淋巴细胞-抗原提呈细胞共刺激因子及其应用的制作方法

淋巴细胞-抗原提呈细胞共刺激因子及其应用
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年8月17日提交的pct专利申请号为pct/cn2020/109484的优先权，该专利申请通过引用完全并入本发明。
1.技术领域
2.本发明涉及分子生物学、细胞生物学和免疫肿瘤学。
2.

背景技术：

3.t细胞可以工程化表达识别肿瘤抗原的t细胞受体(tcrs)(morgan ra等,science(2006)314(5796):126-129；robbins pf等,j clin oncol(2011)29(7):917-924；rapoport ap等,nature medicine(2015)21(8):914-921)或嵌合抗原受体(car)(kochenderfer jn等,blood(2010)116(20):4099-4102；kalos m等,science translational medicine(2011)3(95):95ra73)以杀死肿瘤用于治疗癌症和其他疾病。尽管针对b细胞标记物(如cd19)的cars构建的的t细胞在血液系统恶性肿瘤中表现出显著的临床疗效，但实体瘤的有效免疫治疗仍是一个挑战，主要是由于复杂的动态肿瘤微环境(tme)引起的免疫逃逸，导致t细胞功能减退和衰竭，限制了抗肿瘤免疫反应(anderson kg et al,cancer cell(2017)31(3):311-325)。因此，在不引起全身毒性的情况下规避抑制途径的策略代表了未满足的需求。本发明解决了这一需要，并提供了相关的优势。
3.

技术实现要素：

4.本发明提供的融合蛋白称为淋巴细胞-抗原提呈细胞共刺激因子(“laco-stims”)。本发明提供的融合蛋白包括激活抗原提呈细胞(apc)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中，(i)所述第一结构域包括(a)结合所述apc的激活受体的配体，或其受体结合片段，或(b)结合所述apc的激活受体的抗体，或其抗原结合片段；(ii)所述第二结构域包括(a)所述免疫效应细胞的共刺激受体，或其功能片段，(b)所述免疫效应细胞的共刺激配体，或其受体结合片段，或(c)结合免疫效应细胞共刺激受体的抗体，或其抗原结合片段。
5.在一些实施方案中，所述apc选自由树突状细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞、单核细胞、b细胞、t细胞和朗格汉斯细胞组成的群组。在一些实施方案中，所述apc的激活受体选自由cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign组成的群组。
6.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign的配体，或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd40配体(cd40l)的受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd40l。
7.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合apc激活受体的抗体，或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域为抗
cd40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域为单克隆抗体。在一些实施方案中，第一结构域是嵌合的、人源化的或人源抗体。在一些实施方案中，所述第一结构域为fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、(scfv)2、单链抗体、双可变区抗体、双特异性抗体、纳米抗体或单可变区抗体。
8.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区，其中a)所述重链可变区具有如seq id no:76所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有如seq id no:77所示的氨基酸序列；b)所述重链可变区具有如seq id no:79所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有如seq id no:80所示的氨基酸序列；c)所述重链可变区具有如seq id no:82所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有seq id no:83所示的氨基酸序列；d)所述重链可变区具有seq id no:85所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有seq id no:86所示的氨基酸序列；e)所述重链可变区具有seq id no:88所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有seq id no:89所示的氨基酸序列；或f)所述重链可变区具有seq id no:91所示的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区具有seq id no:92所示的氨基酸序列。
9.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域为抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述scfv具有选自由seq id nos:75、78、81、84、87和90组成的群组中的氨基酸序列。
10.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括激活抗原提呈细胞(apc)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述免疫效应细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括共刺激受体的胞质结构域。在一些实施方案中，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，所述共刺激受体为cd28。在一些实施方案中，所述共刺激受体为4-1bb。在一些实施方案中，所述第二结构域进一步包括共刺激受体的跨膜结构域。
11.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域为免疫效应细胞的共刺激配体，或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述共刺激配体选自由cd58、cd70、cd83、cd80、cd86、cd137l、cd252、cd275、cd54、cd49a、cd112、cd150、cd155、cd265、cd270、tl1a、cd127、il-4r、gitr-l、tim-4、cd153、cd48、cd160、cd200r和cd44组成的群组。
12.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域为结合共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，所述共刺激受体为cd28。在一些实施方案中，所述共刺激受体为4-1bb。在一些实施方案中，所述第二结构域为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域为嵌合、人源化或人源抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域为fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、(scfv)2、单链抗体、双可变区抗体、双特异性抗体、纳米抗体或单可变区抗体。
13.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域为结合cd28的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗cd28抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区具有seq id no:73所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区，所述轻链可变区具有seq id no:74所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结
构域为结合cd28的scfv。在一些实施方案中，所述scfv具有seq id no:72所示的氨基酸序列。
14.在本发明提供的融合蛋白的一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。在一些实施方案中，第二结构域的n-末端连接到第一结构域的c-末端。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域和第二结构域通过连接子连接。在一些实施例中，所述连接子为三聚基序。在一些实施方案中，所述连接子为t4纤维蛋白三聚基序。
15.在本发明提供的融合蛋白的一些实施方案中，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括cd28胞质结构域。在一些实施方案中，所述第一结构域包括cd40l。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端链接到第二结构域的c-末端。
16.在本发明提供的融合蛋白的一些实施方案中，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。在一些实施方案中，两个结构域通过t4纤维蛋白三聚基序连接。
17.在本发明提供的融合蛋白的一些实施方案中，第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。
18.在本发明提供的融合蛋白的一些实施方案中，第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，第二结构域包括cd28跨膜区和cd28胞质结构域。在一些实施方案中，第一和第二结构域经由cd8铰链、cd28铰链或igg fc区连接。在一些实施方案中，第二结构域的n端连接到第一结构域的c端。
19.在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:93所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:94所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:95所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:96所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:97所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:98所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:99所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:100所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:101所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:102所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:103所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:104所示序列
具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:105所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:106所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:199所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:201所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:211所示序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有选自由seq id no:93-106、199、201和211所组成群组的氨基酸序列。
20.在一些实施方案中，提供了编码本发明所提供融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，还提供了包含本发明所提供的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，所述载体为病毒载体。在一些实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
21.一种重组表达本发明所提供融合蛋白的基因工程免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。
22.在一些实施方案中，提供的基因工程免疫效应细胞包括本发明所公开的多核苷酸或本发明公开的载体，其中所述免疫效应细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为t细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为nk细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为巨噬细胞。
23.在一些实施方案中，提供的基因工程免疫效应细胞进一步重组表达嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)或双特异性t细胞接合子(bite)，其中所述car、tcr或bite结合肿瘤抗原或病毒抗原。在一些实施方案中，本发明提供的细胞还包括编码car、tcr或bite的多核苷酸，其中所述car、tcr或bite结合肿瘤抗原或病毒抗原。在一些实施方案中，所述car、tcr或bite结合病毒抗原，所述病毒抗原选自由hpv、ebv和hiv组成的群组。在一些实施方案中，所述car、tcr或bite结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。在一些实施方案中，所述car具有选自由seq id no:107-121和203构成的群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述tcr具有选自由seq id no:122-129所构成群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述bite具有seq id no:130、131或224所示的氨基酸序列。
24.在一些实施方案中，本发明提供的基因工程免疫效应细胞来源于从外周血或骨髓分离的细胞。在一些实施方案中，提供的细胞来源于由干细胞或祖细胞体外分化而来的细胞，所述干细胞或祖细胞选自由t细胞祖细胞、造血干/祖细胞、造血多能祖细胞、胚胎干细胞和诱导多能细胞组成的群组。
25.在一些实施方案中，本发明提供的基因工程免疫效应细胞为t细胞。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造为细胞毒性t细胞、辅助性t细胞或γδt细胞、cd4 /cd8 双阳性t细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞、cd4/cd8双阴性t细胞、cd3 t细
胞、初始t细胞、效应t细胞、细胞毒性t细胞、辅助性t细胞、记忆t细胞、调节t细胞、th0细胞、th1细胞、th2细胞、th3(treg)细胞、th9细胞、th17细胞、thαβ辅助细胞、tfh细胞、干细胞记忆tscm细胞、中枢记忆tcm细胞、效应记忆tem细胞、效应记忆temra细胞或γδt细胞。
26.在一些实施方案中，本发明提供的基因工程免疫效应细胞群，其来源于从外周血单个核细胞(pbmc)、外周血淋巴细胞(pbl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、细胞因子诱导杀伤细胞(cik)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)或骨髓浸润淋巴细胞(mils)中分离的细胞。
27.在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明公开的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
28.在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，包括本发明公开的基因工程免疫效应细胞或细胞群和药学上可接受的赋形剂。
29.在一些实施方案中，提供了本发明所公开的融合蛋白在癌症治疗中的用途。在一些实施方案中，提供了本发明所公开的融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物的用途。在一些实施方案中，本发明所公开的融合蛋白与免疫效应细胞联合使用。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞选自由car t细胞、tcrt细胞、til、cik、lak和mil组成的群组。
30.在一些实施方案中，提供了本发明所公开的细胞或细胞群在癌症治疗中的用途。在一些实施方案中，提供了本发明所公开的细胞或细胞群在制备用于治疗癌症的药物的用途。在一些实施方案中，提供了本发明所公开的药物组合物在癌症治疗中的用途。在一些实施方案中，提供了本发明所公开的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物的用途。
31.在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白、细胞、细胞群或药物组合物与附加治疗结合使用。
32.在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明所公开的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供的方法进一步包括对受试者施用细胞疗法。在一些实施方案中，所述细胞疗法选自由car t疗法、tcrt疗法、til疗法、cik疗法、lak疗法和mil疗法组成的群组。
33.在一些实施方案中，本发明提供在需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明所公开的细胞或细胞群。在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明所公开的药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供的方法进一步包括对受试者施用附加治疗。
34.在一些实施方案中，所述受试者为人。
35.在本发明提供的用途或方法的一些实施方案中，所述融合蛋白、细胞、细胞群或药物组合物减少癌症诱发的免疫抑制。
36.在一些实施方案中，本发明提供了在癌症治疗中的用途或治疗癌症的方法，其中所述癌症为血液系统癌症。在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤。
37.在一些实施方案中，本发明提供了对免疫效应细胞进行基因工程改造的方法，其包括将本发明所公开的多核苷酸转移到细胞中。在一些实施方案中，所述多核苷酸通过电穿孔转移。在一些实施方案中，所述多核苷酸通过病毒转导转移。在一些实施方案中，使用慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒通过病毒转导转移所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸通过转座子系统转移。在一些实施方案中，所述转座子系统为睡美人(sleeping beauty)或piggybac。在一些实施方案中，所述多核苷酸使用基因编辑进行转
移。在一些实施方案中，通过crispr-cas系统、zfn系统或talen系统使用基因编辑转移所述多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了对免疫效应细胞进行基因工程改造的方法，其包括将本发明所公开的多核苷酸转移到细胞中，其中所述免疫效应细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。
4.附图说明
38.图1是示出4种不同形式的laco-stim融合蛋白构建体的示意图。
39.图2示出了转移的t细胞的car和cd40-fc流式染色。流式细胞技术检测了使用用于her2 car和用于指定的融合蛋白的其它构建体的rna电穿孔(ep)的t细胞的car表达和cd40蛋白结合。
40.图3示出了与共表达car和如表1所示的laco-stim的t细胞共培养后的肿瘤生长。e：t比值为30：1。e：效应细胞(t细胞)；t：靶细胞(a549-eso细胞)。
41.图4示出了与如表1所示的共表达tcr和laco-stim的t细胞共培养后的肿瘤生长。e：t比值为30：1。
42.图5示出了转移的t细胞的car表达以及a549肿瘤细胞系上cd40或pd-l1的表达。上图：流式细胞技术检测了使用用于her2 car和用于指定的不同融合蛋白的其它构建体的rna电穿孔(ep)的t细胞的car表达。下图：流式细胞技术检测了使用用于cd40和/或pd-l1的rna电穿孔(ep)的a549的cd40或pd-l1表达。
43.图6示出了t细胞的ifn-γ产生情况。使用用于her2 car和用于指定的不同融合蛋白的其他构建体的rna电穿孔t细胞，并使用转移有指定的cd40或pd-l1或两者一起的a549肿瘤细胞系刺激t细胞24h。用elisa检测ifn-γ分泌。
44.图7示出了t细胞的il-2产生情况。使用用于her2 car和用于指定的不同融合蛋白的其他构建体的rna电穿孔t细胞，并使用转移有指定的cd40或pd-l1或两者一起的a549肿瘤细胞系刺激t细胞24h。用elisa检测il-2分泌。
45.图8示出了来自tcga数据集的不同癌症中cd40的rna表达。
46.图9示出了不同肿瘤靶标(如顶部所示，均表达gfp)与不同t细胞(如底部和表2所示)在不同时间点(如左侧所示)以不同e:t比值(如右侧所示)共培养的实时图像。
47.图10示出了不同肿瘤靶标与不同t细胞(如底部和表2所示)以不同e:t比值(如右侧所示)共培养的实时生长曲线。
48.图11a-11b图11a示出了在表2所列的不同t细胞存在下，在e:t比例为32:1时，转移有pd-l1的a549(表达gfp)的实时生长曲线。图11b示出了在表2所列的不同t细胞存在下，在e:t比例为0.25:1时，转移有pd-l1的a549(表达gfp)的实时生长曲线。
49.图12a-12b图12a示出了在表2所列的不同t细胞存在下，在e:t比例为32:1时，转移有cd40的a549(表达gfp)的实时生长曲线。图12b示出了在表2所列的不同t细胞存在下，在e:t比例为0.25:1时，转移有cd40的a549(表达gfp)的实时生长曲线。
50.图13a-13b图13a示出了在表2所列的不同t细胞存在下，在e:t比例为32:1时，a549(表达gfp)的实时生长曲线。图13b示出了在表2所列的不同t细胞存在下，在e:t比例为
0.25:1时，a549(表达gfp)的实时生长曲线。
51.图14示出了转移有pd-l1的a549(表达gfp)在不同t细胞存在下(如底部和表3所示)、不同e:t比值(如左侧所示)时的实时图像生长曲线。
52.图15示出了在表3所列的t细胞存在下，在e:t比例为30:1(上图)或3.3：(下图)时，a549-pd-l1(表达gfp)的实时生长曲线。
53.图16示出了在表3所列的t细胞存在下，在e:t比例为30:1(上图)或3.3：(下图)时，a549-cd40(表达gfp)的实时生长曲线。
54.图17示出了在表3所列的t细胞存在下，在e:t比例为30:1(上图)或3.3：(下图)时，a549(表达gfp)的实时生长曲线。
55.图18示出了单独用her2 car转移的t细胞，或与laco-stim和/或pd1联合转移的t细胞，在加入到包被有her2-fc、pd-l1-fc和/或cd40-fc蛋白的平板并培养24h后的il-2分泌情况。
56.图19示出了单独用her2 car转移或与laco-stim联合转移的cfse标记t细胞的cfse稀释情况。cd4

/cd25

treg细胞加入到所示的t细胞中，其效应细胞：treg比值为4：1。将t细胞加入到包被有her2-fc、pd-l1-fc和/或cd40-fc蛋白的平板中，培养3d。使用流式细胞技术检测cfse稀释情况。
57.图20示出了用her2 car和laco-stim共转移的t细胞的il-2分泌情况。tgf-β按指示添加到t细胞中。将t细胞加入到包被有her2-fc、pd-l1-fc和/或cd40-fc蛋白的平板中，培养24h。用elisa检测il-2的产生情况。
58.图21a-21b图21a示出了在所示的t细胞存在下，e：t比例为10：1时a549-cd40(表达gfp)的实时生长曲线。图21b示出了在所示的t细胞存在下，e：t比例为10：1时a549-pd-l1(表达gfp)的实时生长曲线。
59.图22a-22d图22a示出了在所示的t细胞存在下，e：t比例为1：1时，pc3-pd-l1(表达gfp)的实时生长曲线。图22b示出了在所示的t细胞存在下，e：t比例为1：1时，pc3-cd40(表达gfp)的实时生长曲线。图22c示出了在所示的t细胞存在下，e：t比例为1：1时，pc3-pd-l1-cd40(表达gfp)的实时生长曲线。图22d示出了在所示的t细胞存在下，e：t比例为1：1时，pc3(表达gfp)的实时生长曲线。具有阴性对照组(单独t细胞和f5.77.cd28(无car)))的完整数据集显示在左上象限。
60.图23示出了不同t细胞在所示的不同刺激下经刺激后70h、80h和100h的增殖情况。
61.图24示出了不同t细胞在所示的不同刺激下经刺激后2天的增殖情况。
62.图25示出了了cd19、car和laco-stim(f5.157.cd28)的慢病毒载体图谱。
63.图26示出了由携带所示的不同基因的慢病毒载体转导的t细胞抑制肿瘤生长情况。
64.图27示出了laco-stims通过与树突状细胞上的cd40结合促进了树突状细胞的表位扩散。
65.图28示出了laco-stims(如cd28-cd40双特异性抗体)在协调t细胞和apc抗肿瘤活性中的机制。
66.图29示出了慢病毒载体转导t细胞的laco-stim a40c.cd28(a40c)cd19car(fmc63.bbz(fmc63))、msln car(ss1.bbz(ss1))表达。
67.图30示出了使用小鼠抗人cd11b、cd80(a)、cd83(b)、cd86(c)、hla-dr(d)对与lps(10ng/ml)或utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19共培养的modcs的染色的结果。
68.图31示出了采用elisa测定细胞因子的分泌情况，包括与laco-stim t或laco-stim-car-cd19共培养的自体modc的il12p70、il2、ifnγ、tnf-α、il1β。
69.图32示出了与lps(10ng/ml)、il-4(20ng/ml)、il-10(20ng/ml)、utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19 t共培养的m0巨噬细胞的染色结果，证明了laco-stim t和laco-stim-car-cd19诱导m0巨噬细胞的表型变化。
70.图33示出了采用elisa或legendplex多重检测(biolegend)测量与laco-stim-car-cd19共培养的自体巨噬细胞的细胞因子分泌结果，包括il1β、ifn-l1、ifn-l23、ifnβ和il-10。
71.图34示出了采用流式细胞技术测量与utd、laco-stim t、car-cd19 t、laco-stim-car-cd19 t或laco-stim-car-meso共培养的巨噬细胞的吞噬功能的结果。
72.图35示出了与utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19 t共培养的自体modc对非cd19特异性肿瘤的杀伤作用。
73.图36示出了与utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19 t共培养的自体巨噬细胞对非cd19特异性肿瘤的杀伤作用。
74.图37示出了采用小鼠抗人cd11b、cd80、cd83、cd86和hla-dr染色测定与肿瘤细胞系共培养24h，并补充lps(10ng/ml)、utd、laco-stim t、car-cd19 t、laco-stim-car-cd19 t、car-meso或laco-stim-car-meso t的modc的成熟情况。
75.图38a-38c示出了采用elisa测定与肿瘤细胞系和laco-stim t、laco-stim-car-cd19和laco-stim-car-meso共培养的modcs分泌细胞因子的结果，包括il12(图38a)、il2(图38a)、ifn-γ(图38b)、tnf-α(图38b)和il1β(图38c)。
76.图39a-39b示出了与肿瘤细胞系共培养，并补充lps(10ng/ml)、il-4(20ng/ml)、il-10(20ng/ml)、utd、laco-stim t、car-cd19 t、laco-stim-car-cd19、car-meso或laco-stim-car-meso的巨噬细胞的染色结果，所述染色是用抗cd80(图39a)、抗cd86(图39a)、抗hla-dr(图39b)、抗cd206(图39b)和抗cd163(图39b)进行染色。
77.图40a-40c示出了采用elisa或legendplex多重检测(biolegend)测定与肿瘤细胞系共培养，并补充lps(10ng/ml),utd,laco-stim t,car-cd19 t,或laco-stim-car-cd19 t的自体mac的细胞因子分泌的结果，包括il12p70(图40a)、il2(图40a)、ifnγ(图40a)、tnf-α(图40a)、gm-csf(图40b)、il8(图40b)、il1β(图40b)、ifn-l1(图40b)、ifn-l23(图40c)、ifnβ(图40c)和il-10(图40c)。
78.图41提供了流式细胞技术数据，显示了用各种car或laco-stim-car共电穿孔的t细胞的cd40l表达。
