类(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)、和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是bulatacin和bulatacinone)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；cc-1065(包括其合成类似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin))；隐藻素类(cryptophycines)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；澳瑞他汀类(auristatins)(包括类似物单甲基-澳瑞他汀e和单甲基-澳瑞他汀f)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189和cbi-tmi)；软珊瑚醇(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、chlomaphazine、cholophosphamide、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)和泼尼莫司汀(prednimustine)；曲磷胺(trofosfamide)；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，如烯二炔类抗生素(enediyne antibiotics)(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素phii1；参见例如agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin a；双膦酸盐，如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团类(chromoprotein enediyne antibiotic chromomophores)、acclacinomysins、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素类(bleomycins)、放线菌素c(cactinomycin)、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycins)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin,adriamycin
tm
)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubucin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素c、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycine)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙
(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素剂，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如frolinic acid；乙酰葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；democolcine；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类化合物(maytansinoids)，如美登素(maytansine)和安丝菌素类(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；sizofuran；螺锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、verracurin a、roridin a和蛇形菌素(anguidine))；聚氨酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；mitabronitol；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(ara-c)；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel,bristol-myers squibb oncology,princeton,n.j.)和多西他赛(doxetaxel,rhone-poulenc rorer,antony,france)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine,gemzar
tm
)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(etoposide,vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine,navelbine
tm
)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维甲酸类(retinoids)，如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；和上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括抗激素剂，其发挥作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括nolvadex
