西藏簇角缨象天牛气味结合蛋白基因序列及其应用的制作方法

no.4。
6.能够编码上述西藏簇角缨象天牛气味结合蛋白的氨基酸序列的基因序列，包括obp6基因序列和obp10基因序列，所述的obp6基因序列选自seq id no.1，所述的obp10基因序列选自seq id no.3。
7.本发明还提供了obp6氨基酸序列和obp10氨基酸序列在识别核桃气味化合物中的应用。
8.进一步的，所述的obp6基因序列所编译的气味结合蛋白在识别核桃气味化合物反式
‑2‑
己烯醛中的应用。
9.进一步的，所述的obp10基因序列编译的气味结合蛋白在识别核桃气味化合物香叶醇中的应用。
10.本发明的有益效果是：1、本发明通过实验筛选出了西藏簇角缨象天牛与核桃气味化合物相结合的气味结合蛋白及其氨基酸序列以及能够编码该氨基酸序列的基因序列，据此可以开发出相应的引诱剂以将西藏簇角缨象天牛引诱至捕获区域。
11.2、本发明通过实验详细阐述了西藏簇角缨象天牛气味结合蛋白基因序列obp6和obp10基因序列的测序过程以及其与核桃气味化合物的筛选结合过程，阐述了西藏簇角缨象天牛的嗅觉识别机制，丰富了西藏簇角缨象天牛化学生态学理论，丰富了西藏簇角缨象天牛及类似昆虫的防治的防治新方法和新途径。
附图说明
12.图1是obp6和obp10基因原核表达载体构建示意图；
13.图2是obp6和obp10基因pcr电泳图，图中lane1：ccreobp10pcr条带，lane2：ccreobp6 pcr条带；
14.图3是obp6和obp10基因菌落pcr阳性鉴定图；
15.图4是obp6基因测序结果图；
16.图5是obp10基因测序结果图；
17.图6是obp6纯化蛋白的sds
‑
page分析结果图；
18.图7是obp10纯化蛋白的sds
‑
page分析结果图；
19.图8是obp6蛋白与1
‑
npn结合曲线图；
20.图9是obp10蛋白与1
‑
npn结合曲线图；
21.图10是obp6与不同气味分子的竞争结合曲线图；
22.图11是obp10与不同气味分子的竞争结合曲线图。
具体实施方式
23.下面结合附图和实施例，对本技术作进一步详细描述。以下实施例用于说明本技术，而不是用来限制本技术的范围。
24.本实施例中的供试昆虫：西藏簇角缨象天牛成虫于2018年6月采自云南省大理州弥渡县核桃经济林，在核桃林间采集活的西藏簇角缨象天牛成虫置于养虫笼带回实验室。
25.供试植物：样品于2018年5月采自云南省大理州弥渡县核桃林。在三台核桃(juglans sigillata
‘
san
‑
tai’)林中随机选取3株西藏簇角缨象天牛取食过3d的核桃树进
行采样，同时选取3株树龄相同的健康核桃树作为对照。选取距离地面2m的核桃枝干，用剪刀剪下后采集树皮和树叶，置于冰盒中带回实验室处理。每个样品设3个重复。
26.实施例
27.1、西藏簇角缨象天牛cdan文库的构建
28.1.1采用trizol法分别提取西藏簇角缨象天牛雌雄成虫的触角、头、雄、腹、足、翅的总rna，提取的总rna样品经检测合格后，使用携带oligo(dt)的磁珠富集真核生物mrna；随后加入fragmenta tion buffer将mrna打断成短片段，以mrna为模板，并使用六碱基随机引物合成一链cdna，然后用dna聚合酶合成第二链cdna；用ampure xp beads对双链cdna纯化后，进行末端修复，加a尾连接测序接头，用ampure xp beads选择片段大小；进行pcr扩增，用ampure xp beads对pcr扩增后产物纯化，获得最终的文库。文库构建好后，先用qubit2.0初步定量，然后稀释至1.5mg/μl后用ag ilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，用q
‑
pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量，确保文库的质量
29.2、气味结合蛋白基因的鉴定
30.cdan文库检验合格后，进行illumina hiseq测序。测序完成后获得raw reads，除去含有带接头和低质量的reads，然后对raw read s进行过滤，即得到高质量的clean reads，使用trinity对clean reads进行拼接和过滤后获得转录本序列，最终选取最长的转录本作为uni genes。组装和拼接后共获得222,946条转录本，转录本的平均长度为807bp，n50的长度为1584bp，得到89,897条unigenes，unigenes的平均长度和n50的长度分别为1036bp和1626bp。
31.利用blast同源搜索比对的方法从西藏簇角缨象天牛测序的转录组中鉴定obp基因。在ncbi(national center for biotechnology information)的protein数据库以及公开发表文献报道的登录号分别下载赤拟谷盗、光肩星天牛、黄斑星天牛、松褐天牛和灭字脊虎天牛的obp基因序列作为靶标序列，利用tbtools软件进行blast进行同源性比对搜索，通过比对得到候选obp基因，然后在ncbi数据库中的protein blast进行同源比对搜索，确定西藏簇角缨象天牛的obp基因。