79.图42提供了流式细胞技术数据，显示了用各种cars或laco-stim-cars共电穿孔的t细胞的cd40-fc的检测。
80.图43提供了流式细胞技术数据，显示了用各种cars或laco-stim-cars共电穿孔的t细胞的car表达。
81.图44提供了elisa数据，显示了用各种cars或laco-stim-cars共电穿孔并且在有
cd40表达或无cd40表达的肿瘤细胞刺激下的t细胞的ifn-γ分泌情况。
82.图45提供了elisa数据，显示了用各种cars或laco-stim-cars共电穿孔并且在有cd40表达或无cd40表达的肿瘤细胞刺激下的t细胞对的il-2分泌情况。
83.图46示出了用各种cars或laco-stim-cars电穿孔的t细胞对有cd40表达或无cd40表达的肿瘤细胞的杀伤作用。
84.图47示出了cd27-car和a40c28-cd27-car的结构示意图。
85.图48a-48b提供了流式细胞技术数据，显示了用cd40mrna(图48a)电穿孔的靶细胞中cd40的表达，以及指定的car-t细胞中a40c28和cd27-car的表达(图48b)。
86.图49提供了cd27-car t细胞和a40c28-cd27-car t细胞在指定e：t比值下的肿瘤杀伤曲线。上图：786-o-cbg细胞；下图：用10μg cd40 mrna电穿孔的786-o-cbg细胞(786-o-cd40)。
87.图50提供了elisa数据，显示了与786-o-cbg细胞以e:t＝1:1孵育24h的指定的car t细胞的il-2和ifn-γ释放情况。
88.图51a-51b提供了elisa数据，显示了与不同种类的肿瘤细胞以e:t＝1:1孵育24小时的指定的car t细胞的il-2(图51a)和ifn-γ(图51b)释放情况。
89.图52提供了小鼠模型数据，显示了cd27-car t细胞和a40c28-cd27-car t细胞抗肿瘤活性。
90.图53提供了流式细胞技术数据，显示了用指定的单独的cd19car(fmc63.bbz)mrna电穿孔的t细胞或者用cd19 car(fmc63.bbz)mrna与laco分子119-28或a40c-28或pd1-28联合电穿孔的t细胞的car表达。
91.图54示出了单独表达cd19 car fmc63.bbz或同时表达cd19 car fmc63.bbz与laco分子119-28、a40c-28、pd1-28，并与肿瘤细胞nalm6、k-19、raji或k562一起培养后的t细胞的cd107a表达情况。
92.图55a-55b提供了elisa数据，显示了单独用cd19(fmc63.bbz)mrna电穿孔，或用cd19(fmc63.bbz)mrna与laco分子119-28或a40c-28或pd1-28联合电穿孔，并由肿瘤细胞nalm6、k-19、raji或k562刺激后的t细胞的细胞因子释放情况。图55a示出了ifn-γ分泌情况。图55b示出了il-2分泌情况。
93.图56提供了基于阻抗的实时细胞毒性试验的结果，评估了指定的单独表达car或同时表达car与119-28或a40c-28或pd1-28a的cd19 car(fmc63.bbz)t细胞针对表达cd19的a549肿瘤细胞的杀伤活性。
94.图57提供了小鼠模型数据，显示了在移植有raji-cbg的nsg小鼠中，由单独表达car或同时表达car与laco-stim a40c-28的cd19 car(fmc63.bbz)t细胞治疗引起的晚期肿瘤的诱导消退。
95.图58提供了流式细胞技术数据，显示了使用慢病毒载体转导到t细胞的car和laco-stim表达。
96.图59a-59b提供了facs结果，显示了t细胞中car和laco的表达水平(图59a)和car的mfi(图59b)。
97.图60a-60b提供的结果显示了培养期间指定的cart细胞数量(图60a)和大小(图60b)。
98.图61a-61b提供了elisa结果，显示了与一组肿瘤细胞共培养后的t细胞的细胞因子产生情况。图61a示出了il-2的产生情况。图61b示出了inf-γ的产生情况。
99.图62a-62b提供了比较bcma31、laco-bcma31、bcma31-laco和b38m cart细胞对jeko-1肿瘤细胞杀伤作用的体内动物实验结果。图62a示出了jeko-1肿瘤的生物发光成像。图62b示出了生物发光的平均辐照度。
100.图63提供了facs结果，显示了在mrna电穿孔后的t细胞的car和laco表达水平。
101.图64提供了指定的cart细胞与不同肿瘤细胞共培养后的cd107a表达。
102.图65a-65d提供了指定的cart细胞针对不同肿瘤细胞的细胞毒性t细胞活性的incucyte活细胞分析结果。fig.65a:nalm6细胞；fig.65b:jeko-1细胞；fig.65c:rpmi-8226细胞；fig.65d:raji细胞。
103.图66提供不同的基于mrna的抗间皮素car-t细胞(包括mock t细胞(noep)、含有a40 c28的t细胞、抗间皮素m12 /-a40 c28 car-t细胞和m32 /-a40 c28 car-t细胞)在e/t比值＝3:1时，对用0、0.5μg或10μg间皮素mrna电穿孔的a549-gfp肿瘤细胞的杀伤曲线。
104.图67提供了基于慢病毒的抗间皮素car-t细胞(包括mock t细胞(utd)和抗间皮素m12 /-a40c28 car-t细胞)在以e/t比值＝2:1时，对用0或10μg间皮素mrna电穿孔的h226、ovcar3和molm14细胞的杀伤曲线。
105.图68提供了不同的基于mrna的抗间皮素car-t细胞(包括mock t细胞(noep)、抗间皮素m12 /-1412-4d11 car-t细胞和m32 /-1412-4d11 car-t细胞)在e/t比值＝10:1时，对用0或2μg间皮素mrna电穿孔的a549-gfp肿瘤细胞的杀伤曲线。
106.图69提供了不同的基于mrna的抗cd123 cart细胞(含或不含laco(a40c.cd28))在e/t比值＝10:1时，对molm-14、nalm6和jeko-1肿瘤细胞的杀伤曲线。
107.图70提供了不同的基于mrna的抗cd123 cart细胞(含或不含laco(a40c.cd28))在e/t比值＝30:1时，对用10μg，0.1μg或0μgcd123mrna电穿孔的a549肿瘤细胞的杀伤曲线。
108.图71提供elisa结果，显示用不同cd123 car(含或不含laco)电穿孔的t细胞的ifn-γ分泌情况。
109.图72提供了流式细胞技术数据，检测了表达laco(a40c-28或4d11-1412),bite(acd19/cd3:“blina”或aher2/cd3:“4d5-6-cd3”)和/或car(anti-her2,4d5.bbz)的t细胞中的gfp和laco-stim(cd40 fc)。
110.图73提供了流式细胞技术数据，检测了t细胞中的gfp和cd19 car(cd19-fc)。
111.图74提供了流式细胞技术数据，检测了由cd19阳性肿瘤细胞系nalm6刺激的t细胞的gfp和cd107a。
112.图75提供了elisa数据，显示了由cd19阳性肿瘤细胞系nalm6刺激的t细胞的il-2分泌情况。
113.图76提供了流式细胞技术数据，检测了t细胞的gfp和her2 bite(4d5-6-cd3)或car(4d5.bbz)(her2-fc)。
114.图77提供了流式细胞技术数据，检测了用her2阳性肿瘤细胞系sk-ov3刺激的t细胞的gfp和cd107a。
115.图78提供了elisa数据，显示了由her2阳性肿瘤细胞系sk-ov3刺激的t细胞的il-2分泌情况。
5.具体实施方式
116.在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本发明所列举的特定实施方案，并且还应当理解，本发明使用的术语是为了描述特定实施例，而不是意图限制。
117.本发明涉及包含两个功能结构域的融合蛋白，其中第一结构域可激活抗原提呈细胞，第二结构域可激活免疫效应细胞。本发明的融合蛋白也称淋巴细胞-抗原提呈细胞共刺激因子(“laco-stims”)。本发明所公开的融合蛋白的表达不仅可以促进免疫效应细胞(例如，t细胞)的增殖和激活，还能刺激抗原提呈细胞的成熟和表位扩散活性。在一些实施方案中，本发明所公开的基因工程t细胞中融合蛋白的表达有助于其克服由诸如pd1/pd-l1信号转导、调节性t细胞(tregs)和tgf-β信号介导的肿瘤微环境中的免疫抑制，并增强其抗肿瘤活性。5.1定义
118.除非本发明另有定义，本发明中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非语境另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，本发明所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语使用和技术均为本领域中公知且常用的术语。
119.术语“多肽”、“肽”、“蛋白质”及其在本发明可互换使用的语法等同词是指任意长度的氨基酸聚合物，其可以为线性的或支链的。其可包括非天然或修饰的氨基酸，或被非氨基酸打断。多肽、肽或蛋白质也可被修饰，例入通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。
120.本发明所用术语“融合蛋白”是指一种蛋白质、肽或多肽，其氨基酸序列来源于两个或两个以上分离的蛋白质、肽或多肽。所述融合蛋白还包括来自分离蛋白质、肽或多肽的氨基酸部分之间的氨基酸连接区。氨基酸的这种连接区本发明称为“连接子”。
121.本发明所用术语“变体”与具有特定序列特征的蛋白质或多肽(“参考蛋白”或“参考多肽”)相关，其是指与参比蛋白或参比多肽相比，包括一种或多种(例如，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、或约1至约5)氨基酸替换、缺失和/或添加的不同的蛋白或多肽。氨基酸序列的变化可以为氨基酸替换。氨基酸序列的变化可以为保守的氨基酸替换。蛋白质或多肽的功能片段或功能变体保持参比蛋白质或多肽的基本结构和功能特性。
122.术语“多核苷酸”、“核酸”及其在本发明可互换使用的语法等同词是指任何长度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。所述核苷酸可以为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过dna或rna聚合酶结合到聚合物中的任何底物。
123.在两个或多个多核苷酸或多肽的上下文中，本发明中使用的术语“同一性”、百分比“同一性”及其语法等同词是指当比较和对齐(必要时引入间隙)以获得最大对应时，不考虑任何保守的氨基酸替换作为序列同一性的一部分，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或多个序列或子序列。所述序列百分比可使用序列比较软件或算法或通过目测来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件在本领域众所周知。这些算法或软件包括但不限于blast、align、megalign、bestfit、gcg wisconsin package及其变体。在一些实施方案中，本发明提供的两种多核苷酸或多肽实质相同，这意味着当使用序列比较算法或通过目视检查进行比较和对齐以获得最大对应时，它们具有至
少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，在长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基或两者之间的任何整数值的氨基酸序列的区域上存在同一性。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个残基更长的区域，例如至少约80-100个残基，并且在一些实施方案中，这些序列在所比较的序列的全长上基本相同，例如目标蛋白或抗体的编码区域。在一些实施方案中，在长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、至少约40-60个碱基、至少约60-80个碱基或两者之间的任何整数值的核苷酸序列的区域上存在同一性。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个碱基更长的区域上，例如至少约80-1000个碱基或更多，并且在一些实施方案中，这些序列在所比较的序列(例如编码目标蛋白的核苷酸序列)的全长上基本相同。
124.本发明使用的术语“抗体”及其语法等同词是指免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述任何一种的组合，其中所述抗原结合位点通常在免疫球蛋白分子的可变区内。如本发明所用，该术语包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单域抗体(sdab，例如骆驼抗体、羊驼抗体)、单链fv(scfv)抗体、重链抗体(hcabs)、轻链抗体(lcabs)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体，以及任何其他包含抗原结合位点的修饰免疫球蛋白分子(例如，双可变区免疫球蛋白分子)，只要抗体表现出所需的生物活性。所述抗体还包括但不限于小鼠抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体。抗体可以为五种主要免疫球蛋白中的任何一种：iga、igd、ige、igg和igm或其亚类(同种型)(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)，基于它们的重链恒定区(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的同一性。除非另有明确说明，本发明所用术语“抗体”包括完整抗体的“抗原结合片段”。本发明所用的术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分或片段，其为完整抗体的抗原决定可变区。抗原结合片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2，fv、线性抗体、单链抗体分子(例如scfv)、重链抗体(hcabs)、轻链抗体(lcabs)、二硫键连接的scfv(dsscfv)、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体、双可变区抗体(dvd)、单可变区抗体(sdab，例如骆驼抗体、羊驼抗体)和重链抗体的单可变区(vhh)。
125.本发明所用的术语“载体”及其及其语法等同词是指用于携带遗传物质(例如，多核苷酸序列)的载体，所述遗传物质可以被引入宿主细胞，在宿主细胞中可以被复制和/或表达。可应用的载体包括，例如，表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可包括可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标记。此外，所述载体可以包括一个或多个可选择的标记基因和适当的表达控制序列。所述可以包括的可选择的标记基因能够，例如，提供对抗生素或毒素的耐药性、补充营养缺陷症、或提供培养基中不存在的关键营养物质。所述表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或多个多核苷酸要共表达时，两个多核苷酸都可以插入，例如在单个表达载体中或在单独的表达载体中。对于单载体表达，编码的多核苷酸可以操作地连接到一个共同的表达控制序列上，也可以连接到不同的表达控制序列上，如一个诱导启动子和一个组成型启动子。宿主细胞中多核苷酸的引入可以使用本领域公知的方法来确认。本领域技术人员理解，多核苷酸表达足够的量以产生所需的产物(例如，本发明所述的融合蛋白)，并且进一步理解，可以使用本领域公知的方法优化表达水平以获得足够的
表达。
126.术语“基因工程”或其语法等同词，当用于指细胞时，意指细胞遗传物质的改变，而这种改变通常在自然发生的细胞中是不存在的。遗传改变包括，例如，引入可表达多核苷酸的修饰，细胞基因的其他添加、突变/改变、缺失和/或其他功能破坏。这种修饰可以在例如基因的编码区及其功能片段中进行。另外的修饰可以在例如非编码调节区域中进行，其中所述修饰改变基因的表达。
127.本发明使用的术语“转移”、“转导”、“转染”及其语法等同词是指将外源性多核苷酸引入宿主细胞的过程。“转移”、“转染”或“转导”的细胞是指已转移、转导或转染外源性多核苷酸的细胞。所述细胞包括原代受体细胞及其子代。正如本领域所理解的，多核苷酸可以使用任何类型的方法“转移”到宿主细胞中，包括化学方法、物理方法或生物方法。多核苷酸通常使用病毒“转导”到宿主细胞中。相比之下，多核苷酸通常使用非病毒方法“转染”到宿主细胞中。这些术语有时可以互换使用，当在上下文中使用时，本领域普通技术人员容易理解其含义。
128.如本发明所用，术语“编码”及其语法等同词是指多核苷酸或核酸中特定核苷酸序列的固有性质，所述多核苷酸或核酸如基因、cdna或mrna，其作为模板，用于在生物过程中合成具有特定核苷酸序列(即rrna、trna和mrna)或特定氨基酸序列的其他聚合物和大分子，及由此产生的生物特性。因此，如果与该基因相对应的mrna的转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码此蛋白质。除另有说明外，“编码氨基酸序列核苷酸序列”包括相互简并的或编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和rna的核苷酸序列可以包括内含子。
[0129]“分离的”多肽、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是自然界中所没有的多肽、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物的形式。分离的多肽、多肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已经纯化到一定程度，不再以自然界中发现的形式存在的多肽、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，所分离的多肽、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本纯化的。
[0130]
本发明使用的术语“治疗”及其语法等同词与疾病或病症，或患有疾病或病症的受试者相关，其是指抑制、消除、减轻和/或改善症状、症状严重程度和/或与正在治疗的疾病或障碍相关的症状频率的行为。例如，当提及癌症或肿瘤时，术语“治疗”及其语法等同词是指降低癌症或肿瘤的严重程度，或延缓或减缓癌症或肿瘤进展的行为，包括(a)抑制癌症或肿瘤的生长或阻止其发展，(b)导致癌症或肿瘤消退，或(c)延缓、改善或最小化与癌症或肿瘤存在相关的一种或多种症状。
[0131]
本发明使用的术语“给药”及其语法等同词是指通过本发明中描述的方法或本领域中的其他已知方法向受试者身体递送或导致递送治疗剂或药物组合物的行为。所述治疗剂可以为化合物、多肽、细胞或细胞群。给药治疗剂或药物组合物包含将一种治疗或药物组合物开处方递送至受试者体内。给药的典型形式包括口服剂型，如片剂、胶囊、糖浆、混悬剂；可注射剂型，如静脉注射(iv)、肌内注射(im)或腹膜内注射(ip)；透皮剂型，包括乳膏、凝胶、粉末或贴剂；口腔剂型；吸入粉末、喷雾剂、混悬剂，和直肠栓剂。
[0132]
本发明使用的术语“有效量”、“治疗有效量”和它们的语法等同物是指给受试者单独或作为药物组合物的一部分、以单剂量或作为一系列剂量的一部分给药，能够在给药时对疾病、障碍或病症的任何症状、方面或特征产生任何可检测的积极影响的给药量。治疗有
效量可通过测定相关生理效应来确定。所需的确切量因受试者而异，取决于受试者的年龄、体重和一般情况、正在治疗的症状的严重程度、临床医生的判断等。在任何个体情况下，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
[0133]
术语“药学上可接受的辅料”是指适合与活性药物一起对个体给药的材料，不会引起任何不良生物学效应或以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用。
[0134]
本发明使用的术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬、猫科动物、啮齿动物等，其是待接受特定治疗的动物。受试者可以为人。受试者可以为患有特定疾病或病症的患者。
[0135]
范围：在整个发明中，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，描述从1到6的范围应被认为已经公开了子范围，例如从1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，都适用于此。
[0136]
本发明参照genbank编号、gi编号和/或seq id no描述了示例性基因和多肽。应当理解，本领域技术人员可以通过参考序列来源容易地识别同源序列，所述序列来源包括但不限于genbank(ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和embl(embl.org/)。5.2laco-stim融合蛋白
[0137]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包含激活抗原提呈细胞(“apc”，例如树突状细胞)的第一结构域和激活免疫效应细胞(例如，t细胞)的第二结构域，其中所述第一结构域包括(a)结合所述apc的激活受体的配体，或其受体结合片段，或(b)结合所述apc的激活受体的抗体，或其抗原结合片段；其中所述第二结构域包括(a)所述免疫效应细胞的共刺激受体，或其功能片段，(b)所述免疫效应细胞的共刺激配体，或其受体结合片段，或(c)结合免疫效应细胞共刺激受体的抗体，或其抗原结合片段。
[0138]
在一些实施方案中，所述融合蛋白为膜蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白为可溶性蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白为双特异性抗体。在一些实施方案中，第一结构域的c-末端连接到第二结构域的n-末端。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。
[0139]
在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域通过连接子连接。所述连接子可以为柔性连接子或刚性连接子。在一些实施方案中，所述连接子具有(ggggs)n，n＝1、2、3、4或5(seq id no:215)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有(eaaak)n，n＝1、2、3、4或5(seq id no:216)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有(pa)np，n＝1、2、3、4或5(seq id no:217)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有gsggggsggggsggggs(seq id no:219)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有ggggs(seq id no:218)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子为cd8铰链(seq id no:69)。在一些实施例中，所述连接子为cd28铰链(seq id no:70)。在一些实施例中，所述连接子为igg fc铰链(seq id no:71)。在一些实施例中，所述连接子可以为一种三聚基序，其选自由t4纤维蛋白三聚基序(seq id no:1)、异亮氨酸拉链基序(seq id no:2或3)、gcn4ii基序(seq id no:4或5)、matrilin-1基序(seq id no:6或7)和xv型胶原三聚基序
(seq id no:8)组成的群组。5.2.1apc激活剂
[0140]
本发明提供的融合蛋白包括激活抗原提呈细胞(apc)的第一结构域，其中所述第一结构域包括(a)结合所述apc的激活受体的配体，或其受体结合片段，或(b)结合所述apc的激活受体的抗体，或其抗原结合片段。apc是指在其表面显示一种或多种抗原的任何细胞，例如，与一种或多种主要组织相容性复合体(mhc)蛋白结合。所述mhc/抗原复合物可被t细胞利用其t细胞受体(tcrs)识别并引起免疫应答。5.2.1.1抗原提呈细胞(apc)
[0141]
apcs包括，例如，树突状细胞(dcs)、巨噬细胞、单核细胞、髓源性抑制细胞、某些b细胞、t细胞和朗格汉斯细胞。
[0142]
树突状细胞：树突状细胞(dcs)是骨髓来源的细胞，作为专业抗原提呈细胞发挥作用。未成熟dc的特征是具有较高的抗原捕获和加工能力，但t细胞刺激能力低。炎症介质促进dc成熟。一旦dcs达到成熟阶段，其性质就发生了巨大变化。具体来说，它们基本上失去了捕获抗原的能力，并获得了增强的刺激t细胞的能力。通常，成熟的dc将在外周组织水平上捕获的抗原呈递给幼稚t细胞。
[0143]
巨噬细胞：巨噬细胞是专门用于检测、吞噬和破坏包括病原体和肿瘤细胞在内的靶细胞的免疫细胞。因此，巨噬细胞是先天免疫系统的有效效应器，具有至少三种不同的抗肿瘤功能：吞噬死亡细胞和濒死细胞，对肿瘤细胞本身的细胞毒性，以及呈递肿瘤抗原以配合适应性抗肿瘤免疫反应。在成人中，未极化、未定型或静息巨噬细胞(m0)于骨髓来源的单核细胞前体分化，并表达该谱系的共同标志物，包括cd14、cd16、cd64、cd68、cd71和ccr5。暴露于各种刺激可诱导m0巨噬细胞极化为通过表面标记物和细胞因子/趋化因子分泌所确定的几个不同群体。
[0144]
单核细胞：单核细胞是在血液、骨髓和脾脏中循环的多能细胞，在稳定状态下通常不会增殖。通常，它们包括趋化因子受体和病原体识别受体，这些受体例如在感染期间介导从血液到组织的迁移。单核细胞可以产生炎症细胞因子和/或摄取细胞和毒性分子，也可以分化为炎症dc或巨噬细胞。
[0145]
髓源性抑制细胞：髓源性抑制细胞(mdscs)是在癌症、炎症、感染和移植中扩增的异质性细胞群。mdscs具有显著的调节适应性和先天性免疫应答的能力。尽管mdsc具有被广泛接受的免疫抑制能力，但出现了一种新的功能，即免疫刺激和抗肿瘤活性。mdscs由髓系祖细胞和未成熟髓系细胞组成，可在病理状态下持续繁殖，并且是apc的主要来源。(li a等,int jclin exp med 2017；10(8):12217-12222)。
[0146]
b细胞：在某些肿瘤中，b细胞占所有细胞的25％，在某些乳腺癌受试者中，40％的肿瘤浸润淋巴细胞是b细胞(yuen等，trends cancer,2016,2(12):747-757)。此外，治疗性免疫检查点阻断除了靶向活化的t细胞外也可能靶向活化的b细胞，由于pd-1、pd-l1、ctla-4和b7分子在b细胞上表达。b细胞除具有产生抗体和抗体-抗原复合物的免疫调节功能外，还可通过提呈抗原、提供共刺激和分泌细胞因子等方式影响其他免疫细胞的功能。b细胞表面的膜结合免疫球蛋白作为细胞的抗原受体，被称为b细胞受体(bcr)。b细胞表面bcr的激活导致该b细胞的克隆扩增和特异性抗体的产生。此外，b细胞可以内化与bcr结合的抗原，并将其呈递给辅助性(cd4 )t细胞。与t细胞不同，b细胞可以识别其bcr特异性的可溶性抗
原。
[0147]
t细胞：t细胞是免疫效应细胞，在诱导和维持有效的免疫应答，如抗病毒应答或抗肿瘤应答中发挥重要作用。本领域已经认识到t细胞还可以呈现来自病毒抗原和肿瘤抗原的肽表位。参见例如，atanackovic等，journal of immunological methods 278.1-2(2003):57-66。
[0148]
朗格汉斯细胞：郎格汉斯细胞构成了皮肤免疫防御的第一道防线。这些细胞来源于骨髓，通常分布在棘层的角质形成细胞中。朗格汉斯细胞是来源于单核细胞谱系的apcs，在免疫应答的传入肢体中发挥作用。它们摄取外来入侵者，并对其进行处理以呈递给t细胞。一旦它们呈递抗原，就会迁移到淋巴结激活t细胞。这些细胞对迟发型超敏反应的诱导至关重要。5.2.1.2apcs活化受体
[0149]
如本领域所理解，一种分子可以通过促进apc的成熟、促炎状态、细胞毒性、抗原呈递、表位扩散、细胞因子产生、免疫效应细胞(例如t细胞)的共刺激或其中任何组合来激活apc。在一些实施方案中，本发明所提供融合蛋白的第一结构域通过促进apc(例如dc)的成熟和活化来激活apc。在一些实施方案中，本发明所提供融合蛋白的第一结构域通过促进apc和其他免疫效应细胞(例如t细胞)之间的表位扩散来激活apc。在一些实施方案中，本发明所提供融合蛋白的第一结构域通过促进apc的抗原呈递来激活apc。在一些实施方案中，本发明所提供融合蛋白的第一结构域通过促进apc对异物(例如癌细胞)的细胞毒性来激活apc。
[0150]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域，其包括结合apc的激活受体的配体或其受体结合片段。“激活受体”是指apc上表达的一种膜蛋白，它与配体或抗体结合后，能引发信号以促进apc的流动、分化、增殖和/或激活。apc激活受体包括，例如，cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign。
[0151]
受体的“配体”是指能选择性结合受体的分子。在一些实施方案中，所述配体为一种多肽。配体的“受体结合片段”是指配体保留其受体结合能力的片段。各种配体可通过与apc上的激活受体结合，刺激树突状细胞或其他apcs的生长、分化、迁移和/或激活。(见banchereau j等,nature(1998)392:245-52；young jw等,stem cells(1996)14:376-387；cella m等,curr opin immunol.(1997)9：10-16；curti a等，j.biol.regul.homeost.agents(2001)15:49-52)。能够调节树突状细胞或其他apcs分化、成熟、扩增和/或激活的配体实例包括，例如cd40配体(cd40l)、cd80配体、cd86配体、cd91配体(rap1)、dec-205配体和dc-sign配体。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括第一结构域，所述第一结构域包括本发明公开的结合apc激活受体的配体或其受体结合片段。
[0152]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合apc的激活受体的抗体，或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign的抗体或抗原结合片段。
[0153]
cd40/cd40l：cd40是一种48kd的跨膜糖蛋白表面受体，其为肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的成员。描述了人cd40的典型氨基酸序列(参见，登录号：alq33424.1 gi：957949089；seq id no：166)，cd40最初被描述为apc上表达的共刺激受体，在b细胞和t细胞激活中发挥核心作用。cd40的配体cd154(也称为trap、t-bam、cd40配体或cd40l)是一种ii
