一株能提升酱油风味的地衣芽孢杆菌及其在发酵食品中的应用

1.本发明涉及微生物及酱油调味品等发酵食品领域，具体涉及地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）mut-80及其在提升发酵食品酱香风味中的应用。


背景技术：

2.酱油是备受我国消费者喜爱的传统调味品，通常其酿造原料以大豆或豆粕为主，辅以小麦粉等，经制曲、醅料发酵和浸出取油等多个复杂步骤而得。目前现代酱油的酿造方法按原料发酵状态或微生物接种方法可以细分为四种工艺，分别为高盐稀态发酵工艺、高盐固态发酵工艺、低盐固态发酵工艺、无盐固态发酵工艺，我国当前酱油的工业化生产大多采用低盐固态发酵工艺，而此类酱油产品品质则不及采用高盐固态发酵工艺的酱油产品。高盐固态发酵工艺往往和自然晒露发酵法联用，借助环境中的功能微生物进行天然制曲和缓慢自然发酵，所得酱油产品香气浓郁丰富；而现代工艺速酿酱油大多采用低盐固态发酵工艺和人工接菌技术，虽然质量相对稳定，但存在香气不足等问题，且产品同质化严重，因此现代速酿型酱油产品的风味仍待提升。
3.酱油作为发酵制成的调味品，酱醅功能微生物的重要性不言而喻，酱油酿造过程中的原料利用率及最终酱油产品所蕴含的复杂香气都与酱醅功能微生物的代谢密不可分。酱醅功能微生物组成混合菌群发酵体系，在酱醅的发酵过程中代谢产生醇类、酯类、酸类、酮类、醛类、酚类和杂环类化合物等挥发性物质，赋予酱油浓郁酱香风味。芽孢杆菌因其在高盐高温环境中具有良好耐受性，存在于各类传统发酵食品中。经本实验室前期研究发现，在采用高盐固态发酵工艺和自然晒露技艺酿造而成的高品质酱油——先市酱油的酱醅微生物群落中芽孢杆菌属占到了67%，即属于先市酱油酱醅中的优势菌属。通过对先市酱油酱醅中的野生芽孢杆菌属细菌进行相关研究后发现其对酱油醅料发酵过程有一定呈味增香的作用，具有研究价值。
4.综上，通过人工选育出产酱香风味能力突出且能够耐受酱醅发酵高盐高温环境的优质芽孢杆菌于酱醅发酵过程中添加，菌株代谢生成的多种挥发性香气物质能够促进酱油总体香气的形成，具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在针对现代工业速酿酱油香气不足这一问题，提供一种地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）mut-80及其在提升发酵食品酱香风味中的应用，该地衣芽孢杆菌mut-80经发酵能够代谢产生多种酱油重要香气物质，如1-辛基-3-醇、苯乙醛、愈创木酚和2-戊基呋喃等，具有较强产香能力，该菌株的运用可以在一定程度上丰富现代工业速酿酱油等发酵食品的酱香风味。同时，本发明所述地衣芽孢杆菌mut-80能够在14%的高盐环境下生长，且耐受50℃高温；在10%的高盐环境下地衣芽孢杆菌mut-80能分泌蛋白酶、淀粉酶，发酵食品中氨基酸态氮含量能够得到提升。
6.本发明通过以下技术方案实现：本发明提供的地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）mut-80，已于2021年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号cgmcc no.22139。
7.所述地衣芽孢杆菌mut-80是在四川省泸州市先市酱油酿造酱醅野生地衣芽孢杆菌xs-4的基础上，对其进行常压室温等离子体诱变（atmospheric room temperature plasma）选育，经筛选得到1株能提升酱香风味的产香芽孢杆菌，即地衣芽孢杆菌mut-80。
8.所述地衣芽孢杆菌mut-80在nutrient broth（nb）琼脂培养基上生长良好，菌落形态为不规则状，形成具有堤状隆起的白色半透明大菌落，表面略湿润且有黏液。通过光学显微镜对其菌体形态进行观察，菌株以离散状态的短杆状营养体为主，有芽孢。
9.所述地衣芽孢杆菌mut-80，通过自主设计引物gyra f和gyra r对其gyra基因进行扩增，得到965 bp目的基因序列，具体如序列见sequence listing。将测序所得基因序列进行blast比对，其与genebank中的bacillus licheniformis标准菌株cp045814.1相似率达99.48%，确定该菌株为地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）。