tm
)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、ly117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene,fareston
tm
)；芳香酶抑制剂，其抑制调节肾上腺中产生雌激素的芳香酶，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate,megace
tm
)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestane)、法屈唑(fadrozole)、伏氯唑
(vorozole,rivisor
tm
)、来曲唑(letrozole,femara
tm
)、和阿那曲唑(anastrozole,arimidex
tm
)；和抗雄激素剂，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0096]“分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中所述分离的核酸分子通常与所述污染核酸分子组合。分离的核酸分子不同于存在于天然细胞中的核酸分子。
[0097]
在本公开的各个方面，抗体的表达可以使用一种或多种控制序列(即，在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的多核苷酸序列)。适用于原核细胞的控制序列包括例如启动子、操纵子和核糖体结合位点序列。真核控制序列包括但不限于启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
[0098]
当核酸序列被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果核酸前序列或分泌前导序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它可操作地连接至编码所述多肽的核酸；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它可操作地连接至所述序列；或如果核糖体结合位点被置于便于翻译的位置，则它可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且在阅读框中。然而，增强子任选地是连续的。可以通过在方便的限制性位点进行连接来完成连接。如果不存在这种位点，可以使用合成的寡核苷酸适体或接头。
[0099]
治疗中枢神经系统中蛋白质缺陷的方法
[0100]
本公开提供了用于在中枢神经系统组织中传播蛋白质(如酶或抗体)的方法，通过在白质束中沉积包含编码所述酶的核苷酸的神经干细胞或神经前体细胞进行，其中所述神经干细胞或神经前体细胞分泌所述蛋白质。此类方法可以用于治疗与中枢神经系统中缺失或缺陷蛋白质(如酶)相关的疾病或疾患。
[0101]
在一个实施方案中，将有效量的神经干细胞或神经前体细胞施用于脑。对于4岁及以上的患者，施用于脑的细胞数量相同。
[0102]
在一个实施方案中，神经干细胞或神经前体细胞表达溶酶体酶。在进一步的实施方案中，所述溶酶体酶选自：α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、α-n-乙酰葡糖胺酶、β-d-葡糖醛酸酶、β-葡糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、己糖胺酶a和/或b、α-岩藻糖苷酶、硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、α-或β-d-甘露糖苷酶、n-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-乙酰半乳糖苷酶、神经氨酸酶、天冬氨酸酰化酶、和组织蛋白酶a。
[0103]
神经干细胞或神经前体细胞首先通过手术方式植入受试者的中枢神经系统(包括脑和/或脊髓)中的一个或多个白质束中。一旦植入，神经干细胞或神经前体细胞及其随后的(后代)祖细胞沿白质束迁移并广泛扩散并传播遍及脑/脊髓组织。细胞可以稳定驻留并与cns组织无缝整合，并不断分泌缺失或缺陷的蛋白质。
[0104]
本公开还提供了在有需要的受试者中治疗由于中枢神经系统中的蛋白质缺乏或缺陷引起的疾病或疾患的方法，通过将神经干细胞或神经前体细胞施用于中枢神经系统中的一个或多个白质束(例如蛋白质缺陷部位附近的一个或多个白质束)来进行，所述神经干细胞或神经前体细胞表达受试者的中枢神经系统中缺陷的酶。
[0105]
还提供了在有需要的受试者(例如患有mps iiia(mps3a)的受试者)中治疗由于脑中缺乏溶酶体酶而引起的疾病或疾患的方法，通过将神经干细胞或神经前体细胞施用于脑中的一个或多个白质束来进行，所述神经干细胞或神经前体细胞表达受试者脑中缺陷的酶。
[0106]
此类方法可以包括将治疗有效量的本文公开的神经干细胞或神经前体细胞施用于受试者，包括例如通过注射施用。在一个实施方案中，用所公开的神经干细胞或神经前体细胞治疗的受试者在施用神经干细胞或神经前体细胞之前、期间和/或之后是免疫抑制的。
[0107]
在一些实施方案中，“治疗(treating,treatment)”疾病、疾患或病症至少部分包括：(1)预防疾病、疾患或病症，即导致疾病、疾患或病症的临床症状不在哺乳动物中发生，所述哺乳动物暴露于或易患所述疾病、疾患或病症但尚未经历或表现出所述疾病、疾患或病症的症状；(2)抑制疾病、疾患或病症，即阻止或减少疾病、疾患或病症或其临床症状的进展；或(3)缓解疾病、疾患或病症，即导致疾病、疾患或病症或其临床症状消退。
[0108]
如本文所用的术语“预防(prevention,prevent,preventing)”和“抑制(suppression,suppress)”是指以暂时地或永久地预防、抑制或减少疾病状态或病症的临床表现的发生的方式开始行动过程(如施用如本文所公开的神经祖细胞)。这种预防、抑制或减少不必是绝对有用的。