型整合膜蛋白。据报道，cd40l可促进树突状细胞的诱导，并促进免疫原性应答的发生。参见，例如，elgueta r等,immunol rev.(2009)229(1):10.1111；ma d&clark ea,semin immunol.2009 21(5):265
–
272；borges l等j immunol.(1999)163:1289-1297；grewal i,immunol res.(1997)16:59-70。描述了编码cd40配体和等同物的示例性多核苷酸(参见，例如，genbank登录号：x65453和l07414)，以及制剂、组合物和使用方法(美国专利no.6,290,972)。以下提供了人cd40l的示例性氨基酸序列。胞外结构域(seq id no：12)以下划线标出。
[0154]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd40l或cd40l的受体结合片段。在一些实施方案中，cd40l的受体结合片段包括cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，cd40l的受体结合片段包括cd40l的胞外结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l或cd40l的受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合cd40的抗体或其抗原结合片段。
[0155]
cd80和cd86：抗原提呈细胞上表达的cd80(b7.1)和cd86(b7.2)在维持免疫应答所必需的共刺激分子中发挥重要作用。描述了人cd80的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：eaw79565.1 gi:119599971；seq id no:54)。描述了人cd86的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：np_787058.5gi:1519311816；seq id no：57)。cd80和cd86可以与cd28或ctla-4(cd80/cd86的配体，也称为它们在t细胞上的反受体)结合，尽管亲和力不同。cd80在活化的b细胞和干扰素诱导的单核细胞上表达，但在静息b细胞上不表达。cd86在静息单核细胞、树突状细胞和b细胞上组成性表达水平非常低，在活化的t细胞、nk细胞和b淋巴细胞上表达增强。cd80和cd86均含有胞外免疫球蛋白超家族v和c样结构域、疏水跨膜区和细胞质尾部。cd80和cd86均高度糖基化。cd80是一种44-54kd的糖蛋白，包括223个氨基酸的胞外结构域、23个氨基酸的跨膜结构域和61个氨基酸的胞质尾部。cd80含有3个潜在的蛋白激酶磷酸化位点。cd86是一种由306个氨基酸组成的膜糖蛋白。其由220个氨基酸的胞外区、23个氨基酸的疏水跨膜结构域和60个氨基酸的胞质尾部组成。
[0156]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd80配体或cd80配体的受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd86配体或cd86配体的受体结合片段。在一些实施方案中，所述cd80/cd86配体为cd28。在一些实施方案中，cd80/cd86配体的受体结合片段包括cd28的胞外结构域。在一些实施方案中，cd80/cd86配体为ctla-4。在一些实施方案中，cd80/cd86配体的受体结合片段包括ctla-4的胞外结构域。在一些实施方案中，cd80配体为pd-l1。在一些实施方案中，cd80配体的受体结合片段包括pd-l1的胞外结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合cd80的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的
第一结构域包括结合cd86的抗体或其抗原结合片段。
[0157]
cd91/rap1：cd91是apcs上的一种受体，可影响对新生肿瘤的反应。(sedlacek al等,jci insight.2019；4(7):e127239)。描述了人cd91的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：np_002323.2gi:126012562；seq id no：60)。cd91为肿瘤抗原向t细胞的交叉呈递提供了一个重要而高效的通道，这一通道对于建立成功的免疫应答以监测肿瘤是必要的。cd91还参与激活nk细胞反应，激活dcs以产生共刺激，并启动t细胞。受体相关蛋白(rap1)分子量为39kda，是一种er驻留蛋白和ldl受体相关蛋白的分子伴侣，其与cd91有较高的结合亲和力(kd:约3nm)，能激活apcs中的cd91信号转导。描述了编码rap1和等同物的示例性多核苷酸(参见，例如，genbank登录号：aai12068.1、aai05075.1和p30533.1)。人rap1的示例性氨基酸序列如下所示。与cd91结合的rap1结构域3(氨基酸残基位于rap1的219-323位，seq id no：168)用下划线标出。no：168)用下划线标出。
[0158]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括rap1或rap1的受体结合片段。在一些实施方案中，rap1的受体结合片段包括rap1的结构域3。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合cd91的抗体或其抗原结合片段。
[0159]
dec-205：apc的功能与dec-205受体(也称为cd205或淋巴细胞抗原75)的高水平表达有关，尤其是在位于外周或次级淋巴器官t细胞区域的树突状细胞中。描述了人dec-205的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：np_002340.2gi:144446030；seq id no:63)。dec-205受体是一种具有广泛的胞外结构域的吞饮受体，其包含多种子结构域：富含半胱氨酸(cr)结构域、纤连蛋白ii型(fn)结构域和10个连续碳水化合物识别结构域(crd)。这些多凝集素结构域影响体内抗原的加工和提呈效率。利用dec-205人受体进行了描述抗原导向细胞过程的开创性实验，其中，当在使用针对dec-205受体的抗体导向抗原的同时加入树突状细胞的成熟刺激时，t细胞介导的反应发生显著变化。与经典的免疫方案相比，t细胞的增殖增加了不同的数量级。当抗原通过dec-205导向树突状细胞时，协同t细胞(th)的刺激增加；这触发或促进体液免疫应答或抗体产生。
[0160]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括dec-205配体或dec-205配体的受体结合片段。角蛋白是dec-205的天然配体。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括角蛋白或角蛋白的受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合dec-205的抗体或其抗原结合片段。
[0161]
dc-sign：dc特异性icam-3抓取非整合素(dc-sign)受体是一种c型凝集素，含有外部钙依赖性甘露糖结合凝集素结构域。dc-sign与多种化合物相互作用，如人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)、hiv-2和猴免疫缺陷病毒(siv)的包膜糖蛋白gp120，以及其他病原体如丙型肝炎、埃博拉、巨细胞病毒、登革热病毒、分枝杆菌、利什曼原虫、白色念珠菌和幽门螺杆菌等。dc-sign在病原体传播和感染的建立中起重要作用。描述了人dc-sign的示例性氨基酸
序列(参见，例如，登录号：aak20997.1 gi：13383468；seq id no：66)。
[0162]
dc-sign受体还能结合icam2和icam3。icam2在内皮细胞上表达，icam3在t细胞上表达。dc-sign还与β2-整合素mac-1(cd11b/cd18)相互作用，所述β2-整合素mac-1(cd11b/cd18)在中性粒细胞上表达并促进与dc细胞的相互作用，从而控制免疫应答的增强。作为另一个例子，中性粒细胞上表达的ceacam1也能与dc-sign相互作用。
[0163]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括dc-sign配体或dc-sign配体的受体结合片段。在一些实施方案中，所述dc-sign配体为icam2、icam3、cd18或ceacam1，或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述dc-sign配体为icam2或其受体结合片段。描述了人icam2的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：cag46611.1gi:49456581；seq id no：169)。在一些实施方案中，所述dc-sign配体为icam3或其受体结合片段。描述了人icam3的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：p32942.2 gi：206729872；seq id no：170)。在一些实施方案中，所述dc-sign配体为cd18或其受体结合片段。描述了人cd18的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：p05107.2 gi:124056465；seq id no：171)。在一些实施方案中，所述dc-sign配体为ceacam1或其受体结合片段。描述了人ceacam1的示例性氨基酸序列(参见，例如，登录号：aah14473.1 gi:15680237；seq id no：172)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括结合dc-sign的抗体或其抗原结合片段。5.2.2免疫效应细胞共刺激受体
[0164]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包含激活抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)的第一结构域的和激活免疫效应细胞(例如，t细胞)的第二结构域，其中所述第二结构域包括(a)所述免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，(b)所述免疫效应细胞的共刺激配体，或其受体结合片段，或(c)结合免疫效应细胞共刺激受体的抗体，或其抗原结合片段。
[0165]
如本发明所用且如本领域所理解，“免疫效应细胞”是指具有造血起源并在针对靶标(如病原体、癌细胞或外来物质)的免疫应答中发挥直接作用的细胞。免疫效应细胞包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，本发明所提供融合蛋白的激活免疫效应细胞的第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激受体。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或粒细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为t细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为nk细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞为巨噬细胞。
[0166]
免疫效应细胞的“刺激”是指通过刺激分子与其同源配体结合从而在免疫效应细胞中介导信号转导事件而诱导的初级应答，其可以改变某些基因的表达和/或细胞骨架结构的重组等。免疫效应细胞的“刺激分子”是指免疫效应细胞上的一种分子，它与通常存在于apc上的同源配体结合后，可以介导信号转导以促进免疫效应细胞的成熟、分化、增殖和/或激活。例如，t细胞的刺激分子，tcr/cd3复合物触发t细胞的激活。刺激分子的配体或“刺激配体”是指通常存在于apc上并能与免疫效应细胞上的刺激分子结合以介导免疫效应细胞的初级应答的配体，所述初级应答包括但不限于成熟、分化、激活、启动免疫应答、增殖等。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且包括例如负载肽、抗cd3抗体、超激动剂抗cd28
抗体和超激动剂抗cd2抗体的mhc i类分子。
[0167]
如本发明所用且如本领域所理解，“共刺激信号”是指来自共刺激受体(例如cd28或4-1bb)的信号，其与初级信号(例如tcr/cd3)结合促进免疫效应细胞(例如t细胞)的最佳克隆扩增、分化和效应功能。如本发明所用且如本领域所理解，免疫效应细胞的“共刺激受体”是指免疫效应细胞上与“共刺激配体”特异性结合以介导免疫效应细胞的共刺激反应的分子，所述共刺激反应例如增强免疫效应细胞的激活或增殖。免疫效应细胞的共刺激受体包括但不限于cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、cd30、2b4、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43。共刺激受体的“功能片段”是共刺激受体的片段，其保留共刺激受体介导共刺激信号和刺激免疫效应细胞的功能。在一些实施方案中，共刺激受体的功能片段保留了共刺激受体的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域为共刺激受体的胞质结构域。在一些实施方案中，来自免疫效应细胞(例如t细胞)的共刺激受体的信号降低了免疫效应细胞的激活阈值。在一些实施方案中，来自t细胞共刺激受体的信号导致tcr信号事件增强，其中所述tcr信号为高效细胞因子产生(通过增强转录活性和信使rna稳定性)、细胞周期进程、存活、代谢调节和t细胞应答所必需。
[0168]
如本发明所用且如本领域所理解，“共刺激配体”是指特异地结合免疫效应细胞上的同源共刺激受体的分子，从而提供除了由刺激分子提供的初级信号之外的信号，该信号介导免疫效应细胞中的应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以存在于apc上(例如，树突状细胞)。共刺激配体包括但不限于cd58、cd70、cd83、cd80、cd86、cd137l(4-1bbl)、cd252(ox40l)、cd275(icos-l)、cd54(icam-1)、cd49a、cd112(pvrl2)、cd150(slam)、cd155(pvr)、cd265(rank)、cd270(hvem)、tl1a、cd127、il-4r、gitr-l、tim-4、cd153(cd30l)、cd48、cd160、cd200r(ox2r)和cd44。共刺激配体的“受体结合片段”是指配体保留其结合受体能力的片段。
[0169]
下面举例说明了一些共刺激受体和共刺激配体。应理解，本发明提供的或本领域已知的任何共刺激受体和/或共刺激配体可用作本发明提供的融合蛋白的一部分。
[0170]
cd28：分化簇28(cd28)是一种在t细胞上表达的蛋白，其为t细胞激活和存活提供共刺激信号。cd28是cd80(b7.1)和cd86(b7.2)蛋白的受体。cd28是t细胞最佳克隆扩增、分化和效应功能的共刺激受体。cd28结合降低了t细胞激活阈值并导致tcr信号事件增强，其中所述tcr信号为高效细胞因子产生(通过增强转录活性和信使rna稳定性)、细胞周期进程、存活、代谢调节和t细胞应答所必需。cd28是免疫突触(is)组织的关键因素，在其中cd28增强t细胞和apc之间的密切接触。
[0171]
在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包含激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd28多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括cd28的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包含激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含结合cd28的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包含激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含结合cd28的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd28的功能片段，所述cd28的功能片段包括cd28的胞内/胞质结构域的一部分，其可作为共刺激信号传导结构域发挥作用。cd28可以具有如下氨基酸序列或其功能片段：所
述氨基酸序列对应于genbank no.p10747(p10747.1，gi:115973)或np_006130(np_006130.1，gi:5453611)的序列。在一个实施方案中，本发明公开的融合蛋白可具有包含cd28胞质结构域的氨基酸序列或其片段，所述cd28胞质结构域对应于cd28的180至122位氨基酸(如下序列的下划线部分，seq id no:14)。在另一实施方案中，本发明公开的融合蛋白可以具有进一步包含cd28跨膜结构域的氨基酸序列或其功能片段，所述cd28跨膜结构域对应于153至179位氨基酸。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd28序列可包含在本发明公开的融合蛋白中。
[0172]
4-1bb.4-1bb也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9，可作为肿瘤坏死因子(tnf)配体并具有刺激活性(stephan mt等,nat med(2007)13(12)：1440-1449)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含4-1bb多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括4-1bb的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含包括4-1bb的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合4-1bb的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明所提供融合蛋白的第二结构域可以包括源自4-1bb的共刺激信号传导结构域。4-1bb多肽可以具有如下氨基酸序列或其片段，所述氨基酸序列对应于具有genbank no.p41273(p41273.1，gi:728739)或np_001552(np_001552.2，gi:5730095)的序列。在一个实施方案中，本发明所提供融合蛋白的第二结构域可以具有包括4-1bb胞质结构域或其功能片段的共刺激结构域，所述4-1bb胞质结构域对应于214至255位氨基酸(如下序列的下划线部分，seq id no:17)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的4-1bb序列可包括在本发明公开的融合蛋白中。
[0173]
ox40.ox40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4前体或cd134，是tnfr-受体超家族的一员。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括ox40多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括ox40的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合ox40的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包
括结合ox40的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自ox40的共刺激信号传导结构域。ox40多肽可以具有如下氨基酸序列或其片段，所述氨基酸序列对应于具有genbank no.p43489(p43489.1，gi:1171933)或np_003318(np_003318.1，gi:4507579)的序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白可以具有共刺激结构域，所述共刺激结构域包括ox40胞质结构域，所述ox40胞质结构域对应于236至277位氨基酸(如下序列的下划线部分，seq id no:26)，或其功能片段。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的ox40序列可包括在融合蛋白中。果需要，短于或长于特定描述结构域的ox40序列可包括在融合蛋白中。
[0174]
dap10，又称造血细胞信号转导因子，是一种与造血细胞受体家族相关联的信号转导亚单位。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括dap10多肽或其功能片段。dap10多肽可以具有genbank no.np055081.1(gi:15826850)的氨基酸序列或其片段。dap10多肽可以具有seq id no:28所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二结构域包括dap10的胞质结构域。在一些实施方案中，所述第二结构域包括结合dap10的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括结合dap10的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域可以包括源自dap10的共刺激信号传导结构域。dap10共刺激信号传导结构域可以具有dap10胞质结构域或其功能片段。所述dap10胞质结构域对应于seq id no:28所示序列的70-93位氨基酸。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的dap10序列可包括在融合蛋白中。
[0175]
icos.诱导型t细胞共刺激前体(icos)又称cd278，是一种表达于激活t细胞上的cd28超家族共刺激受体。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括icos多肽或其功能片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合icos的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括icos的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合icos的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自icos的共刺激信号传导结构域。icos多肽可以具有如下提供的氨基酸序列或其片段，所述氨基酸序列对应于genbank no.np036224(np036224.1，gi:15029518)的序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以具有共刺激结构域，所述共刺激结构域包括icos胞质结构域或其功能片段。icos胞质结构域对应于icos的162至199位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:20)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的icos序列可包括在融合蛋白中。
[0176]
cd27：cd27(tnfrsf7)是一种跨膜受体，表达于人cd8 、cd4 t细胞亚群、nkt细胞、nk细胞亚群和造血祖细胞，并在foxp3 cd4t细胞和b细胞亚群中诱导表达。已有研究发现，cd27可提供共刺激信号，其提高人t细胞体内存活率和抗肿瘤活性。(参见，song and powell；oncoimmunology 1(4)：547-549(2012))。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd27多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括cd27的胞质结构域。在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合cd27的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合cd27的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自cd27的共刺激结构域。cd27多肽可以具有如下提供的氨基酸序列或其片段，所述氨基酸序列对应于具有uniprotkb/swiss-prot no.:p26842.2(gi:269849546)的序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域或其功能片段，所述共刺激结构域包括cd27胞质结构域，所述cd27胞质结构域对应于213至260位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:23)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd27序列可包括在融合蛋白中。
[0177]
cd30：cd30及其配体(cd30l)分别属于肿瘤坏死因子受体(tnfr)和肿瘤坏死因子(tnf)超家族的一员。cd30在许多方面与ox40行为相似，并促进tcr刺激诱导的增殖和细胞因子的产生。(goronzy和weyand，arthritis research&therapy 10,no.s1(2008):s3)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd30多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括cd30的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含结合cd30的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合cd30的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自cd30的共刺激结构域。cd30多肽可以具有如下提供的氨基酸序列或其片段，所述氨基
酸序列对应于具有genbank no.:aaa51947.1(gi:180096)的序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域或其功能片段，该共刺激结构域包括cd30胞质结构域，所述cd30胞质结构域对应于407至595位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:32)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd30序列可包括在融合蛋白中。
[0178]
2b4 2b4(cd244)是一种在nk细胞和cd8 t细胞上均表达的共刺激受体。其靶点为造血细胞(包括b细胞和t细胞)以及活化单核细胞和粒细胞上表达的非mhc样分子(cd48)。2b4通过其配体与靶细胞结合而激活，导致nk(或t细胞)激活，并杀伤靶细胞。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含2b4多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括2b4胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合2b4的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合2b4的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自2b4的共刺激结构域。2b4多肽可以具有如下提供的氨基酸序列或其片段，所述氨基酸序列对应于具有登录号：q9bzw8.2(gi:47605541)的序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域或其功能片段，该共刺激结构域包括2b4胞质结构域，所述2b4胞质结构域对应于251至370位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:35)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的2b4序列可包括在融合蛋白中。
[0179]
cd2cd2分子通过其配体cd58参与刺激该t细胞(尤其是cd28缺陷t细胞亚群)的增
殖、细胞因子生成和效应功能。cd58广泛表达于包括树突状细胞的apc上。cd2的参与放大了cd28-cd8

t细胞中的tcr信号，证明cd2-cd58相互作用具有真正的共刺激作用。cd2信号可促进cd28-cd8

t细胞对病毒感染的控制，但在持续性ag慢性刺激过程中也可有助于cd28-cd8

t细胞的持续扩增。(judith leitner j等，immunol,2015,195(2)477-487)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd2多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括cd2胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合cd2的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合cd2的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自cd2的共刺激结构域。cd2多肽可以具有如下提供的氨基酸序列或其片段，所述氨基酸序列对应于具有登录号：np_001758.2gi:156071472的序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域或其功能片段，该共刺激结构域包括cd2胞质结构域，所述cd2胞质结构域对应于236至351位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:38)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd2序列可包括在融合蛋白中。
[0180]