10.所述地衣芽孢杆菌mut-80的主要产香特征为：本发明通过模拟酱醅发酵体系，将所述地衣芽孢杆菌mut-80接种至发酵培养基中，并证实所述地衣芽孢杆菌mut-80能够产生多种挥发性香气物质，包含酱油香气重要组成物质1-辛基-3-醇、苯乙醛、愈创木酚和2-戊基呋喃等。
11.进一步，为探究地衣芽孢杆菌mut-80是否耐受酱油等发酵食品酿造环境，本发明对地衣芽孢杆菌mut-80在不同nacl盐浓度、不同温度和不同ph环境下的生长情况进行检测，发现地衣芽孢杆菌mut-80能够耐受14% nacl盐浓度和50℃的高温，并能够在ph4.0-9.0范围内生长。在满足最适温度40℃、最适ph（ph=7）的条件下，其在24小时内的生长情况如下：第4小时起，菌株进入对数期，10小时后进入稳定期，菌株生长速率逐渐平稳，代谢产物积累。
12.又进一步，为探究地衣芽孢杆菌mut-80的产酶能力，本发明将地衣芽孢杆菌mut-80分别接种到nacl盐浓度均为10%的酪素培养基、淀粉培养基，通过牛津杯法测定水解圈直径与菌株生长直径之比，证明所述地衣芽孢杆菌mut-80能够在高盐环境中分泌蛋白酶、淀粉酶。经测定发现，地衣芽孢杆菌mut-80所产酸性蛋白酶酶活为14.71 u/g，α-淀粉酶酶活为14.1 u/g；地衣芽孢杆菌mut-80接种至发酵培养基发酵培养8天后氨基酸态氮含量达到0.0156 g/100ml。
13.以上研究结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌mut-80能够在发酵培养基中代谢生成挥发性香气物质1-辛基-3-醇、愈创木酚和2-戊基呋喃等；其中2-戊基呋喃具有焦糖和烘炒味，愈创木酚具有强烈烟熏味，1-辛基-3-醇则被广泛认为具有蘑菇香味；而苯乙醛被认为具有浆果和蜂蜜味，都属于被文献广泛报道的酱油风味的重要组成物质。地衣芽孢杆菌mut-80主要发酵特征满足酱醅发酵的要求，能够耐受酱醅发酵高盐高温环境，且在高盐环境下能够分泌蛋白酶、淀粉酶，因此本发明提供的地衣芽孢杆菌mut-80具有运用于酱油等发酵食品实际生产的潜力。
14.与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：本发明提供的地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）mut-80，以分离自四川省
泸州市先市酱油酿造酱醅的野生芽孢杆菌xs-4为起始菌株，对其进行常压室温等离子体诱变育种，经筛选得到1株能提升酱香风味的产香芽孢杆菌，即地衣芽孢杆菌mut-80。在发酵培养代谢生成挥发性香气物质方面，地衣芽孢杆菌mut-80能够生成苯乙醛、2-乙基己醇、1-辛基-3-醇、愈创木酚、2-戊基呋喃和丙酸异戊酯等酱油香气物质的能力优于起始菌株xs-4。地衣芽孢杆菌mut-80能够耐受14% nacl盐浓度和50℃的高温，满足酱醅等发酵食品的酿造环境条件。与起始菌株xs-4相比，地衣芽孢杆菌mut-80在10%高盐环境下产蛋白酶和淀粉酶的能力均有提高，分别提升33.73%和19.17%，具有较好的分泌蛋白酶和淀粉酶的能力，经测定地衣芽孢杆菌mut-80发酵液中氨基酸态氮含量也高于起始菌株xs-4；因此，可以认为地衣芽孢杆菌mut-80与起始菌株xs-4相比，在产酱香风味方面和产酶的能力均得到提升。本发明提供的地衣芽孢杆菌mut-80应用于现代工业速酿酱油等发酵食品的生产中能够增添酱香风味，有望将传统高品质酱油的风味带给现代化酱油等发酵食品产业。
附图说明
15.图1为本发明地衣芽孢杆菌mut-80在nb琼脂培养基的菌落形态图；图2为本发明地衣芽孢杆菌mut-80在光学显微镜下的经革兰氏染色后的细胞形态图；图3为本发明地衣芽孢杆菌mut-80耐盐曲线图。
16.图4为本发明地衣芽孢杆菌mut-80温度耐受曲线图。
17.图5为本发明地衣芽孢杆菌mut-80 ph耐受曲线图。
18.图6为本发明地衣芽孢杆菌 mut-80所属的起始菌株地衣芽孢杆菌xs-4在nb琼脂培养基的菌落形态图。
具体实施方式
19.下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明的实施方式不限于此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
20.以下为本发明实施例中所采用的培养基：一、nb琼脂培养基：10g蛋白胨、3g牛肉浸粉、5g氯化钠、18g琼脂粉、1l蒸馏水，ph 值7.2
±
0.2，121℃灭菌15min。