[0109]
在一些实施方案中，如本文所用，“有效量”是指赋予受试者以治疗效果所需的神经干细胞或前体细胞的量。如本文所用，“治疗有效量”是指施用神经祖细胞的足够的量，所述足够的量将在一定程度上缓解所治疗的疾病、疾患或病症的一种或多种症状。在一些实施方案中，结果是减少和/或减轻疾病的体征、症状或病因，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，在一些实施方案中，用于治疗用途的“有效量”是提供临床上显著的疾病症状减少而没有过度不良副作用所需的神经祖细胞的量。在一些实施方案中，在任何个别情况下的适当的“有效量”使用诸如剂量递增研究的技术来确定。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。在其他实施方案中，神经祖细胞的“有效量”是有效实现期望的药理作用或治疗改善而没有过度不良副作用的量。在其他实施方案中，应理解“有效量”或“治疗有效量”由于代谢、年龄、体重、受试者的一般状况、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度、和处方医师的判断而因受试者而异。
[0110]
中枢神经系统中的蛋白质水平可以增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或更多，包括与未施用治疗有效量的一种或多种本文公开的人神经祖细胞的受试者的脑相比。
[0111]
在一个实施方案中，nsc可以用药学上可接受的载体稀释。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，其与本公开的细胞一起施用，并且经联邦或州政府的监管机构批准或列于美国药典或其他公认的用于动物(尤其是用于人)的药典中。此类药物载体可以是液体，如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。当施用于患者时，神经祖细胞和药学上可接受的载体可以是无菌的。当静脉内施用细胞时，水是有用的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。
[0112]
合适的药用载体还包括赋形剂，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、
甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，本发明的组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或ph缓冲剂。本发明的组合物可以有利地采用溶液、乳液、缓释制剂的形式或任何其他适合使用的形式。选择合适的载体在普通技术人员的技能范围内。
[0113]
所公开的方法中的nsc可以源自一个部位并作为自体移植物移植至同一受试者内的另一个部位。此外，所公开的方法中的nsc可以源自遗传上相同的供体并作为同种移植物移植。更进一步，所公开的方法中的nsc可以源自相同物种的遗传上不相同的成员并且作为同种异体移植物移植。可选地，nsc可以源自非人来源并作为异种移植物移植。随着强大的免疫抑制剂的发展，非人神经前体(如猪来源的神经前体)的同种异体移植物和异种移植物可以移植至人受试者中。
[0114]
可以通过任何标准方法解离样品组织。在一个实施方案中，使用移液器和不含二价阳离子的缓冲液(例如盐水)通过温和的机械研磨解离组织以形成解离细胞的悬浮液。为了避免过度的局部细胞密度，期望足够的解离以获得大部分为单细胞。
[0115]
在另一个实施方案中，可以将神经干细胞或神经前体细胞悬浮于每个注射部位小于约100微升的注射体积中，递送至治疗区域。例如，在人受试者中的胶质母细胞瘤的治疗中，可以进行多次注射，可以使用每个注射部位0.1至约100微升的注射体积。在优选的实施方案中，可以将nsc悬浮于每个注射部位约1微升的注射体积中，递送至治疗区域。
[0116]
在一个实施方案中，所公开的方法包括将神经干细胞或神经前体细胞以每微升约1000至约10000个细胞、每微升约10000至约20000个细胞、每微升约20000至约30000个细胞、每微升约30000至约40000个细胞、每微升约40000至约50000个细胞、每微升约50000至约60000个细胞、每微升约60000至约70000个细胞、每微升约70000至约80000个细胞、每微升约80000至约90000个细胞、或每微升约90000至约100,000个细胞的细胞密度注射至受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中。
[0117]
在一些实施方案中，所公开的方法包括将神经干细胞或神经前体细胞以每微升约100,000至约200,000个细胞、每微升约200,000至约300,000个细胞、每微升约300,000至约400,000个细胞、每微升约400,000至约500,000个细胞、每微升约500,000至约600,000个细胞、每微升约600,000至约700,000个细胞、每微升约700,000至约800,000个细胞、每微升约800,000至约900,000个细胞、每微升约900,000至约1,000,000个细胞的细胞密度注射至受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中。
[0118]
在一个实施方案中，所公开的方法包括将神经干细胞或神经前体细胞以每微升约5000至约50000个细胞的细胞密度注射。在优选的实施方案中，所公开的方法包括将神经干细胞或神经前体细胞以每微升约70000个细胞的细胞密度注射。
[0119]