light tnf超家族成员14(又称ltg、cd258、hveml和light)是参与细胞免疫应答的共刺激受体。light可以作为激活淋巴细胞的共刺激因子发挥功能，并作为对疱疹病毒感染的遏制剂。light已被证明能刺激t细胞的增殖，并引发多种肿瘤细胞的凋亡。light存在于t细胞和基质细胞中。light在人pbmcs产生的未成熟树突状细胞(dcs)上表达。light参与共刺激人t细胞增殖、扩增nf-κb信号通路，并在一种抗原信号存在的情况下，优先诱导ifn-γ(而不是il-4)的产生。(tamada k等,j immunol，2000，164(8)4105-4110)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括light多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括light胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合light的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合light的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自light的共刺激结构域。light多肽可以具有与如下提供的序列(登录号：np_001363816.1gi:1777376047)相对应的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域或其功能片段，该共刺激结构域包括light胞质结构域，所述light胞质结构域对应于1至37位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:41)。应
理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的light序列可包括在融合蛋白中。
[0181]
gitr tnf受体超家族成员18(也称为tnfrsf18、aitr、gitr；cd357；gitr-d；energen)在t细胞激活时表达增加。通过gitr刺激t细胞可以增强对肿瘤和病毒病原体的免疫力，并加剧自身免疫性疾病。通过gitr刺激的效应通常被认为是由于免疫抑制性cd4 cd25 调节性t(treg)细胞的效应活性减弱所致。(shevach,e.和stephens,g.nat rev immunol 6,613-618(2006))。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括gitr多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括gitr胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合gitr的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合gitr的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自gitr的共刺激结构域。gitr多肽可以具有与如下提供的序列(登录号：aai52382.1gi:158931986)或其片段相对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域或其功能片段，该共刺激结构域包括gitr胞质结构域，所述gitr胞质结构域对应于184至241位氨基酸(下面序列的下划线部分，seq id no:44)。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的gitr序列可以包括在融合蛋白中。
[0182]
dr3 tnf受体超家族成员25(又称dr3、tr3、ddr3、lard、apo-3、tramp、wsl-1、gef720、wsl-lr、plekhg5或tnfrsf12)在富含淋巴细胞的组织中优先表达，并在调节淋巴细胞稳态中发挥作用。此受体可刺激nf-κb激活并调节细胞凋亡。此受体的信号转导是由各种含有转接蛋白的死亡结构域介导的。已有报道该基因编码不同亚型的多个选择性剪接转录变体，其中大部分是潜在的分泌分子。该基因在b细胞和t细胞中的选择性剪接在t细胞激活时遇到程序性变化，所述选择性剪切主要产生全长膜结合亚型，并参与控制t细胞激活诱导的淋巴细胞增殖。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括dr3多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括dr3胞质结构域。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合dr3的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括结合dr3的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构
cancer,2015oct.pmid 26194173)。多肽可以具有与如下提供的序列相对应的氨基酸序列(例如，登录号np_001770；np_001138294)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd58或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括对应于29-215位氨基酸(下划线如下)的cd58的胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd58序列可以包括在融合蛋白中。
[0185]
cd70(也称为ki-24、cd27l、tnfsf7)可增强细胞毒性t细胞的生成，并有助于t细胞激活。cd70是一种细胞因子，属于肿瘤坏死因子(tnf)配体家族，是tnfrsf27/cd27的配体。其为活化t和b淋巴细胞上的表面抗原。其诱导共刺激t细胞增殖，增强溶细胞性t细胞的生成，并有助于t细胞激活。据报道，该细胞因子还在调节b细胞激活、自然杀伤细胞的细胞毒功能和免疫球蛋白合成中发挥作用。(参见例如，masamoto i等，leuk lymphoma,2016；jacobs j,et al.pharmacol ther，2015nov)。cd70多肽可以具有与如下序列(例如，登记号：np_001243；np_001317261；xp_016883012)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd70或其受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括对应于39-193位氨基酸(下划线如下)的cd70胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd70序列可以包括在融合蛋白中。
[0186]
cd83(又称bl11、hb15)是一种单通道i型膜蛋白，并且是免疫球蛋白受体超家族的一员。cd83可结合cd83l并参与抗原提呈的调节(li z等，haematologica,2018apr.；ju x等，j immunol,2016dec 15.pmid 29351987；horvatinovich jm等，j immunol,2017mar 15.pmid 28193829)。cd83多肽可以具有与下面提供的序列相对应的氨基酸序列(例如，np_001035370,np_001238830,np_004224)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd83或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于20-144位氨基酸(下划线如下)的cd83胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd83序列可以包括在融合蛋白中。
[0187]
cd80(也称为b7、b7-1、b7.1、bb1、cd28lg、cd28lg1、lab7)是一种单通道i型膜蛋白，并且是免疫球蛋白受体超家族的一员。cd80的功能涉及抗原提呈调节和免疫刺激。cd80结合cd28或ctla-4，诱导t细胞增殖和细胞因子产生。(参见，例如，feng xy等，future oncol，2019feb.pmid 30628844)。cd80多肽可具有对应于如下序列(例如，eaw79565.1；np_005182)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd80或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于35-242位氨基酸(下划线如下)的cd80胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd80序列可以包括在融合蛋白中。
[0188]
cd86(也称为b70、b7-2、cd28lg2)是一种整合素αx链蛋白，其能够结合cd28和cd152。该蛋白与β2链(itgb2)结合形成白细胞特异性整合素，称为失活-c3b(ic3b)受体4(cr4)。αxβ2复合物与αmβ2整合素在中性粒细胞和单核细胞粘附刺激内皮细胞，以及在吞噬补体包被颗粒过程中性质重叠。(参见例如，tac
á
cs f等，pathol oncol res,2019pmid30406401；sch
ü
tz c等，leukemia.2017；31(4):829-836.doi:10.1038/leu.2017.9)。cd86多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：np_787058.5np_001193853)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd86或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于24-247位氨基酸(下划线如下)的cd86胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd86序列可以包括在融合蛋白中。
[0189]
cd137l(又称4-1bbl、tnfsf9、cdw137、ila)是肿瘤坏死因子(tnf)受体家族成员之一。这种跨膜细胞因子作为tnfrsf9/4-1bb的配体，是一种双向信号转导因子，所述tnfrsf9/4-1bb是t淋巴细胞中的共刺激受体分子。该细胞因子及其受体参与抗原提呈过程和细胞毒性t细胞的生成。已证明4-1bbl除促进t淋巴细胞增殖外，还可重新激活无能t淋巴细胞。这种细胞因子也被证明是在cd8 t细胞中，进行最佳cd8应答所必需的。这种细胞因子
在癌细胞系中表达，并被认为参与t细胞-肿瘤细胞相互作用。(参见，例如，shen yl等，j dig dis,2017jul.pmid 28547807；qian y等，med oncol,2015mar.pmid 25631633)。cd137l多肽可以具有与如下序列(例如，np_003802.1)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd137l或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于50-254位氨基酸(下划线如下)的cd137l的胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd137l序列可以包括在融合蛋白中。
[0190]
cd252(也称为ox40l、gp34)是整合素β链，其与不同的α链结合形成整合素异二聚体。cd252是受体tnfrsf4(ox40)的配体。cd252共同刺激t细胞的增殖和细胞因子的生成。cd252还在t细胞apc相互作用中发挥功能，介导活化的t细胞与内皮细胞的粘附。(参见例如，roszik j等，cancer immunol immunother,2019sep.pmid 31501955)。
[0191]
cd252多肽可以具有与如下提供的序列(例如，np_001284491xp_005245532；np_003317)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd252或其受体结合片段。在一些实施方案中，第二结构域包括对应于51-183位氨基酸(下划线如下)的cd252胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd252序列可以包括在融合蛋白中。
[0192]
cd275(也称为icos-l、b7-h2、b7-rp1、gl50)。cd275是icos/cd278的配体，其为一种促进t细胞增殖和细胞因子分泌的共刺激受体。cd275还可诱导b细胞的增殖和分化。(参见例如，han y等，front immunol,2018.pmid 30319662；cao y等，int immunopharmacol，2018mar.pmid 29414642)。cd275多肽可以具有与如下提供的序列(例如，np_001269979、np_001269980、np_001269981、np_056074、np_001352688xp_016883799)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd275或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于19-256位氨基酸(下划线如下)的cd275胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd275序列可以包括在融合蛋白中。
[0193]
cd54(又称icam-1)是一种细胞表面糖蛋白，通常在内皮细胞和免疫系统细胞上表达。其与cd11a/cd18或cd11b/cd18型整合素结合。cd54的功能包括细胞粘附、淋巴细胞激活和迁移。(参见，例如reyes-botella,c.等，journal of periodontology 71.4(2000):614-617；schildberg,frank a.等，hepatology 54.1(2011):262-272)。cd54多肽可以具有与如下提供的序列(例如np_000192)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd54或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于28-480位氨基酸(下划线如下)的cd54胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd54序列可以包括在融合蛋白中。的cd54序列可以包括在融合蛋白中。
[0194]
cd49a(又称为vla1，或itga1)是一种整合素受体的α1亚单位。已知cd49a介导记忆cd8 t细胞持续存在和应答以及nk细胞活性。cd49a在巨噬细胞上表达。(参见例如，bromley等，am assoc immnol(2020):81-10；li等，american journal of reproductive immunology 81.4(2019):e13101.；sun et al.cancer immunology research(2019))。
[0195]
cd49a多肽可以具有与如下提供的序列(例如，np_852478)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd49a或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于29-1141位氨基酸(下划线如下)的cd49a胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd49a序列可以包括在融合蛋白中。
[0196]
cd112(又称pvrl2、prr2、nectin-2、hveb)是一种人质膜糖蛋白。其可以结合例如cd226、nectin-3、dnam-1和afadin。其中，发现cd112与nk细胞上的dnam-1结合以诱导其溶细胞活性。(参见例如，bekes i等，cancer sci,2019jun.pmid 30843637；fujimoto y等，acta virol,2016mar.pmid 26982466；j exp med(2003)198(4):557
–
567)。
[0197]
cd112多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：np_001036189、np_002847)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd112或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于32-360位氨基酸(下划线如下)的cd112胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd112序列可以包括在融合蛋白中。
[0198]
cd150(又称slam、slamf1、ipo-3)属于信号淋巴细胞活化分子家族。cd150可以结合cd45。cd150的功能包括t细胞和b细胞的共刺激。(参见例如，sidorenko and clark.nature immunology 4.1(2003):19-24.yusuf等，the journal of immunology 185.1(2010):190-202.；de salort et al.immunology letters 134.2(2011):129-136)。
[0199]
cd150多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：np_001317683、xp_016857618、np_003028)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd150或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于21-237位氨基酸(下划线如下)的cd150胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd150序列可以包括在融合蛋白中。
[0200]
cd155(也称为pvr、necl-5)是一种跨膜糖蛋白，其属于免疫球蛋白超家族。其外结构域介导细胞与细胞外基质分子玻连蛋白的粘附，而其胞内结构域与动力蛋白轻链tctex-1/dynlt1相互作用。cd155在脊髓灰质炎病毒复制的第一步中作为脊髓灰质炎病毒的细胞受体。cd155可结合脊髓灰质炎病毒、玻连蛋白、cd226、cd96、αvβ3、cd111、cd112。已知cd155可介导nk细胞粘附并触发其效应功能。(参见例如，chan等，the journal of immunology 184.2(2010):902-911)。cd155多肽可以具有与如下提供的序列(例如np_001129240；np_001129241；np_001129242；np_006496)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd155或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于21-343位氨基酸(下划线如下)的cd155胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd155序列可以包括在融合蛋白中。
[0201]
cd265(也称为rank、trance-r、odfr、tnfrsf11a)是tnf-受体超家族的一员。cd265诱导nf-κb和mapk8/jnk的激活，并在调节t细胞与树突状细胞相互作用中发挥重要作用。cd265可结合trance。cd265促进t细胞生长和树突状细胞功能，并调节淋巴结器官形成。(参见例如，hanada等，journal of molecular medicine 89.7(2011):647-656)。cd265多肽可以具有与如下提供的序列(例如，np_001257878、np_001257879、np_003830)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd265或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于30-212位氨基酸(下划线如下)的cd265胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd265序列可以包括在融合蛋白中。
[0202]
cd270(又称为hvem、hvea、tr2、tnfrsf14)是tnf受体超家族的一员。cd270可结合cd258和cd272。其在激活炎症和抑制性t细胞免疫应答信号转导通路中发挥功能。cd270结合单纯疱疹病毒(hsv)病毒包膜糖蛋白d(gd)，介导其进入细胞。(参见例如，meng q等，j immunol,2019apr 1.pmid 30770415)。cd270多肽可以具有与如下提供的序列(例如，np_001284534；np_003811)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd270或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于39-202位氨基酸(下划线如下)的cd270胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd270序列可以包括在融合蛋白中。
[0203]
tl1a(也称为tl1；tl1a；vegi；tnfsf15、tnlg1b；vegi192a)是一种属于tnf配体家族的细胞因子。该细胞因子是受体tnfrsf25和诱饵受体tnfrsf21/dr6的配体。tl1a可激活nf-κb和map激酶，作为自分泌因子诱导内皮细胞凋亡。还发现这种细胞因子可刺激增强人t细胞和nk细胞中ifn-γ的产生。(参见例如，papadakis等，the journal of immunology 172.11(2004):7002-7007)。tl1a多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号np_005109；np_001191273)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括tl1a或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于57-251位氨基酸(下划线如下)的tl1a胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的tl1a序列可以包括在融合蛋白中。
[0204]
cd127(也称为ilra；cd127；il7ra；cdw127；il-7r-α)是一种白介素7(il7)受体。已证明该蛋白在淋巴细胞发育过程中的v(d)j重组中发挥关键作用。该基因缺陷可能与重症联合免疫缺陷(scid)有关。(参见例如，carrette等，seminars in immunology.24(3)academic press,2012)cd127多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：np_002176、xp_942460)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd127或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于21-239位氨基酸(下划线如下)的cd127胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd127序列可以包括在融合蛋白中。
[0205]
il-4r(也称为cd124；il4ra；il-4ra)是一种i型跨膜蛋白，其能结合白介素4和白介素13以调节ige的产生。其能够促进th2细胞的分化。还发现其在过敏和寄生虫感染期间
yang.north american journal of medical sciences 3.5(2011):217)。tim-4多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：np_001140198.1；np612388.2；q96h15.2)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括tim-4或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于25-314位氨基酸(下划线如下)的tim-4胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的tim-4序列可以包括在融合蛋白中。4序列可以包括在融合蛋白中。
[0208]
cd153(cd30l，tnfsf8)，是一种属于肿瘤坏死因子(tnf)配体家族的细胞因子。该细胞因子是tnfrsf8/cd30的配体，tnfrsf8/cd30是细胞表面抗原，也是霍奇金淋巴瘤和相关血液恶性肿瘤的标志物。cd153与cd30结合，诱导t细胞增殖和激活(参见例如，shimozato等，biochemical and biophysical research communications 256.3(1999):519-526；croft,nature reviews immunology 3.8(2003):609-620.mar
í
n and luis,tuberculosis 102(2017):8-15)。cd153多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：np_001235、np_001239219)相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd153或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于63-234位氨基酸(下划线如下)的cd153胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd153序列可以包括在融合蛋白中。
[0209]
cd48(也称为bcm1、blast、blast1、mem-102或slamf2)是免疫球蛋白样受体cd2亚家族的一员，所述免疫球蛋白样受体cd2亚家族免疫球蛋白样受体cd2亚家族包括slam(信号转导淋巴细胞激活分子)蛋白。cd48能与cd2结合，并向t细胞传递共刺激信号。cd48存在于淋巴细胞和其他免疫细胞、树突状细胞及内皮细胞的表面，参与这些细胞的激活和分化通路。cd48多肽可以具有与如下提供的序列(登录号：eaw52705.1 gi：119573090；登录号：cag33293.1 gi:48146141)，或该序列片段相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd48或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于27-220位氨基酸(下划线如下)的cd48成熟形式。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd48序列可以包括在融合蛋白中。
[0210]
cd160(也称为nk1、by55或nk28)是一种27kda的糖蛋白。cd160的表达与外周血nk细胞及具有溶细胞效应活性的cd8 t淋巴细胞密切相关。cd160多肽可以具有与如下提供的序列(例如，登录号：eaw71440.1gi:119591846；登录号：cai13713.1gi:55959477)，或其片段相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包括cd160或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于25-159位氨基酸(下划线如下)的cd160的成熟形式。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd160序列可以包括在融合蛋白中。
[0211]
cd200r(也称为hcrtr2、mox2r、ox2r)能结合ox-2膜糖蛋白。cd200r是一种含有两个免疫球蛋白样结构域的细胞表面糖蛋白。据报道，它以组织特异性的方式控制骨髓功能。据报道，它还通过使用辅助分子(如dap12)到细胞表面来调节免疫细胞的活性(参见例如，gorczynski,international scholarly research notices 2012(2012))。cd200r多肽可以具有与如下提供的序列相对应的氨基酸序列(例如，登录号：np_620161；np_620385)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构域包含cd200r或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于29-243位氨基酸(下划线如下)的cd200r胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd200r序列可以包括在融合蛋白中。
[0212]
cd44(也称为h-cam、pgp-1、epican、hutch-i、lhr、ecmr-iii)为一种参与细胞间相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。它是透明质酸(ha)的受体，并且也可与其他配体相互作用，如骨桥蛋白、胶原和基质金属蛋白酶(mmps)。该蛋白参与多种细胞功能，包括淋巴细胞激活、再循环和归巢、造血和肿瘤转移。(参见例如，huet等，the journal of immunology 143.3(1989):798-801)。cd44多肽可以具有与如下提供的序列相对应的氨基酸序列(例如，登录号：np_000601、np_001001389)。在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第二结构
域包括cd44或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括对应于21-649位氨基酸(下划线如下)的cd44胞外结构域。应理解，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd44序列可以包括在融合蛋白中。5.2.3示例性laco-stim融合蛋白
[0213]