32.根据测序结果，克隆、表达候选基因，纯化候选蛋白，病通过荧光竞争试验，从31个obp基因中，筛选出了2个能够分别识别反式
‑2‑
己烯醛和香叶醇的基因，第一个基因的序列为seq id no.1，第二个基因的序列为seq id no.2。
33.3 obp6和obp10基因序列的pcr扩增和测序
34.3.1引物设计
35.选取的2个obp基因(ccreobp6和ccreobp10)，去除n端的信号肽，设计特性引物,根据原核表达载体图，如图1所示，同时，在引物中设计加入ndei、xhoi酶切位点(下划线表示)，引物序列如表1所示。
36.表1 ccreobp6和ccreobp10基因克隆引物
[0037][0038]
3.2 pcr扩增和测序
[0039]
以西藏簇角缨象天牛成虫触角cdna为模板，按照试剂盒的说明书进行pcr扩增，扩增体系(50μl)。pcr反应体系见表2。
[0040]
表2 pcr反应体系
[0041][0042]
pcr反应程序：
[0043][0044]
pcr产物经1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0045]
以西藏簇角缨象天牛成虫的触角cdna为模板，对ccreobp6和ccreobp10基因进行pcr扩增结果如图2，从图中可知，pcr分别获得386bp和395bp，与这目的基因片段大小一致。
[0046]
3.3表达载体的构建
[0047]
选用ndei和xhoi两种限制性内切酶对pcr产物和表达载体进行双酶切，酶切体系见表3。
[0048]
表3酶体切系
[0049][0050]
以上酶切体系混匀后置于37℃水浴锅中反应15min，然后进行切胶回收，用t4 dna ligase将切胶回收的目的片段与载体pabe进行连接，连接反应体系20μl，在37℃温度下连接5min。见表4。
[0051]
表4连接体系
[0052][0053]
连接产物转化bl21(de3)感受态细胞，具体步骤如下：
[0054]
(1)将上一步连接产物加入至50μl bl21(de3)感受态细胞，冰上放置30min。
[0055]
(2)42℃水浴中准确热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3
‑
5min。
[0056]
(3)向管中加入1ml lb液体培养基，混匀后于37℃，160rpm摇床振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。
[0057]
(4)将上述菌液离心，去除800μl上清，余下培养基吸打混匀后取涂布于lk筛选平板上。
[0058]
(5)倒置培养皿，37℃培养16
‑
24h。
[0059]
(6)挑取10个左右进行克隆，置入600ml lk液体培养基中，放入摇床(200r/min，3
‑
4h)，并进行菌液pcr阳性鉴定，pcr体系以程序与以上相同，pcr产物跑胶，最后，将阳性克隆菌液送测序公司测序。鉴定结果如图3所示，将阳性克隆送公司测序，测序结果如图4和5所示，从图中可看出测序结果与目标基因ccreobp6和ccr eobp10序列一致。
[0060]
4、obp6和ccreobp10蛋白的表达和纯化
[0061]
4.1蛋白的诱导表达
[0062]
将阳性bl21接于5ml lb液体培养基中，并加入5μl卡那霉素，37℃、200rpm全温振荡培养箱培养至对数生长期(od600＝0.6
‑
0.8)。然后加入5μl iptg(1000mm)至终浓度为1mm(负对照为不加iptg诱导剂)，37℃，200rpm全温振荡培养箱诱导4h。
[0063]
4.2蛋白的纯化
[0064]
(1)将菌体用裂解buffer重悬后进行超声破碎。
[0065]
(2)蛋白存在于上清中的样品4℃，12000g离心5min取上清。蛋白存在于包涵体中
的样品，低温离心收集沉淀，沉淀用变性buffer溶解后离心取上清。
[0066]
(3)将上述获得的上清液，通过ni亲和层析柱进行蛋白纯化。纯化后的蛋白进行透析或者是经过复性后的蛋白进行透析。步骤如下：
[0067]
①
用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
[0068]
②5‑
10倍柱体积buffer平衡柱子，buffer：0.02m pb、0.5mnacl，10mm咪唑；
[0069]
③
将样品以0.5ml/min的速度流穿镍柱；
[0070]
④
用上述buffer平衡柱子；
[0071]
⑤
分别用50mm咪唑、300mm咪唑、500mm咪唑洗脱；
[0072]
⑥
将洗脱下来的样品分别进行sds
‑
page胶分析是否有目的蛋白。
[0073]
ccreobp6和ccreobp1基因的原核表达载体经iptg诱导培养后，通过ni亲和层析柱纯化获得ccreobp6和ccreobp10蛋白，纯化蛋白的sds