在一个实施方案中，所公开的方法包括多次注射神经干细胞或神经前体细胞，每次注射的细胞数为约5000至约50000个细胞、约50000至约100,000个细胞、约100,000至约150,000个细胞、约150,000至约200,000个细胞、约200,000至约250,000个细胞、约250,000至约300,000个细胞、约300,000至约350,000个细胞、约350,000至约400,000个细胞、约400,000至约450,000个细胞、或约450,000至约500,000个细胞，将其引入至受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中。
[0120]
可选地，所公开的方法包括多次注射神经干细胞或神经前体细胞，每次注射的细胞数为500,000至约1,000,000个细胞、约1,500,000个细胞至约2,000,000个细胞、约2,
000,000个细胞至约2,500,000个细胞、约2,500,000个细胞至约3,000,000个细胞、约3,000,000个细胞至约3,500,000个细胞、约3,500,000个细胞至约4,000,000个细胞、约4,000,000个细胞至约4,500,000个细胞、约4,500,000个细胞至约5,000,000个细胞、约5,000,000个细胞至约5,500,000个细胞、约5,500,000个细胞至约6,000,000个细胞、约6,000,000个细胞至约6,500,000个细胞、约6,500,000个细胞至约7,000,000个细胞、约7,000,000个细胞至约7,500,000个细胞、约7,500,000个细胞至约8,000,000个细胞、约8,000,000个细胞至约8,500,000个细胞、约8,500,000个细胞至约9,000,000个细胞、约9,000,000个细胞至约9,500,000个细胞、约9,500,000个细胞至约10,000,000个细胞、约10,000,000个细胞至约10,500,000个细胞、约10,500,000个细胞至约11,000,000个细胞、约11,000,000个细胞至约11,500,000个细胞、约11,500,000个细胞至约12,000,000个细胞、约12,000,000个细胞至约12,500,000个细胞、约12,500,000个细胞至约13,000,000个细胞、约13,000,000个细胞至约13,500,000个细胞、约13,500,000个细胞至约14,000,000个细胞、约14,000,000个细胞至约14,500,000个细胞、约14,500,000个细胞至约15,000,000个细胞、约15,000,000个细胞至约15,500,000个细胞、或约15,500,000个细胞至约16,000,000个细胞。
[0121]
在一些实施方案中，所公开的方法包括多次注射神经干细胞或神经前体细胞，总细胞数为约400,000至约800,000个细胞、约800,000至约1,200,000个细胞、约1,200,000至约1,600,000个细胞、约1,600,000至约2,000,000个细胞、约2,000,000至约2,400,000个细胞、约2,400,000至约2,800,000个细胞、约2,800,000至约3,200,000个细胞、约3,200,000至约3,600,000个细胞、约3,600,000至约4,000,000个细胞、约4,000,000至约5,000,000个、或约5,000,000至约10,000,000个细胞，将其引入至受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中。
[0122]
在其他实施方案中，所公开的方法包括多次注射神经干细胞或神经前体细胞，总细胞数为约100万、200万、300万、400万、500万、600万、700万、800万、900万、1000万、1100万、1200万、1300万、1400万、1500万、1600万、1700万、1800万、1900万、2000万、2100万、2200万、2300万、2400万、2500万、2600万、2700万、2800万、2900万、3000万、3100万、3200万、3300万、3400万、3500万、3600万、3700万、3800万、3900万、4000万、4100万、4200万、4300万、4400万、4500万、4600万、4700万、4800万、4900万、5000万、5100万、5200万、5300万、5400万、5500万、5600万、5700万、5800万、5900万、6000万、6100万、6200万、6300万、6400万、6500万、6600万、6700万、6800万、6900万、7000万、7100万、7200万、7300万、7400万、7500万、7600万、7700万、7800万、7900万、8000万、8100万、8200万、8300万、8400万、8500万、8600万、8700万、8800万、8900万、9000万、9100万、9200万、9300万、9400万、9500万、9600万、9700万、9800万、9900万、或1亿个细胞，将其引入至受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中。
[0123]
在另一个实施方案中，所公开的方法包括多次注射神经干细胞或神经前体细胞，总细胞数为约1亿至约2亿、约2亿至约3亿、约3亿至约4亿、约4亿至约5亿、约5亿至约6亿、约6亿至约7亿、约7亿至约8亿、约8亿至约9亿、约9亿至约10亿、约10亿至约11亿、约11亿至约12亿、约12亿至约13亿、约13亿至约14亿、约14亿至约15亿、约15亿至约16亿、约16亿至约17亿、约17亿至约18亿、约18亿至约19亿、或约19亿至约20亿个细胞，将其引入至受试者的中
枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中。
[0124]
在其中悬浮扩增的神经干细胞或神经前体细胞并将其递送至治疗区域的介质体积在本文中可以称为注射体积。注射体积取决于注射部位和组织的退化状态。更具体地，注射体积的下限可以通过高细胞密度的粘性悬浮液的实际液体处理以及细胞聚集的趋势来确定。注射体积的上限可以由注射体积施加的压缩力的限制来确定，所述限制是避免损伤宿主组织所必需的，由以及实际的手术时间的限制来确定。