因此，本发明提供的融合蛋白包括激活抗原提呈细胞(apc)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中，所述第一结构域包括(a)结合所述apc的激活受体的配体，或其受体结合片段，或(b)结合所述apc的激活受体的抗体，或其抗原结合片段；所述第二结构域包括(a)所述免疫效应细胞的共刺激受体，或其功能片段，(b)结合所述免疫效应细胞共刺激受体的配体，或其受体结合片段，或(c)结合免疫效应细胞共刺激受体的抗体，或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述apc选自由树突状细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞、单核细胞、b细胞、t细胞和朗格汉斯细胞组成的群组。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。
[0214]
在一些实施方案中，所述第一结构域包括(a)结合所述apc的激活受体的配体，或其受体结合片段，或(b)结合所述apc的激活受体的抗体，或其抗原结合片段，其中所述apc的激活受体选自由cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign组成的群组。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合apc的激活受体的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd40的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括cd40l。在一些实施方案中，cd40l的受体结合片段包括cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，cd40l的受体结合片段包括cd40l的胞外结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l或cd40l的受体结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd80的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd86的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括cd28胞外结构域。在一些实施方案中，所述第一结构域包括cd28。在一些实施方案中，所述第一结构域包括ctla-4的胞外结构域。在一些实施方案中，所述第一结构域包括ctla-4。在一些实施方案中，所述第一结
构域包括结合cd91的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括rap1的结构域3。在一些实施方案中，所述第一结构域包括rap1。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合dec-205的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合dc-sign的配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括icam2、icam3、cd18或ceacam1或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括icam2或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括icam3或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括cd18，或其受体结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括ceacam1或其受体结合片段。
[0215]
在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合apc的激活受体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述apc的激活受体选自由cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign组成的群组。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd40的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd80的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd86的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd91的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合dec-205的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合dc-sign的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括单克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一结构域包括嵌合抗体。在一些实施方案中，所述第一结构域包括人源化抗体。在一些实施方案中，所述第一结构域包括人抗体。在一些实施方案中，所述第一结构域包括fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、(scfv)2、单链抗体、双可变区抗体、双特异性抗体、纳米抗体或单可变区抗体。在一些实施方案中，所述第一结构域包括人抗体。在一些实施方案中，所述第一结构包括scfv。
[0216]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括标记为f2.103、f5.157、f5.77、4d11、a40c或119的抗体，如下表a所示。表a：抗cd40抗体
[0217]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有(a)重链可变区(vh)，所述重链可变区与seq id no:76、79、82、85、88或91所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性；和/或(b)轻链可变区(vl)，所述轻链可变区与seq id no:77、80、83、86、89或92所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有：(a)具有seq id no:76、79、82、85、88或91所示氨基酸序列的vh；和/或(b)具有seq id no:77、80、83、86、89或92所示氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有vh和
vl，所述vh和vl分别具有(1)seq id no:76和77所示序列；(2)seq id no:79和80所示序列；(3)seq id no:82和83所示序列；(4)seq id no:85和86所示序列；(5)seq id no:88和89所示序列；或(6)seq id no:91和92所示序列。
[0218]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:75、78、81、84、87或90所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:75所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:78所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:81所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:84所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:87所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40 scfv，所述抗cd40 scfv与seq id no:90所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括具有seq id no:75所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括具有seq id no:78所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括具有seq id no:81所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括具有seq id no:84所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括具有seq id no:87所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括具有seq id no:90所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。
[0219]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括(a)免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，或(b)结合免疫效应细胞的共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。所述免疫效应细胞可选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞
组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段，其中所述免疫细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或粒细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞的共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括共刺激受体的功能片段，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，所述功能片段包括共刺激受体的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域进一步包括共刺激受体的跨膜结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd28的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd28的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括4-1bb的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括4-1bb的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括icos的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括icos的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd27的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd27的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括ox40的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括ox40的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括dap10的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括dap10的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括2b4的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括2b4的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd30的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd30的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd2的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd2的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括light的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括light的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括gitr的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括gitr的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括dr3的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括dr3的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd43的功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd43的胞质结构域。
[0220]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合免疫效应细胞的共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。所述免疫效应细胞可选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞的共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合cd28的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合4-1bb的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结
构域包括结合icos的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合cd27的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合ox40的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合dap10的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合2b4的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合cd30的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合cd2的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合light的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合gitr的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合dr3的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括结合cd43的抗体或其抗原结合片段。
[0221]
在一些实施方案中，所述第二结构域包括单克隆抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域包括嵌合抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域包括人源化抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域包括人抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域包括fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、(scfv)2、单链抗体、双可变区抗体、双特异性抗体、纳米抗体或单可变区抗体。在一些实施方案中，所述第二结构域包括人抗体。在一些实施例中，所述第二结构域包括scfv。
[0222]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括抗cd28 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd28抗体或其抗原结合片段包括标记为1412的抗体。表b：示例性抗cd28抗体
[0223]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有：(a)与seq id no:73所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的vh；和/或(b)与seq id no:74所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、
至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的vl。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有：(a)具有seq id no:73所示氨基酸序列的vh；和/或(b)具有seq id no:74所示氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括抗cd28 scfv，所述抗cd28 scfv与seq id no:72所示序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括具有seq id no:72所示氨基酸序列的抗cd28 scfv。
[0224]
本发明描述的融合蛋白(即，laco-stim分子)可以包括本发明公开的或本领域其他已知的apc激活剂(结合激活受体的配体或抗体)和免疫效应细胞激活剂(共刺激受体或结合共刺激受体的抗体)的任何组合。为便于说明，下文提供了各种形式的cd40-c28 laco-stim融合蛋白，其通过cd40/cd40l信号转导激活apcs(例如，树突状细胞)，并通过cd28信号转导激活免疫效应细胞(例如，t细胞)。5.2.3.1示例性laco-stim(1):apc激活受体的配体 共刺激受体(例如，cd40l-cd28)
[0225]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括激活抗原提呈细胞(apc)的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc的激活受体的配体或其受体结合片段，所述第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段。在一些实施方案中，所述第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激受体的胞质结构域。在一些实施方案中，所述第一结构域的c-末端连接到所述第二结构域的n-末端。在一些实施方案中，所述第一结构域的n-末端连接到所述第二结构域的c-末端。在一些实施方案中，本发明所提供融合蛋白为膜融合蛋白。在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域通过连接子连接。所述连接子可以为柔性连接子或刚性连接子。在一些实施方案中，所述连接子具有(ggggs)n，n＝1、2、3、4或5(seq id no:215)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有(eaaak)n，n＝1、2、3、4或5(seq id no:216)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有(pa)np，n＝1、2、3、4或5(seq id no:217)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有gsggggsggggsggggs(seq id no:219)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有ggggs(seq id no:218)的氨基酸序列。
[0226]
在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合apc激活受体的配体或其受体结合片段，所述apc激活受体选自由cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括全长cd40l。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有与seq id no:9所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域具有seq id no:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd40l的胞外结构域(例如，seq id no:12)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有与seq id no:12所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域具有seq id no:12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有cd40l(seq id no:
9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l或其功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l胞外结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。
[0227]
在一些实施方案中，所述第二结构域包括共刺激受体或其功能片段，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，所述第二结构域包括共刺激受体的胞质结构域，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd28胞质结构域(例如，seq id no:14)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以具有与seq id no:14所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域具有seq id no:14所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域进一步包括cd28跨膜结构域(例如，seq id no:15)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括4-1bb胞质结构域(例如，seq id no:17)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以具有与seq id no:17所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域具有seq id no:17所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域进一步包括4-1bb跨膜结构域(例如，seq id no:18)。
[0228]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括cd28胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括4-1bb胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括icos胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括cd27胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括ox40胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括dap10胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括2b4胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括cd30胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括cd2胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括light胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一
结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括gitr胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括tlr胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括dr3胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括cd43胞质结构域。所述cd40l的受体结合片段可以为cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，所述第一结构域包括全长cd40l。酸。在一些实施方案中，所述第一结构域包括全长cd40l。
[0229]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为
40l.28.40l.40l(seq id no:93)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:93所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:93所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:93所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:93所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:93所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:93所示序列相同的氨基酸序列。
[0230]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为tricd40l_8-28(seq id no:199)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:199所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:199所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:199所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:199所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:199所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:199所示序列相同的氨基酸序列。
[0231]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为tricd40l_28-28(seq id no:201)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:201示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:201所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:201所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:201所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:201所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:201所示序列相同的氨基酸序列。
[0232]
如本领域普通技术人员所理解的，本发明所示例的融合蛋白中的cd40l功能片段或全长cd40l可以用本发明所公开的或本领域其他已知的apc激活受体的不同配体替换，包括例如cd80配体(例如，cd28或ctla-4)的胞外结构域或其全长、cd86配体(例如，cd28或ctla-4)、cd91配体(例如，rap1)、dec-205配体或dc-sign配体(例如，icam2、icam3、cd18或ceacam1)。如本领域普通技术人员所理解的，本发明所例示的融合蛋白中的cd28胞质结构域可以用本发明所公开的或本领域其他已知的免疫效应细胞的不同共刺激因子的胞质结构域替换，包括例如，4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3
或cd43的胞质结构域；或4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3或cd43的不同功能片段，所述功能片段保留全长蛋白的激活免疫效应细胞的功能。5.2.3.2示例性laco-stim(2):apc激活受体配体 结合共刺激受体的抗体(例如，acd28-cd40l)