‑
page分析结果如图6，7，从图中可，看出，ccreob p6和ccreobp10蛋白分子量大小分别约为14.7kda和13.0kda，蛋白条带与目标基因蛋白大小相符。
[0074]
5荧光竞争结合实验
[0075]
5.1核桃树皮、树叶挥发性物质的提取
[0076]
采用同步蒸馏萃取仪提取核桃树皮和树叶挥发性物质(泽桑梓等，2011)。取新鲜健康的和取食后的树皮、树叶各100g，剪碎后分别放到2 000ml圆底烧瓶中，加入400ml蒸馏水蒸馏4h，用20ml色谱纯正己烷进行同步萃取。然后在正己烷萃取液中加入干燥的无水硫酸钠脱水，用n2吹扫法对萃取液进行浓缩。
[0077]
5.2气质联用仪(gc
‑
ms)测试
[0078]
色谱柱：hp
‑
5ms弹性石英毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，进样量2.0μl，无分流进样.升温程序：柱温60℃保留2min，以4℃/min升到100℃，保持5min，以10℃/min升到260℃，保持5min。电离方式为ei源，离子源温度230℃；电子能量70ev；接口温度280℃；质量扫描范围40～500amu。挥发物成分鉴定通过标准化合物比对以及nistd2质谱库出峰时间和质谱图进行匹对，通过面积归一化法测定各种挥发性化合物的相对含量(杜家纬，2001)。
[0079]
5.3荧光探针结合实验
[0080]
配制浓度为50mm的tris
‑
hcl(ph＝7.4)缓冲液，使用n
‑
苯基
‑1‑
萘胺(1
‑
npn)作为荧光探针，并以色谱级甲醇为溶剂，将荧光探针1
‑
npn和20种气味标样均溶于甲醇中并配置成浓度为1mm的溶液，配置好的溶液置于
‑
20℃冰箱保存备用，使用96micro well tm微孔板(nunclontm)加样品，设置多功能酶标仪(varioskan flash)激发光波长为337nm，扫描发射波长范围在370～550nm之间，激发和发射狭缝均设置为5nm。
[0081]
ccreobp6和ccreobp10蛋白与荧光探针1
‑
npn结合常数的测定，向微孔板中分别加入ccreobp6和ccreobp10蛋白溶液，并加入tris
‑
hcl(ph＝7.4)缓冲液，使ccreobp6和ccreobp10蛋白的终浓度为2μμ，依次加入2、4、6、8、12、16和20μμ浓度的1
‑
npn，每加一次记录下发射波长最高点(em＝410nm)的荧光强度值，进行三次重复实验。
[0082]
ccreobp6和ccreobp10蛋白与20种气味标样结合能力测定，在96micro welltm微孔板中分别加入ccreobp6和ccreobp10蛋白溶液以及1
‑
npn，随后加入tris
‑
hcl(ph＝7.4)缓冲液使两个蛋白溶液和1
‑
npn的终浓度均为2μμ，待蛋白溶液和荧光探针1
‑
npn充分结合后，测定并记录下(em＝410nm)的荧光强度值，然后分别依次加入2、4、6、8、12、16和20μμ浓
度的气味标样，分别记录下荧光强度的变化，重复三次实验。蛋白与气味标样解离常数计算公式为：ki＝[ic 50]/(1 [1
‑
npn]/k 1
‑
npn)。其中ic 50代表荧光强度值减低一半时气味标样的浓度，[1
‑
npn]为未结合的1
‑
npn浓度，k 1
‑
npn为蛋白和1
‑
npn复合物的结合常数。
[0083]
表5
‑
5荧光竞争结合实验气味标样
[0084][0085]
5.4 obp6和obp10蛋白与不同气味的结合特性分析
[0086]
本实验选取西藏簇角缨象天牛寄主核桃释放的20种挥发性化合物与其气味结合蛋白进行荧光竞争结合实验，包括9种萜烯类、5种醇类、3种酮类和3种醛类化合物。实验结果表明，西藏簇角缨象天牛气味结合蛋白ccreobp6和ccreobp10和荧光探针1
‑
npn具有很好
的结合能力图5
‑
8，9，ccreobp6和ccreobp10的解离常数分别为7.09和6.18μmol/l，ccreobp6与氧化石竹烯、1，6
‑
环癸二烯、正己醛和叶绿醇等4个气味标样不结合图5
‑
10，与其它16个气味标样均有结合，相对荧光值下降到50％以下的气味标样只有松油醇ic 50值为19.71，ki值为15.64μmol/l，反式
‑2‑
己烯醛，ic 50值为16.25，ki值为12.90μmol/l，结合能力最强的气味标样是反式
‑2‑
己烯醛，结合能力最弱的气味标样是桉叶油醇，相对荧光值仅下降了10.84％。
[0087]
由图8
‑
11可以看出，除正己醛和叶绿醇外，ccreobp10与其他18种气味标样均有结合能力，相对荧光值下降到50％以下的气味标样有月桂烯、1
‑
石竹烯、松油醇和反式
‑2‑
己烯醛，其中，ccreobp10与香叶醇的结合能力最强，ic 50值为16.54，ki值为12.73μmol/l，其次是月桂烯，ic 50值为17.91，ki值为13.81μmol/l，与邻苯二甲酸二异丁酯结合能力最弱，相对荧光值仅下降了6.4％。