[0125]
在所公开的方法中可以使用用于将细胞注射至期望区域的任何合适的装置。在一个实施方案中，使用能够在一段时间内以基本恒定的流速递送亚毫升体积的注射器。细胞可以通过针或柔性管或任何其他合适的转移装置加载至装置中。
[0126]
在另一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约1至约100个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约10至约20个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约20至约30个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约30至约50个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约50至约100个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约100至约150个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约150至约200个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约200至约250个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约250至约300个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约300至约350个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约350至约400个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约400至约450个部位处注射细胞。在一个实施方案中，在受试者的中枢神经系统(包括例如受试者的脑)中的一个或多个白质束中，在约450至约500个部位处注射细胞。
[0127]
至少两个部位可以以大约1mm至约50mm的距离分隔，包括例如在一个针路径中。在另一个实施方案中，注射部位之间的距离为约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、或20mm。在一个实施方案中，注射部位之间的距离为约400至约600微米。在一个实施方案中，注射部位之间的距离为约100至约200微米、约200至约300微米、约300至约400微米、约400至约500微米、约500至约600微米、约600至约700微米、约700至约800微米、约800至约900微米、或约900至约1000微米。在一个实施方案中，注射部位之间的距离为约1000至约2000微米、约2000至约3000微米、约3000至约4000微米、或约4000至约5000微米。
[0128]
神经干细胞或神经前体细胞可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、43、44、45、46、47、48、49或50个部位处注射至白质束中。在某些实施方案中，可以注射2个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)部位。
[0129]
在一个实施方案中，将本公开的神经干细胞或神经前体细胞的组合物配制为可注射制剂，并包含例如适合递送至脑的水溶液或悬浮液。在准备用于注射(特别是用于脑内递送)的组合物时，可以存在连续相，其包含张力调节剂的水溶液并缓冲至ph为6-8。张力调节剂可以包括例如氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖、甘油、或使制剂的渗透压与血液等渗的其他药剂。可选地，当较大量的张力调节剂用于制剂中时，可以在注射之前用药学上可接受的稀释剂稀释所述张力调节剂，以使混合物与血液等渗。
[0130]
在上述方法中任一项的一些实施方案中，施用一次包含神经干细胞或神经前体细胞的组合物。在上述方法中任一项的一些实施方案中，施用初始剂量的包含神经祖细胞的组合物，然后施用一次或多次随后的剂量。可以用于本公开的方法中的给药方案(例如，第一剂量和一次或多次随后的剂量之间的间隔)的例子包括：约每周一次至约每12个月一次的间隔、约每两周一次至约每六个月一次的间隔、约每月一次至约每六个月一次的间隔、约每月一次至约每三个月一次的间隔、或约每三个月一次至约每六个月一次的间隔。在一些实施方案中，每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、或在疾病复发时施用。
[0131]
本公开的方法可以包括在注射神经祖细胞之前、同时、或之后施用一种或多种免疫抑制药物。在一些实施方案中，神经祖细胞和免疫抑制药物可以共同施用。构成疗法的神经祖细胞和免疫抑制药物可以是旨在实质上同时施用的组合剂型形式，或是单独剂型形式。
[0132]
神经干细胞或神经前体细胞和免疫抑制药物也可以依次施用，通过要求多步施用的方案来施用神经祖细胞或免疫抑制药物。因此，一种方案可以要求顺序施用神经祖细胞和免疫抑制药物，分开施用单独的活性剂。多个施用步骤之间的周期范围可以从例如数分钟至数小时至数天，取决于神经祖细胞和免疫抑制药物的特性，如治疗化合物的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学数据谱，以及取决于食物摄入和受试者的年龄和状况的影响。
[0133]
