一种可调控内皮祖细胞分化趋势涂覆层的制备方法

1.本发明属于生物高分子材料领域，涉及一种可调控内皮祖细胞分化趋势涂覆层的制备方法。


背景技术：

2.动脉粥样硬化是影响人类健康的主要疾病之一。目前主要采用金属血管支架植入的方式进行治疗。但是，支架撑开造成的植入部位血管内壁损伤会引发血栓、炎症、内膜增生和血管重塑等一系列病理反应，导致支架内再狭窄。研究发现，在支架表面快速形成一层完整的血管内皮层是解决术后再狭窄的有效方法。早期采用的方法主要是在支架表面引入血管内皮细胞。然而作为终末分化细胞，血管内皮细胞增殖能力较差，难以覆盖支架表面。而且由于内皮细胞增殖迁移能力和生物活性不足，形成的内皮组织与天然内皮层在结构和功能上差异巨大。
3.近年来，临床上开发出具有内皮祖细胞捕获功能的cd34抗体支架。由于内皮祖细胞属于成体干细胞，具有很强的增殖和分化成血管内皮细胞的能力，因此将内皮祖细胞种植于血管支架表面，进而在体内自发诱导原位内皮再生，成为解决支架再狭窄和晚期血栓最有希望的途径之一。但是临床研究发现，该类型支架并不能完全实现再内皮化或抑制术后并发症，治疗过程依然有血栓生成和内膜增生的风险。其原因主要是因为内皮祖细胞虽然能分化为内皮细胞，但是更容易分化为平滑肌细胞，而且平滑肌细胞具有更强的增殖能力。为此，研究者多在支架表面搭载特定的生物活性分子诱导内皮祖细胞定向分化为内皮细胞，或搭载特定的药物抑制平滑肌细胞增殖。虽然平滑肌细胞过度增殖被认为是引发再狭窄最重要的环节之一，但失去平滑肌细胞提供生物力学稳定性，新生内皮层极易在血流剪切力的作用下脱落，导致支架再暴露并引发血栓。可见，不论是内皮细胞还是平滑肌细胞在支架表面内皮化进程中都起着至关重要的作用，单一种类的内皮细胞或平滑肌细胞都不利于实现血管内皮层再生。如果能调控两种血管细胞的生长与增殖，就可在宏观上诱导血管内皮层再生。
4.近年来研究发现，肝素不仅具有优异的抗凝血性能，还能结合多种生长因子以促进内皮细胞增殖，并对平滑肌细胞增殖有明显的特异性抑制作用。深入研究后，研究者发现肝素的抗凝血性能与其特殊的分子构象和带有的功能基团有关。此外，肝素是通过离子键结合血管内皮生长因子以促进内皮细胞增殖，而肝素对平滑肌细胞的抑制作用也仅取决于其较高的磺化度。如能在血管支架表面引入高密度的磺酸基，即可设计出一种较为完美的内皮细胞友好型抗平滑肌细胞增生的表面修饰层。
5.表面接枝技术是生物医用金属材料常用的表面改性技术。早期的方法主要采用等离子体处理在材料表面引入功能基团。这种方法引入的基团密度较低，效果有限。如结合表面涂覆技术，则可在表面构建一层涂覆层，极大提升表面功能基团的密度，再结合生物粘接剂将该涂覆层紧密黏附于材料表面，即可极大提升涂覆层的稳定性。本发明设计一种羧基化水溶性高分子表面涂覆层，用水环境下黏附力达多巴胺7倍的5-羟基多巴胺作为粘接剂
将该涂覆层紧密结合在支架材料表面。然后通过碳二亚胺反应在材料表面接枝带有不同功能基团种类、数量和比例的水溶性高分子，从而调控血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的生长与增殖，构建新生的血管内皮层。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种可调控内皮祖细胞分化趋势涂覆层的制备方法，结合表面接枝和5-羟基多巴胺粘接技术在涂覆层表面引入不同比例磺酸基、氨基和羧基等生物活性基团促进血管内皮细胞增殖，通过改变磺酸基团数量及比例来调控表面对血管平滑肌细胞的抑制作用，从而在宏观上调控内皮祖细胞的分化趋势。5-羟基多巴胺的使用使得此涂覆层可以在几乎所有生物材料表面稳定存在。
7.本发明的技术方案如下：一种可调控内皮祖细胞分化趋势涂覆层的制备方法，包括以下步骤：s1.羧基化水溶性高分子链cwc的制备：以双3-氨基-4-氟苯基砜和双3-氨基-4-羟苯基砜为反应物，无水碳酸钾为催化剂，溶于有机溶剂中，在氮气流通条件下缩聚，产物用顺丁烯二酸酐处理，获得cwc；s2.5-羟基多巴胺接枝cwc：将5-羟基多巴胺和cwc加入到 2-吗啉乙磺酸缓冲液中，以碳二亚胺和n-酚羟基琥珀酰亚胺为催化剂，在氮气保护和 25