21.二、主要发酵特征检测培养基：1）10%盐浓度牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏3 g/l、琼脂20 g/l、nacl 100 g/l，ph7.0，121℃灭菌20min；2）10%盐浓度酪素培养基：干酪素4 g/l 于碱性条件下溶解后调节ph至中性，115℃灭菌20min 后与100 g/l 盐浓度牛肉膏蛋白胨培养基混匀；3）10%盐浓度淀粉培养基：取牛肉膏5 g/l、蛋白胨10 g/l、氯化钠100 g/l、可溶性淀粉2 g/l、琼脂20 g/l，ph7.0，121℃灭菌20min；4）耐盐实验培养基：在nb液体培养基基础上加入nacl，使nacl终浓度分别为8%、10%、12%、14%、16%。
22.5）发酵培养基：将黄豆粉、小麦粉、新鲜酱醅用缓冲液na2hpo4/kh2po4配置成缓冲体系，然后煮匀，搅拌后四层纱布过滤，调节ph=5～5.2，灭菌即得，其中每1l缓冲液na2hpo4/
kh2po4中含有黄豆粉10 g、小麦粉2.5 g、新鲜酱醅50 g。
23.上述培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。
24.下述实施例中所采用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
25.实施例1地衣芽孢杆菌mut-80的分离、培养及分子鉴定：将本实验室前期从酱醅中所筛选出的野生芽孢杆菌xs-4进行常压室温等离子体诱变，具体操作步骤如下：从平板挑取活化后的野生芽孢杆菌xs-4接于液体种子培养基中，37℃、200 r/min培养至对数生长期的中后期，取1 ml菌液测其od值。根据od值及菌落数的大体关系估算菌体浓度，取1 ml菌液8000 r/min离心2 min，收集沉淀并用生理盐水洗涤2～3次，将其稀释至10
6 cfu/ml的菌悬液。
26.取上述菌悬液滴加到配套载片表面，滴加量为10 ul，后至artp诱变系统中诱变，诱变参数如下：载气为氦气，输出功率120 w，照射距离2 mm，气体流速10 (l/min-1
） ，照射时间分别为0s，30s，60s，90s，120s和150s。诱变后将金属载片放入装有1 ml无菌水的ep管中，充分振荡混匀1min，用pbs缓冲液将不同处理时间下的芽孢杆菌悬浮液梯度稀释至10-1
、10-2
、10-3
、10-4
，制成稀释液，选择合适的稀释度用无菌涂布棒在 nb 平板上涂布，37 ℃下恒温培养2-3d。待菌落数目形成稳定后，根据培养基上的菌落形态和初步镜检观察，挑选不同的特征菌落进行培养，经筛选后得到本发明地衣芽孢杆菌mut-80。
27.本发明地衣芽孢杆菌mut-80经多次划线分离纯化后，用nb液体培养基进行扩大培养，提取dna，使用引物gyra f、gyra r对其gyra基因进行扩增，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最终延伸10min。
28.上述设计引物gyra f和gyra r由生工公司（上海）合成。
29.gyra f序列为cagtcaggaaatgcgtacgtcctt-3'，gyra r序列为5-caaggtaatgctccaggcattgct-3'。扩增片段测序长为965 bp，将测序得到的基因序列输入ncbi数据库进行比对，与genebank中的bacillus licheniformis标准菌株cp045814.1相似率达99.48%，鉴定菌株mut-80为bacillus licheniformis，即地衣芽孢杆菌。
30.将所述地衣芽孢杆菌mut-80 划线于nb 琼脂培养基上，37℃倒置培养48 h后，对菌株的菌落形态进行观察。如图1所示，所述菌株mut-80在nb培养基上生长良好，菌落为不规则状，形成具有堤状隆起的白色半透明大菌落，表面略湿润且有黏液。
31.对所述地衣芽孢杆菌mut-80的菌体通过革兰氏染色方法进行光学显微镜观察，如图2所示，地衣芽孢杆菌mut-80细胞呈离散状态的短杆状营养体为主，有芽孢。
32.实施例2地衣芽孢杆菌mut-80应用于模拟酱醅培养基发酵：1、将培养至对数期的地衣芽孢杆菌mut-80以4%的接种量接至发酵培养基中，在37℃下120 rpm摇瓶培养8天，以10000 r/min的转速离心10min，无菌条件下过滤收集发酵液。同时起始菌株xs-4按照同样的发酵培养方法作为对照；以未添加任何菌株的发酵培养基作为空白对照（ck）。