[0233]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc的激活受体的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述第二结构域包括结合免疫效应细胞的共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的c-末端连接到第二结构域的n-末端。在一些实施方案中第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白是基于抗体的可溶性蛋白。
[0234]
在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白的两个结构域通过三聚基序连接。在一些实施方案中，连接子为一种三聚基序，其选自由t4纤维蛋白三聚基序、异亮氨酸拉链、gcn4ii基序、matrilin-1基序和xv型胶原三聚基序组成的群组。在一些实施方案中，连接子为t4纤维蛋白三聚基序(例如，seq id no：1)。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子为异亮氨酸拉链(例如，seq id no：2或3)。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:3所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子为gcn4ii基序(例如，seq id no：4或5)。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:4所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:5所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子为matrilin-1基序(例如，seq id no：6或7)。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:6所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接子为xv型胶原三聚基序(例如，seq id no：8)。在一些实施方案中，连接子具有seq id no:8所示的氨基酸序列。
[0235]
在一些实施方案中，第一结构域包括结合apc激活受体的配体或其受体结合片段，所述apc激活受体选自由cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd40l的胞外结构域(例如，seq id no：12)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有与seq id no:12所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域具有seq id no:12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括全长cd40l。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有与seq id no:9所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域具有seq id no:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l或其功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l胞外结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。
[0236]
在一些实施方案中，所述第二结构域包括结合免疫效应细胞的共刺激受体的抗体
或其抗原结合片段，其中所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗4-1bb抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗icos抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗cd27抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗ox40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗dap10抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗2b4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗cd30抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗cd2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗light抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗gitr抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗tlr抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗dr3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括抗cd43抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，cd40l的受体结合片段可以具有cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。
[0237]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有包括cd40l或其受体结合片段的第一结构域和包括抗cd28抗体或其抗原结合片段的第二结构域。所述抗cd28抗体或抗原结合片段可以是本发明公开的或本领域其他已知的可激活cd28信号传递的任何抗cd28抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗cd28抗体或抗原结合片段为标记为1412的抗体。在一些实施方案中，抗cd28抗体或其抗原结合片段具有：(a)具有seq id no:73所示氨基酸序列的vh；和/或(b)具有seq id no:74所示氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，所述抗cd28抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:72所示氨基酸序列的抗cd28 scfv。
[0238]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为1412-t4-cd40l(seq id no:94)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:94所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:94所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:94所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:94所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:94所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:94所示序列相同的氨基酸序列。
[0239]
如本领域普通技术人员所理解的，本发明示例的融合蛋白中cd40l胞外结构域可以用本发明公开的或本领域其他已知的apc激活受体的不同配体的胞外结构域或受体结合片段替换，包括例如cd80配体(例如，cd28或ctla-4)、cd86配体(例如，cd28或ctla-4)、cd91配体(例如，rap1)、dec-205配体或dc-sign配体(例如，icam2、icam3、cd18或ceacam1)的胞外结构域或受体结合结构域。如本领域普通技术人员所理解的，本发明所示例的融合蛋白中的抗cd28抗体或抗原结合片段可以用本发明所公开的或本领域其他已知的结合和激活免疫效应细胞不同共刺激因子的抗体或抗原结合片段替换，包括例如结合4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3或cd43的抗体或抗原结合片段。5.2.3.3示例性laco-stim(3):apc激活受体的抗体 共刺激受体的抗体(例如，acd40/acd28双特异性ab)
[0240]
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体。如本发明所用和如本领域所理解的，“双特异性抗体”是指对至少两个不同的抗原表位具有结合特异性的抗体。所述表位可以来自同一抗原，也可以来自两个不同的抗原。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc的激活受体的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述第二结构域包括结合免疫效应细胞的共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明公开的双特异性抗体具有对(1)apc(例如，树突状细胞)的激活受体和(2)免疫效应细胞(例如，t细胞)的共刺激受体的结合特异性。在一些实施方案中，第一结构域的c-末端连接到第二结构域的n-末端。在一
些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。
[0241]
在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域通过连接子连接。所述连接子可以为柔性连接子或刚性连接子。在一些实施方案中，所述连接子具有(ggggs)n，n＝1、2、3、4或5(seq id no:215)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有(eaaak)n，n＝1、2、3、4或5(seq id no:216)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有(pa)np，n＝1、2、3、4或5(seq id no:217)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有gsggggsggggsggggs(seq id no:219)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接子具有ggggs(seq id no:218)的氨基酸序列。
[0242]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白为双特异性抗体，其包括结合apc的激活受体的第一结构域或其抗原结合片段，和结合免疫效应细胞的共刺激受体抗体或其抗原结合片段的第二结构域。在一些实施方案中，第一结构域包括结合cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第二结构域包括结合cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3或cd43的抗体或其抗原结合片段。
[0243]
在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗4-1bb抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗icos抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗cd27抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗ox40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗dap10抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗2b4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗cd30抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗cd2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗light抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗gitr抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗tlr抗体或其抗原结合片段。在
一些实施方案中，本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗dr3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中本发明提供了包括第一结构域和第二结构域的双特异性抗体，所述第一结构域为抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括抗cd43抗体或其抗原结合片段。
[0244]
制备双特异性抗体的方法为本领域已知。例如，可以利用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达重组生产双特异性抗体。参见，例如milstein等，(1983)nature 305:537-39。或者，可以使用化学连接来制备双特异性抗体。参见，例如brennan等，(1985)science 229:81。双特异性抗体包括双特异性抗原结合片段。参见，例如holliger等，(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-48；gruber et al.(1994)j.immunol.152:5368。制备双特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见milstein和cuello,nature305:537(1983)，wo 93/08829，和traunecker等，embo j.10:3655(1991))，和“knob-in-hole”工程(参见例如，美国专利5,731,168)。多特异性抗体也可以通过以下方式制备：制备抗体fc-异源二聚化分子的工程化静电转向效应(wo2009/089004a1)；交联两个或多个抗体或片段(参见，例如，美国专利4,676,980，和brennan等，science 229:81(1985))；用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如kostelny等，j.immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用“diabody”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))；和使用单链fv(scfv)二聚体(参见例如，gruber等，j.immunol.,152:5368(1994))；以及如，例如在tutt et al.j.immunol.147:60(1991)中所述制备双特异性抗体。含有三个或更多个功能抗原结合位点的工程抗体，包括“章鱼抗体”(octopus antibodies)，也包括于此(参见，例如，us2006/0025576a1)。双特异性抗体也可以通过连接两个不同的抗体或其部分来构建。例如，双特异性抗体可以包括来自两种不同的抗体的fab、f(ab')2、fab'、scfv和sdab。
[0245]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段。所述抗cd40抗体或抗原结合片段可以是本发明公开的或本领域其他已知的，可以激活cd40信号转导的任何抗cd40抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括如上表a中所提供的标记为f2.103、f5.157、f5.77、4d11、a40c或119的抗体。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段具有vh和vl，所述vh和vl分别具有：(1)seq id no:76和77所示序列；(2)seq id no:79和80所示序列；(3)seq id no:82和83所示序列；(4)seq id no:85和86所示序列；(5)seq id no:88和89所示序列；或(6)seq id no:91和92所示序列。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:78所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:81所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:84所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:87所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:90所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。
[0246]
在一些实施方案中，抗cd28抗体或抗原结合片段可以是本发明公开的或本领域其他已知的激活cd28信号传导的任何抗cd28抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，抗
cd28抗体或抗原结合片段是标记为1412的抗体。在一些实施方案中，抗cd28抗体或其抗原结合片段具有(a)具有seq id no:73所示氨基酸序列的vh；和/或(b)具有seq id no:74所示氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，抗cd28抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:72所示氨基酸序列的抗cd28 scfv。
id no:97所示序列相同的氨基酸序列。
[0250]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为1412-4d11(seq id no:211)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:211所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:211所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:211所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:211所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:211所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:211所示序列相同的氨基酸序列。
[0251]
如本领域普通技术人员所理解，本发明所示例的融合蛋白中的抗cd40抗体或其抗原结合片段可被本发明公开的或本领域其他已知的结合不同apc激活受体的抗体或抗原结合片段替换，包括例如cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign。如本领域普通技术人员所理解，本发明所示例的融合蛋白中的抗cd28抗体或抗原结合片段可被与本发明所公开的或本领域其他已知的结合免疫效应细胞的不同共刺激因子的抗体或抗原结合片段所取代，包括例如与4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3或cd43结合的抗体或抗原结合片段。5.2.3.4示例性laco-stim(4):激活受体的抗体 共刺激受体(例如，acd40-cd28；acd40-4-1bb)
[0252]
在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc的激活受体的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激受体或其功能片段。在一些实施方案中，第一结构域的c-末端连接到第二结构域的n-末端。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。在一些实施方案中，本发明提供了基于抗体的膜融合蛋白。
[0253]
在一些实施方案中，第一和第二结构域通过cd8铰链、cd28铰链或igg fc区连接。在一些实施方案中，第一和第二结构域通过cd8铰链连接。在一些实施方案中，所述cd8铰链具有seq id no:69所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二结构域通过cd28铰链连接。在一些实施方案中，所述cd28铰链具有seq id no:70所示的氨基酸序列。在一些实施例中，第一和第二结构域通过igg fc区连接。在一些实施方案中，所述igg fc区具有seq id no:71的氨基酸序列。
[0254]
在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc的激活受体的抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括结合免疫效应细胞的共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段。所述抗cd40抗体或抗原结合片段可以是本发明公开的或本领域其他已知的激活cd40信
号传导的任何抗cd40抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括如上表a中提供的标记为f2.103、f5.157、f5.77、4d11、a40c或119的抗体。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段具有vh和vl，所述vh和vl分别具有(1)seq id no:76和77所示序列；(2)seq id no:79和80所示序列；(3)seq id no:82和83所示序列；(4)seq id no:85和86所示序列；(5)seq id no:88和89所示序列；或(6)seq id no:91和92所示序列。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:75所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:78所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗d40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:81所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:84所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:87所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:90所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。
[0255]
在一些实施方案中，所述第二结构域包括共刺激受体或其功能片段，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，所述第二结构域包括共刺激受体的胞质结构域，所述共刺激受体选自由cd28、4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括cd28胞质结构域(例如，seq id no：14)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以具有与seq id no:14所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域具有seq id no:14所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域进一步包括cd28跨膜结构域(例如，seq id no：15)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域包括4-1bb胞质结构域(例如，seq id no：17)。在一些实施方案中，文提供的融合蛋白的第二结构域可以具有与seq id no:17所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域具有seq id no:17所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域进一步包括4-1bb跨膜结构域(例如，seq id no：18)。
[0256]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括cd28胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括4-1bb胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括icos胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括cd27胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括ox40胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一
结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括dap10胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括2b4胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括cd30胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括cd2胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括light胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括gitr胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括tlr胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括dr3胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括cd43胞质结构域。在一些实施方案中，所述第一结构域包括全长cd40l。
[0257]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白进一步包括跨膜区。在一些实施方案中，所述跨膜区来源于相同的共刺激受体。在一些实施方案中，所述跨膜区来源于不同的共刺激受体。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括cd28跨膜区和cd28胞质结构域。在一些实施方案中，所述第二结构域进一步包括。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括4-1bb跨膜区和4-1bb胞质结构域。
[0258]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为f2.103.cd28(seq id no:98)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:98所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本
发明提供的融合蛋白具有与seq id no:98所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:98所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:98所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:98所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:98所示序列相同的氨基酸序列。
[0259]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为f5.157.cd28(seq id no:99)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:99所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:99所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:99所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:99所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:99所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:99所示序列相同的氨基酸序列。
[0260]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为f5.77.cd28(seq id no:100)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:100所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:100所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:100所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:100所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:100所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:100所示序列相同的氨基酸序列。