°
c 条件下将5-羟基多巴胺接枝于cwc侧链；s3.带有磺酸基、氨基水溶性高分子链snc的制备：双4-氟苯基砜、双3-氨基-4-羟苯基砜、双4-羟苯基砜和双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐为反应物，无水碳酸钾为催化剂，溶于有机溶剂中，在氮气流通条件下缩聚，获得snc；s4. 涂覆5-羟基多巴胺接枝的cwc表面接枝snc：配制5-羟基多巴胺接枝的cwc磷酸缓冲盐溶液，并用此溶液处理基材表面；然后以碳二亚胺和n-酚羟基琥珀酰亚胺为催化剂，在氮气保护和4-30℃条件下将 snc接枝于涂覆了5-羟基多巴胺接枝的cwc表面。
8.进一步改进方案是，所述步骤s1中，双3-氨基-4-氟苯基砜、双3-氨基-4-羟苯基砜和无水碳酸钾投入的摩尔比为1:1:1。
9.进一步改进方案是，步骤s1和s3中，所述缩聚采用反应温度先在140～160℃油浴中反应4～6 h，然后将温度提升至180～190℃继续反应12 h以上。
10.进一步改进方案是，步骤s1中，所述产物用顺丁烯二酸酐处理，是将物料降温至80～120℃后，加入物料摩尔比至少2倍的顺丁烯二酸酐反应至少1 h。
11.进一步改进方案是，步骤s2中，所述将5-羟基多巴胺接枝于cwc侧链，投入的5-羟基多巴胺、cwc、碳二亚胺、n-酚羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1～3:1～2:6～10:3～5。
12.进一步改进方案是，步骤s2中，得到5-羟基多巴胺接枝于cwc侧链后，采用饱和氯化钠溶液和乙醇消除cwc和多巴胺之间的静电作用。
13.进一步改进方案是，步骤s3中，所述的双4-氟苯基砜、双3-氨基-4-羟苯基砜、双4-羟苯基砜和双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐，氟苯基单体和羟苯基单体摩尔比为1:1，其中带有氨基和磺酸基的单体摩尔比例之和大于50%。
14.进一步改进方案是，步骤s1、步骤s3中，所述的有机溶剂为n，n
’‑
二甲基甲酰胺、n，n
’‑
二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮中的一种。
15.进一步改进方案是，步骤s4中，所述5-羟基多巴胺接枝的cwc磷酸缓冲盐溶液的浓度为10 mg/ml，ph控制在8～9之间；将基材浸没于5-羟基多巴胺接枝的cwc磷酸缓冲盐溶液，30
°
c下至少处理24 h；步骤s4中，所述的将snc接枝于涂覆了5-羟基多巴胺接枝的cwc表面，反应温度在25℃。
16.进一步改进方案是，步骤s4中，碳二亚胺、n-酚羟基琥珀酰亚胺、snc的摩尔比为3～5:6～10:1～2。
17.有益效果本发明涉及一种可调控内皮祖细胞分化趋势涂覆层的制备方法，结合表面接枝和5-羟基多巴胺粘接技术在涂覆层表面引入不同比例磺酸基、氨基和羧基等生物活性基团。通过调节功能基团比例和数量调控表面对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞生长与增殖的影响，从而在宏观上调控内皮祖细胞的分化趋势，促进构建新生的血管内皮层。5-羟基多巴胺的使用使得此涂覆层可以在几乎所有生物材料表面稳定存在。
附图说明
18.图1为对比例及实施例1-3培养细胞 10 天后，通过半定量逆转录 pcr 测定血管内皮细胞（ec）和血管平滑肌细胞（smc）选定标记基因的表达水平（层粘连蛋白ln，α-平滑肌肌动蛋白α-sma）。