33.2、发酵培养液香气成分的hs-spme-gc/ms分析：所述发酵液的挥发性香气物质的检测方法为：准确吸取8 ml发酵液样品于25 ml
顶空瓶中，加盖密封，将已完成老化的萃取头插入瓶子的顶空部分，于60℃的恒温水浴中萃取30 min。样品通过hp-5ms型弹性石英毛细色谱柱（30 m
×
0.25 mm
×
0.25μm）进行分离；程序升温条件为起始温度50℃，保持2 min，以6℃每分钟升到200℃，再以10℃每分钟升至250℃，保持6 min；载气为高纯氦气（1.0 ml/min）；不分流进样。质谱采用电子轰击电离源；电子能量70 ev；离子源温度230℃；扫描范围50～550 m/z。对采集到的质谱图利用nist08和wiley09谱库检索进行组分分析，并用气相色谱峰面积归一化法计算出各香气组分的相对含量，结果见表1。
34.从表1可以看出，将地衣芽孢杆菌mut-80接种至发酵培养基中于37℃下120 rpm转速下摇瓶培养8天后，与未接种菌株的空白组相比，地衣芽孢杆菌mut-80产生了多种挥发性香气物质，发酵液中包含酱油香气形成的重要物质苯乙醛、1-辛基-3-醇、愈创木酚、丙酸异戊酯和2-戊基呋喃等。由此说明本发明以先市酱油酱醅的野生芽孢杆菌xs-4为起始菌株进行诱变育种得到的这株能提升酱香风味的产香芽孢杆菌mut-80对酱油风味物质的形成贡献较大，对于现代速酿酱油等发酵食品产业具有重要应用价值。
35.实施例3地衣芽孢杆菌mut-80耐受特性探究：1、耐盐试验：将地衣芽孢杆菌mut-80分别接种至浓度为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的nacl耐盐试验培养基中，37℃恒温培养24h后于600nm处测定od值，绘制mut-80对nacl的耐受曲线。如图3所示。
36.2、不同温度生长情况：将地衣芽孢杆菌mut-80接种到nb液体培养基中，分别在20℃、30℃、40℃、50℃下培养24h，600nm处测定od值，绘制mut-80对温度的耐受曲线，如图4所示。
37.3、不同ph生长情况：将地衣芽孢杆菌mut-80接种到ph分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的nb液体培养基中，37℃培养24h，600nm处测定od值，绘制mut-80对ph的耐受曲线，如图5所示。
38.通过上述试验，检测到所述地衣芽孢杆菌mut-80能够至少耐受14%nacl盐浓度，并能够在ph 4.0-9.0和20～50℃生长。
39.实施例4探究地衣芽孢杆菌mut-80在10%盐浓度的高盐环境下分泌蛋白酶和淀粉酶的能力：挑取地衣芽孢杆菌mut-80纯培养菌株接种至10%盐浓度牛肉膏蛋白胨液体培养基培养，37℃培养12 h，收集菌体制备成od
600nm
=0.8的菌悬液，取100 μl菌悬液接种至插在10%盐浓度酪素培养基的牛津杯中，37℃培养72 h后，测量水解圈直径与菌株生长直径。按照酪素培养基所述方法取100 μl菌悬液接种到插在10%盐浓度淀粉培养基的牛津杯中，37℃培养72 h后，将碘液喷洒在淀粉培养基上，待显色后测量水解圈直径与菌株生长直径。计算水解圈与菌株生长直径之比，即能比较菌株间产酶能力；以诱变起始菌株xs-4作为对照。地衣芽孢杆菌mut-80和起始菌株xs-4在10%高盐环境下分泌蛋白酶和淀粉酶能力的比较结果如表1所示。与起始菌株xs-4相比，地衣芽孢杆菌mut-80在高盐环境下分泌蛋白酶和淀粉酶的能力均有一定程度提升，分别提升了33.73%和19.17%，参见表2。
[0040] 备注：表中数据代表菌株生长直径和水解圈直径之比。
[0041]
实施例5测定地衣芽孢杆菌mut-80蛋白酶和淀粉酶酶活：挑取地衣芽孢杆菌mut-80纯培养菌株接种至nb液体培养基中37℃下培养12h后，测定菌液中所含酸性蛋白酶和α-淀粉酶酶活，结果如表2所示。地衣芽孢杆菌mut-80分泌的酸性蛋白酶酶活为14.71 u/g，是起始菌株xs-4的1.9倍；地衣芽孢杆菌mut-80所分泌的α-淀粉酶酶活为14.1 u/g，是起始菌株xs-4的2.4倍。将地衣芽孢杆菌mut-80按实例2接种至酱醅培养基进行37℃为期8天的发酵后，运用甲醛滴定法测定发酵液中氨基酸态氮含量发现，地衣芽孢杆菌mut-80发酵液中氨基酸态氮含量为0.0156 g/100ml，比起始菌株xs-4发酵液中氨基酸态氮含量高0.0037 g/100ml，参见表3。
[0042]