无论是同时、基本同时或依次施用神经祖细胞和免疫抑制药物，都可以涉及例如要求通过静脉内、动脉内、脑内或心室内途径施用神经祖细胞和通过口服途径、经皮途径、静脉内途径、或肌内途径、或通过粘膜组织直接吸收来施用免疫抑制药物的方案。无论是口服、通过吸入喷雾、直肠、局部、口腔(例如舌下)、或肠胃外(例如皮下、肌内、静脉内和皮内注射、或输注技术)单独或一起施用免疫抑制药物，每种此类治疗化合物将被包含于药学上可接受的赋形剂、稀释剂或其他制剂组分的合适药物制剂中。
[0134]
通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应被解释为以任何方式进行限制。下面描述用于以下实验例的材料和方法。
[0135]
实施例
[0136]
实施例1：表达sgsh的神经干细胞的生成
[0137]
使用慢病毒载体创建在cag启动子下过表达hsgsh的稳定的粘附性hnsc(用cmyc-er条件永生化)的细胞系hk532.sgsh。选择亲本hknsc是因为其卓越的迁移特性，以及用于在严格规范下未来制造cgmp的强大扩增能力，和其生理先天特性(例如，在体外和体内可预
测分化为50％神经元和50％神经胶质)。
[0138]
简要地，使用标准技术构建表达sgsh的p-o-p慢病毒载体。接下来，用p-o-p级sgsh慢病毒转导来自cgmp mcb小瓶的hknsc培养物。通常地，在moi10-100下过夜感染的转导效率为70-90％。没有选择步骤。然后在非gmp下扩增转导的细胞，9次连续传代，以在第3(p3)、6(p6)和9(p9)代生成3层研究级细胞库。每个库的规模将限制为p3和p6为20个t175烧瓶(大约4x108个细胞/库)，p9为60个t175烧瓶(大约2.4x109个细胞)。
[0139]
如所示的，已证明在cag启动子下的重组sgsh蛋白被表达(比野生型高约10倍)并从细胞中分泌出来，具有足够高的酶活性以用于治疗。
[0140]
还评估了p9细胞的关键特性(核型、酶水平、生长速率和分化)。简要地，在9次连续传代中研究的hknsc.sgsh细胞的体外特性包括：生长速率，端粒长度，神经祖细胞、神经元、星形胶质细胞、和/或少突胶质细胞的比例，和神经元成熟的程度。此外，所研究的hknsc.sgsh细胞的体外特性包括来自p3、p6和p9培养物的条件培养基中sgsh酶的量和活性。
[0141]
实施例2：sgsh的表达、分泌和内吞作用的优化
[0142]
通过递送足量的具有功能活性的人n-磺基葡糖胺磺基水解酶(hsgsh)使整个cns正常化。生成了表达hsgsh的中试规模慢病毒(lv)以确认转导的hnsc表达功能活性hsgsh并将其分泌至培养基中。通过以下方式进一步优化lv中的表达构建体：(i)用人工的、更有效的信号序列替换天然分泌信号序列以增加sgsh分泌，和(ii)通过n264q替换减少糖基化位点以增强靶细胞内吞作用。还利用第三代lv来增加其滴度(vectorbuilder,chicago)。为了评估lv构建体，建立了替代hnsc系，其中所述系源自mps iiia患者的ipsc(“mps3a.hnsc”,gm27162,corielle institute)，其显示出无法检测到的背景sgsh活性。使用mps3a.hnsc和鉴定的最佳gmp兼容性转导条件，测试了各种增强lv转导的聚阳离子——聚凝胺、deae-葡聚糖、鱼精蛋白s和retronectin。随后，以各种感染复数用优化的hsgsh lv转导mps3a.hnsc。将优化的mps3a.hnsc.sgsh系的种子库冷冻保存，解冻后存活率》90％。该库显示出比生理水平高》100倍的sgsh活性，其中34％在24小时内分泌至条件培养基(cm)中(图3)。未转导的mps3a.hnsc与cm一起孵育，在24小时内赋予靶细胞4.5％的cm sgsh。
[0143]
实施例3：为临床目的的细胞递送装置和程序的可行性论证
[0144]
测试了将足够的分泌sgsh的细胞递送至cns中，因为这种递送对于强大的治疗功效是必不可少的。理想地，细胞应放置于主要白质束处或附近，使其将在有髓鞘纤维上运行，使其迅速而广泛地分散在整个脑中并最终向下到达脊髓。因此，手术方法是横穿放射冠、内囊、胼胝体和小脑束。此外，临床目的的细胞递送组件是：fda批准的无框架立体定向平台(“stereoeeg”,fhc,bowdoin,me)、用以容纳细胞悬浮液的带有可拆卸尼龙管的输注插管(fhc)、bd无菌一次性注射器(becton dickinson)、和fda批准的注射泵(alaris cc guard rail,becton dickinson)。在仅使用缓冲液的初步的狗研究中，在健康狗(n＝3)中证明了临床目的的装置和细胞输注程序是可行且安全的(图4)。确定了最大耐受输注体积大约是脑体积的10％。
[0145]
实施例4：hknsc.sgshr细胞的体内评估
[0146]
使用mps3a.rag2遗传免疫缺陷小鼠，测试了实施例1中获得的hknsc.sgshr植入脑中和分泌sgsh的能力。
[0147]
简要地，在出生后第1天(p1)向mps3a.rag2(n＝24)及其野生型(正常)同窝仔(n＝12)等比例注射3μl载体或0.24x106个hknsc.sgshr细胞，注射进入每个半球的纹状体(8)，生存8周。接下来，在p0对幼仔进行基因分型。然后在8周时评估行为表现并进行组间比较。用4％多聚甲醛(pfa)/pbs经心脏灌注所有正常(n＝12)队列和一半的mps3a.rag2的载体和细胞队列。解剖没有灌注的另一半mps3a.rag2，用于收集速冻的新鲜脑。随后，通过ihc分析比较来自载体(n＝6)相对于经细胞处理(n＝6)的mps3a动物的脑匀浆的sgsh和hs水平，比较脑切片中的细胞分布和sgsh表达区域。然后在苏木精伊红染色的脑切片中，检查载体相对于经细胞处理的正常脑的致瘤性。
[0148]
实施例5：使用表达sgsh的神经干细胞治疗mps3a
[0149]
hknsc.sgsh细胞用于治疗mps3a，通过将细胞置于横跨双侧放射冠、内囊和小脑束的白质束中进行，以最少的插管穿透实现最大的细胞扩散。细胞继续分裂2-3个周期，同时沿着白质束迁移，而分泌的sgsh酶通过间质液扩散并被邻近的宿主细胞摄入。
[0150]