[0261]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为f2.103.bb(seq id no:101)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:101所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:101所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:101所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:101所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:101所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:101所示序列相同的氨基酸序列。
[0262]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为f5.157.bb(seq id no:102)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:102所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:102所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:102所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:102所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:102所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:102所示序列相同的氨基酸序列。
[0263]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为f5.77.bb(seq id no:103)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:103所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:103所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:103所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:103所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:103所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:103所示序列相同的氨基酸序列。
[0264]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为4d11.cd28(seq id no:104)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:104所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:104所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:104所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:104所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:104所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:104所示序列相同的氨基酸序列。
[0265]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为a40c.cd28(seq id no:105)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:105所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:105所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一
些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:105所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:105所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:105所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:105所示序列相同的氨基酸序列。
[0266]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有的氨基酸序列与标记为119.cd28(seq id no:106)的融合蛋白的序列具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:106所示序列至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:106所示序列至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:106所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:106所示序列至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:106所示序列至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白具有与seq id no:106所示序列相同的氨基酸序列。
[0267]
如本领域普通技术人员所理解的，本发明所示例的融合蛋白中的抗cd40抗体或其抗原结合片段可以被本发明公开的或本领域其他已知的结合和激活apc不同激活受体的抗体或抗原结合片段所替代，包括例如cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign。如本领域普通技术人员所理解的，本发明所示例的融合蛋白中的cd28胞质结构域或4-1bb胞质结构域可以用本发明公开的或本领域其他已知的免疫效应细胞的不同共刺激因子的胞质结构域替换，包括例如icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3或cd43的胞质结构域；或4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3或cd43的不同功能片段，所述功能片段保留全长蛋白的激活免疫效应细胞的功能。5.2.3.5示例性laco-stim(5):apc激活受体的抗体 共刺激受体的配体(例如，acd40-cd80；acd40-cd86)。
[0268]
在一些实施方案中，本发明所提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第一结构域包括结合抗原提呈细胞的激活受体的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的c-末端连接到第二结构域的n-末端。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。在一些实施方案中，本发明提供了基于抗体的可溶性融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了基于抗体的可溶性融合蛋白。
[0269]
在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd40的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd80的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd86的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合cd91的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一结构域包括结合dec-205的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所
述第一结构域包括结合dc-sign的抗体或其抗原结合片段。所述抗体和抗原结合片段可以为本发明公开的或本领域其他已知的任何抗体或抗原结合片段。
[0270]
在一些实施方案中，本发明所提供得融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc激活受体的抗体或其抗原结合片段，所述第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，第一结构域包括结合cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第二结构域包括选自由cd58、cd70、cd83、cd80、cd86、cd137l、cd252、cd275、cd54、cd49a、cd112、cd150、cd155、cd265、cd270、tl1a、cd127、il-4r、gitr-l、tim-4、cd153、cd48、cd160、cd200r和cd44组成得群组的配体，或其受体结合片段。
[0271]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括抗cd40抗体或其抗原结合片段。所述抗cd40抗体或抗原结合片段可以是本发明公开的或本领域其他已知的激活cd40信号传导的任何抗cd40抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段包括如上表a中提供的标记为为f2.103、f5.157、f5.77、4d11、a40c或119的抗体。在一些实施方案中，抗cd40抗体或其抗原结合片段具有vh和vl，所述vh和vl分别具有(1)seq id no:76和77所示序列；(2)seq id no:79和80所示序列；(3)seq id no:82和83所示序列；(4)seq id no:85和86所示序列；(5)seq id no:88和89所示序列；或(6)seq id no:91和92所示序列。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:75所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:78所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗d40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:81所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:84所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:87所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。在一些实施方案中，所述抗cd40抗体或其抗原结合片段包括具有seq id no:90所示氨基酸序列的抗cd40 scfv。
[0272]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，所述第二结构域包括配体及其受体结合片段，所述配体选自由cd58、cd70、cd83、cd80、cd86、cd137l、cd252、cd275、cd54、cd49a、cd112、cd150、cd155、cd265、cd270、tl1a、cd127、il-4r、gitr-l、tim-4、cd153、cd48、cd160、cd200r、cd44组成的群组。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd58(例如，seq id no:178)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd70(例如，seq id no:179)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd83(例如，seq id no:180)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd80(例如，seq id no:54)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd86(例如，seq id no:57)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合
cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd137l(例如，seq id no:181)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd252(例如，seq id no:182)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd275(例如，seq id no:183)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd54(例如，seq id no:184)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd49a(例如，seq id no:185)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd112(例如，seq id no:186)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或其抗原结合片段，第二结构域包括cd150(例如，seq id no:187)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd155(例如，seq id no:188)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd265(例如，seq id no:189)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd270(例如，seq id no:190)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域，其包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括tl1a(例如，seq id no:191)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd127(例如，seq id no:192)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括il-4r(例如，seq id no:193)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域，其包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括gitr-l(例如，seq id no:194)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括tim-4(例如，seq id no:195)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd153(例如，seq id no:196)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd48(例如，seq id no:53)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd160(例如，seq id no:49)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或抗原结合片段，第二结构域包括cd200r(例如，seq id no:197)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40的抗体或其抗原结合片段，第二结构域包括cd44(例如，seq id no:198)或其受体结合片段。本领域普通技术人员可以容易地确定配体合适的受体结合片段，所述受体结合
片段保持其对受体的结合亲和力并具有激活受体的功能。
[0273]
如本领域普通技术人员所理解的，本发明所示例的融合蛋白中的抗cd40抗体或其抗原结合片段可被本发明公开的或本领域其他已知的结合apc的不同激活受体的抗体或抗原结合片段所替换，包括例如cd80、cd86、cd91、dec-205或dc-sign。5.2.3.6示例性laco-stim(6):apc激活受体的配体 共刺激配体(例如，cd40l-cd86；cd40l-cd80)
[0274]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域，其中所述第一结构域包括结合apc的激活受体的配体或其受体结合片段，并且其中所述第二结构域包括免疫效应细胞的共刺激配体或其受体结合片段。在一些实施方案中，第一结构域的c-末端连接到第二结构域的n-末端。在一些实施方案中，第一结构域的n-末端连接到第二结构域的c-末端。
[0275]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括结合激活受体的配体或其功能片段，所述激活受体选自由cd40、cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign组成的群组，所述第二结构域包括共刺激配体或其受体结合片段，所述共刺激配体选自由cd58、cd70、cd83、cd80、cd86、cd137l、cd252、cd275、cd54、cd49a、cd112、cd150、cd155、cd265、cd270、tl1a、cd127、il-4r、gitr-l、tim-4、cd153、cd48、cd160、cd200r、cd44组成的群组。
[0276]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括cd40l的胞外结构域(例如，seq id no：12)。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有与seq id no:12所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域具有seq id no:12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括全长cd40l。在一些实施方案中，在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有与seq id no:9所示序列有至少85％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域具有seq id no:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域可以具有cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l或其功能片段。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l胞外结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第一结构域包括三个拷贝的cd40l(seq id no:9)的119-261位氨基酸。
[0277]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，所述第二结构域包括配体或其受体结合片段，所述配体选自由cd58、cd70、cd83、cd80、cd86、cd137l、cd252、cd275、cd54、cd49a、cd112、cd150、cd155、cd265、cd270、tl1a、cd127、il-4r、gitr-l、tim-4、cd153、cd48、cd160、cd200r、cd44组成的群组。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd58(例如，seq id no:178)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd70(例如，seq id no:179)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第
二结构域包括cd83(例如，seq id no:180)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd80(例如，seq id no:54)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd86(例如，seq id no:57)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd137l(例如，seq id no:181)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd252(例如，seq id no:182)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd275(例如，seq id no:183)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd54(例如，seq id no:184)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd49a(例如，seq id no:185)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd112(例如，seq id no:186)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd150(例如，seq id no:187)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd155(例如，seq id no:188)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd265(例如，seq id no:189)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd270(例如，seq id no:190)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括tl1a(例如，seq id no:191)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd127(例如，seq id no:192)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括il-4r(例如，seq id no:193)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括gitr-l(例如，seq id no:194)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括tim-4(例如，seq id no:195)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd153(例如，seq id no:196)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd48(例如，seq id no:53)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd160(例如，seq id no:49)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构
域，第一结构域包括cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd200r(例如，seq id no:197)或其受体结合片段。在一些实施方案中，融合蛋白包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括结合cd40l或其受体结合片段，第二结构域包括cd44(例如，seq id no:198)或其受体结合片段。本领域普通技术人员可以容易地确定配体合适的受体结合片段，所述受体结合片段保持其对受体的结合亲和力并具有激活受体的功能。
[0278]
如本领域普通技术人员所理解，本发明所示例的融合蛋白中的cd40l或其受体结合片段可以用本发明公开的或本领域已其他已知的apc激活受体的不同配体替换，包括例如cd80配体(例如，cd28或ctla-4)、cd86配体(例如，cd28或ctla-4)、cd91配体(例如，rap1)、dec-205配体或dc-sign配体(例如，icam2、icam3、cd18或ceacam1)的胞外结构域或全长配体。5.3多核苷酸与载体
[0279]
在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”含有：只包括所述多肽的编码序列的多核苷酸；以及包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为rna的形式或dna的形式。rna可以为信使rna(mrna)。dna包括cdna、基因组dna和合成dna；并且可以为双链或单链，如果为单链，可以是编码链或非编码(反义)链。
[0280]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有选自seq id no:93-106所示氨基酸序列的多肽。还提供了与编码选自seq id no:93-106所示氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，杂交是在本领域技术人员已知的高度严紧条件下进行的。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:93所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:94所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:95所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:96所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:97所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:211所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:98所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:99所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:100所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:101所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:102所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:103所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:104所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:105所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸编码具有seq id no:106所示氨基酸序列的多肽。
[0281]
本发明还提供了本发明所述多核苷酸的变体，其中所述变体编码，例如，本发明所述融合蛋白的片段、类似物和/或衍生物。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与本发明所述融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多
肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为40l.28.40l.40l(seq id no:93)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为1412-t4-cd40l(seq id no:94)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为1412-f2.103(seq id no:95)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为1412-f5.157(seq id no:96)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为1412-4d11(seq id no:211)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为1412-f5.77(seq id no:97)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为f2.103.cd28(seq id no:98)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为f5.157.cd28(seq id no:99)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为f5.77.cd28(seq id no:100)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为f2.103.bb(seq id no:101)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为f5.157.bb(seq id no:102)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为f5.77.bb(seq id no:103)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为4d11.cd28(seq id no:104)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为a40c.cd28(seq id no:105)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％