19.实施例1～3中接枝的snc磺酸基比例分别是30%、40%和50%。随着磺酸基比例的升高，在实施例表面的内皮细胞对层年连蛋白的表达水平逐渐升高，而在实施例表面的平滑肌细胞对α-平滑肌肌动蛋白的表达水平逐渐降低。这说明随着磺酸基比例的增加，实施例对内皮细胞生长产生越来越强的促进作用，而对平滑肌细胞的生成产生越来越强的抑制作用，从而在宏观上调控内皮祖细胞的分化趋势。在内皮细胞/平滑肌细胞共培养体系下，发现内皮细胞和平滑肌细胞数量达到一定范围时，两种基因表达都能保持在一个较好的水平，这说明合适的内皮细胞/平滑肌细胞比例可以更有效诱导血管内皮化进程。
具体实施方式
20.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种可调控内皮祖细胞分化趋势涂覆层的制备方法进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
21.此外，应理解，在阅读了本发明描述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
22.对比例1以生物医学领域常用的金属钛作为对比例。
23.实施例1以双（3-氨基-4-氟苯基）砜和双（3-氨基-4-羟苯基）砜为反应物，无水碳酸钾为催化剂（摩尔比为1:1:1），，溶于n, n-二甲基乙酰胺中，在氮气流通条件下150
°
c反应5 h，然后升温至180
°
c反应8 h。反应完成后将物料温度降至100
°
c，加入上述物料两倍摩尔比的顺丁烯二酸酐反应1 h，使用分子量3500的透析袋在去离子水中透析提纯3天，获得cwc。
24.将0.2 g cwc，0.3 mm5-羟基多巴胺溶于30 ml 2-吗啉乙磺酸缓冲液中，彻底溶解
后加入1 mm碳二亚胺和0.5 mm n-酚羟基琥珀酰亚胺。整个溶液在氮气保护和25
°
c条件下搅拌24h，ph值使用1 m hcl保持在5.3。反应结束后，加入3 ml饱和nacl溶液和60 ml冻乙醇。离心后再次将产物溶解在nacl溶液和冻乙醇中（体积比为1:10），重复5次后使用分子量3500的透析袋提纯产物，冻干得到接枝了5-羟基多巴胺的cwc。
25.以双（4-氟苯基）砜、双（3-氨基-4-羟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜和双（3-磺酸基-4-氟苯基）砜钠盐为反应物，无水碳酸钾为催化剂（摩尔比2:2:3:3:5），溶于n, n-二甲基乙酰胺中，在氮气流通条件下150
°
c反应5 h，然后升温至180
°
c反应8 h。产物用分子量3500的透析袋提纯，冻干后得到snc。
26.配制5羟基多巴胺接枝的cwc溶液（20 mg/ml，ph 7.5），然后将金属钛在室温下浸泡在溶液中48 h。使用去离子水清洗后浸入2-吗啉乙磺酸缓冲液中，然后加入0.2 g snc，1 mm碳二亚胺和0.5 mm n-酚羟基琥珀酰亚胺。溶液在氮气保护和室温条件下搅拌24h，ph值使用1 m hcl保持在5.3。清洗后冻干得到成品。
27.实施例2以双（4-氟苯基）砜、双（3-氨基-4-羟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜和双（3-磺酸基-4-氟苯基）砜钠盐为反应物（摩尔比1:2:3:4），无水碳酸钾为催化剂，溶于n, n-二甲基乙酰胺中，在氮气流通条件下150
°
c反应5 h，然后升温至180
°
c反应8 h。产物用分子量3500的透析袋提纯，冻干后得到snc。
28.其余实施如实施例1。
29.实施例3以双（4-氟苯基）砜、双（3-氨基-4-羟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜和双（3-磺酸基-4-氟苯基）砜钠盐为反应物（摩尔比0:2:3:5），无水碳酸钾为催化剂，溶于n, n-二甲基乙酰胺中，在氮气流通条件下150
°
c反应5 h，然后升温至180
°
c反应8 h。产物用分子量3500的透析袋提纯，冻干后得到snc。
30.其余实施如实施例1。