施用的细胞的最大耐受剂量估计为总共20ml中大约1.6x109个细胞，细胞浓度为8x107个细胞/ml。预期该细胞数在6个月内在体内扩增至约5.5倍，达到8.8x109个细胞，约占总人脑细胞的5％(估计为1.7x10
11
个细胞，神经元:胶质细胞组成为1:1)。
[0151]
如图1所示，八个注射路径用于将细胞沉积至双侧放射冠、内囊和小脑的白质束中。分两个阶段进行手术：在仰卧位使六个路径进入大脑，然后在2-8周后在俯卧位使两个小脑路径进入。注射坐标的立体定位使用目前神经外科实践中的标准无框架设备。用于临床研究的注射插管是可商购的(fhc,bowdain,me)，先前以计划的细胞密度用于没有并发症的中风患者中。将hknsc.sgsh细胞注射至mps3a患者的脑中，减少了其脑中积累的硫酸乙酰肝素(hs)的量。
[0152]
进一步的考虑
[0153]
在一些实施方案中，本文条款中的任一项可以引用独立条款中的任一项或从属条款中的任一项。一方面，条款中的任一项(例如从属或独立条款)可以与任何其他一个或多个条款(例如从属或独立条款)组合。一方面，权利要求可以包括在条款、句子、短语或段落中列举的一些或全部词语(例如步骤、操作、方式或组件)。一方面，权利要求可以包括在一个或多个条款、句子、短语或段落中列举的一些或全部词语。一方面，可以删除每个条款、句子、短语或段落中的一些词语。一方面，可以将额外的词语或元素加入条款、句子、短语或段落中。一方面，可以在不利用本文所述的一些组件、元素、功能或操作的情况下实施本主题技术。一方面，可以利用额外的组件、元素、功能或操作来实施本主题技术。
[0154]
例如，根据以下描述的各个方面来说明本主题技术。为方便起见，将本主题技术的各个方面的例子描述为带编号的条款(1、2、3等)。这些是作为示例提供的，并不限制本主题技术。注意到可以在任何组合中组合从属条款中的任一项，并置于相应的独立条款中，例如条款1或条款20。其他条款可以以类似的方式呈现。
[0155]
条款1.一种用于在中枢神经系统组织中传播蛋白质的方法，所述方法包括在白质束中沉积包含编码所述蛋白质的核苷酸的神经干细胞，其中所述神经干细胞分泌酶。
[0156]
条款2.根据条款1所述的方法，其中所述蛋白质是溶酶体酶。
[0157]
条款3.根据条款2所述的方法，其中所述溶酶体酶选自：α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、α-n-乙酰葡糖胺酶、β-d-葡糖醛酸酶、β-葡
糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、己糖胺酶a和/或b、α-岩藻糖苷酶、硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、α-或β-d-甘露糖苷酶、n-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-乙酰半乳糖苷酶、神经氨酸酶、天冬氨酸酰化酶、和组织蛋白酶a。
[0158]
条款4.根据条款3所述的方法，其中所述溶酶体酶是n-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)。
[0159]
条款5.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞是迁移性神经干细胞。
[0160]
条款6.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞能够进行至少60次细胞倍增。
[0161]
条款7.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞是人神经干细胞。
[0162]
条款8.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞是粘附性神经干细胞。
[0163]
条款9.根据条款1所述的方法，其中所述中枢神经系统组织是脑。
[0164]
条款10.根据条款1所述的方法，其中所述中枢神经系统组织是脊髓。
[0165]
条款11.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞源自胎儿皮层组织。
[0166]
条款12.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞用cmyc-er条件永生化。
[0167]
条款13.根据条款1所述的方法，其中所述神经干细胞被编程为分化成神经元、少突胶质细胞、和星形胶质细胞。
[0168]
条款14.一种在有需要的受试者的脑中治疗神经退行性疾病的方法，所述神经退行性疾病是由于缺乏溶酶体酶，所述方法包括将神经干细胞施用于脑中一个或多个白质束，其中所述神经干细胞表达受试者的脑中缺陷的酶。
[0169]
条款15.根据条款14所述的方法，其中所述神经退行性疾病是mps iiia(mps3a)。
[0170]
条款16.根据条款14所述的方法，其中所述酶是溶酶体酶。
[0171]
条款17.根据条款16所述的方法，其中所述溶酶体酶是α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、n-磺基葡糖胺磺基水解酶、α-n-乙酰葡糖胺酶、β-d-葡糖醛酸酶、β-葡糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶a、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、己糖胺酶a和/或b、α-岩藻糖苷酶、硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、α-或β-d-甘露糖苷酶、n-天冬氨酰-β-氨基葡糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-乙酰半乳糖苷酶、神经氨酸酶、天冬氨酸酰化酶、和组织蛋白酶a。
[0172]
