一种以紫锥菊叶柄作为外植体建立遗传转化体系的组合物及方法

技术特征：
1.一种以紫锥菊叶柄建立遗传转化体系的组合物，其特征在于，包括：农杆菌侵染液：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、0.1mmol/l乙酰丁香酮，ph＝5.8；ms扩繁培养基：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、4.8g/l琼脂粉、0.1g/l肌醇、0.4mg/l 6-ba、0.01mg/lnaa，ph＝5.8；ms抑菌培养基：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、4.8g/l琼脂粉、0.1g/l肌醇、0.4mg/l 6-ba、0.01mg/lnaa，200mg/l特美汀，ph＝5.8；ms抗性筛选1培养基：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、4.8g/l琼脂粉、0.1g/l肌醇、0.4mg/l 6-ba、0.01mg/lnaa、100mg/l特美汀、3mg/l潮霉素，ph＝5.8；ms抗性筛选2培养基：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、4.8g/l琼脂粉、0.1g/l肌醇、0.6mg/l 6-ba、0.01mg/lnaa、50mg/l特美汀、6mg/l潮霉素，ph＝5.8；生根诱导培养基：4.4g/l ms培养基基盐、30g/l蔗糖、4.8g/l琼脂粉、0.1g/l肌醇、0.02mg/lnaa，50mg/l特美汀(timentin)，ph＝5.8。2.基于权利要求1所述组合物的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将紫锥菊无菌组培苗置于无菌环境，取叶柄接种后暗培养诱导，得外植体；(2)将含有报告基因的载体导入农杆菌中，得到的工程菌株继续培养，离心收集菌体后，用农杆菌侵染液进行重悬得菌液，备用；(3)将步骤(2)的菌液侵染步骤(1)得到的外植体；侵染后的外植体接种后暗培养；(4)将步骤(3)暗培养后的外植体冲洗，置于含特美汀的无菌水中浸泡处理；(5)将步骤(4)处理后的外植体转接，暗培养；(6)将步骤(5)暗培养后的外植体转接至ms抗性筛选1培养基中进行初步筛选直至长出抗性愈伤组织；(7)将所述步骤(6)抗性愈伤组织转接至ms抗性筛选2培养基中培养至长出不定芽，转接至生根诱导培养基诱导不定根，获得完整的紫锥菊转基因苗。3.如权利要求2所述的建立方法，其特征在于，步骤(1)所述置于无菌环境：置于超净台；所述叶柄：长度1～2cm；所述接种：接种至ms扩繁培养基；所述暗培养诱导：时间2～4d。4.如权利要求3所述的建立方法，其特征在于，步骤(2)所述含有报告基因的载体：质粒pcambia1305；所述继续培养：置于含卡那霉素和利福平的lb液体培养基，于28℃振荡培养1～2天；将菌液转移至含卡那霉素和利福平的lb液体培养基进行扩大培养，至od
600
值为0.5～0.8；所述离心：4000～6000rpm，时间5min。5.如权利要求4所述的建立方法，其特征在于，步骤(3)所述侵染的时间为20min，侵染后吸干外植体表面多余的菌液；所述接种：接种至ms扩繁培养基中，所述暗培养：黑暗条件下共培养2d。6.如权利要求5所述的建立方法，其特征在于，步骤(4)所述冲洗：无菌水冲洗3遍至外植体表面无肉眼可见的菌丝残留；所述特美汀的的浓度：200mg/l；所述浸泡处理：浸泡10～15min，吸干水分。7.如权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤(5)所述转接：至ms抑菌培养基中；所述暗培养：时间7d。8.如权利要求7所述的建立方法，其特征在于，步骤(6)所述初步筛选：每隔一周更换一次ms抗性筛选1培养基，时间2～4周。
9.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，步骤(7)所述转接：每隔半月更换一次ms抗性筛选2培养基；所述不定芽：还包括gus染色和pcr鉴定；所述转接：鉴定为阳性的不定芽从基部切取，再转接至生根诱导培养基中。10.权利要求1所述的组合物或权利要求2～9任一所述方法在农业生产、育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种以紫锥菊叶柄作为外植体建立遗传转化体系的组合物及方法。属于植物基因工程育种技术领域。包括：农杆菌侵染液；MS扩繁培养基；MS抑菌培养基；MS抗性筛选1培养基；MS抗性筛选2培养基；生根诱导培养基，并提供了建立遗传转化体系的方法。本发明可以快速对紫锥菊进行有效的遗传转化，方法简单便捷，在保留母株并降低对母株伤害的同时，能获取大量具有一致性的外植体材料，有利于转基因植株保持原有的优良性状，并且具备转基因的功能。并且具备转基因的功能。并且具备转基因的功能。


技术研发人员：吴鸿 杨李文 何韩军 杨跃生
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.08.16
技术公布日：2022/10/18