条款18.根据条款17所述的方法，其中所述溶酶体酶是n-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)。
[0173]
条款19.根据条款14所述的方法，其中所述神经干细胞通过脑内移植而沉积。
[0174]
条款20.根据条款14所述的方法，其中所述中枢神经系统组织是脑。
[0175]
条款21.根据条款14所述的方法，其中将神经干细胞沉积至中枢神经系统组织中的步骤包括将所述细胞注射至双侧放射冠、内囊、和/或小脑的白质束中。
[0176]
条款22.根据条款14所述的方法，其中使用八个注射路径将细胞沉积至双侧放射冠、内囊和/或小脑的白质束中。
[0177]
条款23.根据条款22所述的方法，其中注射分两个阶段进行。
[0178]
条款24.根据条款23所述的方法，其中第一阶段包括在仰卧位以六个路径注射至大脑中，然后在第一阶段注射后约2-8周以两个小脑路径注射。
[0179]
条款25.根据条款15所述的方法，其中所述神经干细胞包含载体，所述载体包含：
(a)人n-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)编码序列；和(b)ef1a启动子，其中所述载体是慢病毒载体，并且其中包含所述载体的神经干细胞的特征在于表达的sgsh蛋白的活性比sgsh蛋白的生理活性高约20倍至约300倍。
[0180]
条款26.根据条款25所述的方法，其中人sgsh编码序列包含人工分泌信号序列，其中与sgsh的天然分泌信号序列相比，所述人工分泌信号序列使sgsh分泌增加约20％至约200％。
[0181]
条款27.根据条款25所述的方法，其中人sgsh编码序列是重组人sgsh编码序列。
[0182]
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的所有表示成分的量、性质(如分子量)、反应条件等的数字将理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据本公开寻求获得的期望特性而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
[0183]
尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告了在具体实施例中列出的数值。然而，任何数值都固有地含有某些误差，由于其各自的测试测量中的标准偏差而必然导致。
[0184]
除非在本文中另有说明或与上下文明显相矛盾，否则在描述本公开的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”、“所述”和类似的指称将解释为涵盖单数和复数。本文中列举数值范围仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值都整合至说明书中，如同在本文中单独列举该值一样。除非在本文中另有说明或与上下文明显相矛盾，否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有例子或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开，而不是对另外要求保护的本公开的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本公开的实践必不可少的任何未要求保护的元素。
[0185]
本文公开的本公开的可选元素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独或与组的其他成员或本文中发现的其他元素以任何组合的方式被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以预期组的一个或多个成员可以包括于组中或从组中删除。当任何此类包括或删除发生时，说明书被视为含有修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
[0186]
本文描述了本公开的某些实施方案，包括发明人已知的用于实施本公开的最佳模式。当然，在阅读以上描述后，这些描述的实施方案的变化形式对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用此类变化形式，并且发明人希望使本公开以不同于本文具体描述的方式被实践。因此，本公开包括在适用法律允许的情况下对所附权利要求中列举的主题的所有修改和等同物。此外，除非在本文中另有说明或与上下文明显相矛盾，否则本公开涵盖上述元素在其所有可能的变化形式中的任何组合。
[0187]
在权利要求中使用“由
……
组成”或“基本由
……
组成”的语言可以进一步限制本文公开的具体的实施方案。当在权利要求中使用时，无论是提交的还是根据修改添加的，过渡术语“由
……
组成”排除未在权利要求中指定的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本由
……
组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤和那些不实质影响基本和新颖特
征的材料或步骤。如要求保护的本公开的实施方案在本文中内在地或明确地描述和启用。
[0188]
将理解的是，本文所公开的本公开的实施方案是对本公开的原理的说明。可以采用的其他修改在本公开的范围内。因此，通过示例而非限制的方式，可以根据本文的教导使用本公开的可选配置。因此，本公开不限于精确地如所示和所描述的那样。
[0189]
尽管本文通过参考各种具体材料、程序和实施例来描述和说明本公开，但应理解的是，本公开不限于为此目的选择的材料和程序的具体组合。如本领域技术人员将理解的，可以隐含此类细节的许多变化。旨在将说明书和实施例仅视为示例性的，本公开的真实范围和精神由所附权利要求指示。本技术中提及的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文。