同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸，其编码与标记为119.cd28(seq id no:106)的融合蛋白具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的多肽。
[0282]
如本发明所用，短语“具有与多核苷酸至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸”是指，除了参考序列的每100个核苷酸中最多可以包括5个点突变，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，要获得序列与参考核苷酸序列有至少95％同一性的多核苷酸，参考序列中最多5％的核苷酸可以被删除或用其他核苷酸替换，或者可以将参考序列中占总核苷酸数量最多5％的核苷酸插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位点或这些末端位点之间的任何地方，个别地穿插在参考序列中的核苷酸之间或在参考序列中的一个或多个连续基团中。
[0283]
多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者处包含改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失的改变，但不改变编码多肽的性质或活性。在一些实施方案中，多核苷酸变体包括导致多肽的氨基酸序列不改变的沉默替换(由于遗传密码子的简并)。多核苷酸变体的产生有多种原因，例如，优化特定宿主的密码子表达(例如。将人类mrna中的密码子改变为各个适合细菌宿主的密码子，例如大肠杆菌)。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包括至少一个沉默突变。
[0284]
如果需要，本发明提供的多核苷酸可以进行密码子优化，以提高融合蛋白在给定细胞中的表达效率。密码子优化可用于在给定细胞中实现更高水平的表达。参与蛋白表达不同阶段的因素包括密码子适应性、mrna结构以及转录和翻译中的各种顺式元件。本领域技术人员已知的任何合适的密码子优化方法或技术可用于修饰本发明提供的多核苷酸。这种密码子优化方法是众所周知的，包括商业上可用的密码子优化服务，例如，optimumgene
tm
(genscript；piscataway,nj)、encor optimization(encor biotechnology；gainseville fl)、blue heron(blue heron biotech；bothell,wa)等。可选地，多个密码子优化可以基于不同的算法进行，优化结果混合以生成编码多肽的密码子得到优化的多核苷酸。
[0285]
在一些实施方案中，制备多核苷酸变体以调节或改变编码多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，制备多核苷酸变体以增加编码多肽的表达。在一些实施方案中，制备多核苷酸变体以减少编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体增加了编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体降低了编码多肽的表达。
[0286]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列选自由seq id no:132-145所示序列组成的群组。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与选自由seq id nos:132-145组成的群组的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。本发明还提供一种多核苷酸，其与具有选自由seq id nos:132-145所示序列组成的群组的核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，所述杂交是在本领域技术人员已知的高度严谨条件下进行的。
[0287]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:
132所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:132所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:132所示核苷酸序列。
[0288]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:133所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:133所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:133所示核苷酸序列。
[0289]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:134所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:134所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:134所示核苷酸序列。
[0290]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:135所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:135所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:135所示核苷酸序列。
[0291]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:136所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:136所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:136所示核苷酸序列。
[0292]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:137所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:137所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:137所示核苷酸序列。
[0293]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:138所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:138所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:138所示核苷酸序列。
[0294]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:139所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:139所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:139所示核苷酸序列。
[0295]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:140所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:140所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:140所示核苷酸序列。
[0296]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:141所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:141所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:141所示核苷酸序列。
[0297]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:142所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:142所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:142所示核苷酸序列。
[0298]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:143所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:143所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:143所示核苷酸序列。
[0299]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:144所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:144所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:144所示核苷酸序列。
[0300]
在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有的核苷酸序列与seq id no:145所示序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸与具有seq id no:145所示核苷酸序列的多核苷酸杂交。在一些实施方案中，本发明所提供的多核苷酸具有seq id no:145所示核苷酸序列。
[0301]
在一些实施方案中，多核苷酸包括融合蛋白的编码序列，该编码序列在同一阅读框中与有助于来自宿主细胞的多肽的表达和分泌的多核苷酸(例如，作为控制多肽转运的分泌序列的前导序列)融合。所述多肽可以具有被宿主细胞切割的先导序列，以形成“成熟的”多肽形式。
[0302]
在一些实施方案中，多核苷酸包括融合蛋白的编码序列，该编码序列在同一阅读框中与标记或标签序列融合。例如，在一些实施方案中，所述标记序列为六-组氨酸标签(his-tag)，其使与标记融合的多肽高效纯化。在一些实施方案中，当使用哺乳动物宿主(例如，cos-7细胞)时，所述标记序列为源自流感血凝素蛋白的血凝素(ha)标签。在一些实施方案中，所述标记序列为flag
tm
标签。在一些实施方案中，标记可与其他标记或标签结合使用。
[0303]
在一些实施方案中，多核苷酸为分离的。在一些实施方案中，多核苷酸为基本纯化的。
[0304]
还提供了包含本发明所述多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方案中，表达载体包括编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包括表达载体，所述表达载体包括编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸。所述载体可以为病毒载体。在一个实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体，例如，γ逆转录病毒载体，其用于将本发明所述的多核苷酸引入靶细胞。所述载体可以为慢病毒载体。所述载体可以为腺病毒载体。所述载体可以为腺相关病毒载体。在一些实施方案中，所述载体和构建体可选地设计成包括报告基因。
[0305]
本发明提供了包括本发明所述融合蛋白的细胞。本发明还提供了包括编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，所述细胞产生本发明所述的融合蛋白。5.4对免疫效应细胞进行基因工程改造
[0306]
本发明提供了重组表达本发明所述的融合蛋白的对免疫效应细胞进行基因工程改造。本发明还提供了包括本发明所述的多核苷酸的基因工程细胞。在一些实施方案中，本发明还提供了包括本发明所述的载体的基因工程细胞。
[0307]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造选自由t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和粒细胞组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的细胞是t细胞。在一些实施方案中，本发明提供的细胞是nk细胞。在一些实施方案中，本发明提供的细胞是nkt细胞。在一些实施方案中，本发明提供的细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，本发明提供的细胞是中性粒细胞。在一些实施方案中，本发明提供的细胞是粒细胞。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造是分离的。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造是基本纯化的。
[0308]
在一些实施方案中，本发明提供的免疫效应细胞是t细胞。t细胞可以是细胞毒性t细胞，辅助t细胞，或者γδt,cd4 /cd8 双阳性t细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞、cd4/cd8双阴性t细胞、cd3 t细胞、初始t细胞、效应t细胞、细胞毒性t细胞、辅助t细胞、记忆性t细胞、调节t细胞、th0细胞、th1细胞、th2细胞、th3(treg)细胞、th9细胞、th17细胞、thαβ辅助细胞、tfh细胞、干细胞样中心记忆性tscm细胞、中枢记忆tcm细胞、效应记忆tem细胞、效应记忆temra细胞或者γδt细胞。在一些实施方案中，t细胞是细胞毒性t细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程t细胞是分离的。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程t细胞是基本纯化的。
[0309]
在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于从受试者分离的细胞。如本发明所用，来源于源细胞的基因工程细胞是指通过获取源细胞并对源细胞进行基因操作而获得的基因工程细胞。源细胞可以来自自然源。例如，源细胞可以是从受试者中分离出来的初级细胞。受试者可以是动物或人。源细胞也可以是在体外经过传代或基因操作的细胞。
[0310]
在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于从人体分离的细胞。免疫效应细胞(例如，t细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用本领域中可用的t细胞系。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于从
外周血分离的细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于从骨髓分离的细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于从外周血单核细胞(pbmc)分离的细胞。
[0311]
在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于干细胞或祖细胞体外分化的细胞。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞选自由t细胞祖细胞、造血干/祖细胞、造血多能祖细胞、胚胎干细胞和诱导多能细胞组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于t细胞祖细胞体外分化的细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于造血干/祖细胞体外分化的细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于造血多能祖细胞体外分化的细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于胚胎干细胞体外分化的细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞来源于诱导多能细胞体外分化的细胞。
[0312]
在一些实施方案中，本发明提供了本发明公开的基因工程细胞群。细胞群可以是同源性细胞群。细胞群可以是异质化细胞群。在一些实施方案中，细胞群可以是包括本发明公开的细胞的任何组合的异质化细胞群。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于肿瘤浸润淋巴细胞(til)。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于外周血淋巴细胞(pbl)。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于肿瘤浸润淋巴细胞(til)。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于骨髓浸润淋巴细胞(mils)。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于细胞因子诱导杀伤细胞(cik)。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞群来源于淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)。
[0313]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步重组表达嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)或双特异性t细胞接合子(bite)。在一些实施方案中，本发明公开的基因工程细胞进一步表达car。在一些实施方案中，本发明公开的基因工程细胞进一步表达tcr。在一些实施方案中，本发明公开的基因工程细胞进一步表达bite。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造还包括编码car、tcr或bite(car/tcr/bite)的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造还包括编码car的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造还包括编码tcr的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步包含编码bite的多核苷酸。在一些实施方案中，car、tcr或bite结合肿瘤抗原或病毒抗原。
[0314]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造包括编码本发明公开的融合蛋白的第一多核苷酸和编码car、tcr或bite(car/tcr/bite)的第二多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造包括多核苷酸，该多核苷酸具有编码本发明公开的融合蛋白的第一片段和编码car、tcr或bite(car/tcr/bite)的第二片段。第一片段和第二片段可以通过编码连接子的核苷酸序列连接。所述连接子可以是自裂解连接体。在一些实施方案中，第一和第二片段由编码2a肽的核苷酸序列连接。在一些实施方案中，2a连接子是p2a肽(seq id no:220)。在一些实施方案中，连接子是t2a肽(seq id no:221)。在一些实施方案中，连接子是e2a肽(seq id no:222)。在一些实施
方案中，连接子是f2a肽(seq id no:223)。在一些实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其包括编码本发明提供的融合蛋白的第一片段和编码car/tcr/bite的第二片段，其中第一和第二片段由编码f2a肽的核苷酸序列(seq id no:223)连接。在一些实施方案中，第一片段(编码融合蛋白)位于第二片段(编码car/tcr/bite)的5'端。在一些实施方案中，第一片段(编码融合蛋白)位于第二片段(编码car/tcr/bite)的3'端。
[0315]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步表达car或包含编码car的多核苷酸。car可以是本发明公开的任何car或本领域中已知的任何car。在一些实施方案中，car包括特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。因此，在一些实施方案中，本发明还提供了表达本发明公开的融合蛋白和car的基因工程细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码融合蛋白的第一片段和编码car的第二片段。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞包括编码本发明提供的融合蛋白的第一多核苷酸和编码car的第二多核苷酸。
[0316]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步表达tcr或包含编码tcr的多核苷酸。tcr可以是本发明公开的任何tcr或本领域中已知的任何tcr。在一些实施方案中，tcr包括特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。因此，在一些实施方案中，本发明还提供了表达本发明公开的融合蛋白和tcr的基因工程细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码融合蛋白的第一片段和编码tcr的第二片段。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞包括编码融合蛋白的第一多核苷酸和编码tcr的第二多核苷酸。
[0317]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步表达bite或包含编码bite的多核苷酸。bite可以是本发明公开的任何bite或本领域中已知的任何bite。在一些实施方案中，bite包括特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域。因此，在一些实施方案中，本发明还提供了表达本发明公开的融合蛋白和bite的基因工程细胞。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码融合蛋白的第一片段和编码bite的第二片段。在一些实施方案中，本发明提供的基因工程细胞包括编码融合蛋白的第一多核苷酸和编码bite的第二多核苷酸。
[0318]
在一些实施方案中，本发明提供的car、tcr或bite包括结合抗原的靶结合结构域。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，病毒抗原是ebv。在一些实施方案中，病毒抗原是hpv。在一些实施方案中，病毒抗原是hiv。应当理解的是，这些或其他病毒抗原可被用于本发明公开的car、tcr或bite靶向作用。
[0319]
在一些实施方案中，本发明提供的car、tcr或bite包括结合癌抗原或肿瘤抗原的靶结合结构域。任何合适的癌抗原或肿瘤抗原可以基于待治疗的受试者(癌症患者)表现出的癌症类型来进行选择。应当理解的是，所选择的癌抗原以使得该癌抗原可结合的方式进行表达。通常，表达car、tcr或bite的细胞所靶向的癌抗原在癌症细胞的细胞表面上表达。然而，应当理解的是，任何可结合的癌抗原都适合靶向作用。
[0320]
合适的抗原包括但不限于b细胞成熟抗原(bcma)、间皮素(msln)、前列腺特异性膜抗原(psma)、前列腺干细胞抗原(psca)、碳酸酐酶ix(caix)、癌胚抗原(cea)、cd5、cd7、cd10、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd70、cd74、cd123、
cd133、cd138、cd33、cd200r、甲胎蛋白(afp)、b7h3、b7h4、il3ra2、cs1、c-met、ber-ep4(epcam-1)、上皮糖蛋白2(egp-2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞黏附分子(epcam)、叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体-α和β(frα和β)，神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人表皮生长因子受体2(her-2/erb2)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体viii(egfrviii)，erb3，erb4，gdnf家族受体α4(gfra4)，组蛋白3变体(h3.3)，人端粒酶逆转录酶(htert)，白细胞介素-13受体α-2亚基(il-13rα2)、κ-轻链，激酶插入结构域受体(kdr)，lewis a(ca19.9)，lewis y(ley)，l1细胞黏附分子(llcam)，黑色素瘤相关抗原1(黑色素瘤抗原家族a1，mage-a1)，mage-a3，粘蛋白16(muc-16)，粘蛋白1(muc-1)，tn-muc1,nkg2d配体，癌-睾丸抗原ny-eso-1，癌胚胎抗原(h5t4)，肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)，血管内皮生长因子r(vegf
·
r)，肾母细胞瘤蛋白(wt-1)、1型酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ror1)、b7-h3(cd276)、b7-h6(nkp30)、硫酸软骨素蛋白聚糖-4(cspg4)、dnax辅助分子(dnam-1)、ephrin a型受体2(epha2)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、gp100/hla-a2、glypican3(gpc3)、ha-1h、herk-v、il-11rα、潜伏膜蛋白1(lmp1)、mag3、神经细胞黏附分子(n-cam/cd56)、ny-eso-1、黑色素-a(mart1)、pd-l1、wt1转录因子(wt1)、p53、kras、tcrb1、tcrb2和trail受体(trail r)。应当理解的是，这些或其他癌抗原可被用于本发明公开的car、tcr或bite的靶向作用。
[0321]
此外，本领域中认识到，基于细胞的免疫系统经常对作为可导致恶性转化的dna损伤产生的结果的新抗原做出反应，并且新抗原的识别可以是细胞治疗(例如，过继性t细胞治疗)的临床活性的重要驱动因素。(例如，schumacher,science 348.6230(2015):69-74.schumacher et al.,annual review of immunology 37(2019):173-200.)新抗原的鉴定可以通过使用经典方法针对常见共同的突变(例如，突变braf、kras和p53)，也可以通过使用下一代测序技术。(例如，lu,yong-chen,and paul f.robbins.seminars in immunology.vol.28.no.1.academic press,2016.)在一些实施方案中，本发明提供的car、tcr或bite包括结合癌新抗原或肿瘤新抗原的靶结合结构域。
[0322]
在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造还包括编码结合癌抗原或肿瘤抗原的car、tcr或bite的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步重组表达结合癌抗原或肿瘤抗原的car、tcr或bite。在一些实施方案中，所述癌抗原或肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是her2。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是ny-eso-1。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是cd19。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是cd20。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是cd22。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是psma。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是c-met。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是gpc3。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是il13ra2。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是egfr。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是cd123。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是cd7。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是gd2。在一些实施方案中，癌抗原或肿瘤抗原是psca。在一些实施方案中，癌抗原
398(2013))。因此，car设计可以将抗原识别和信号转导结合起来，这两种功能在生理上由两个独立的复合物(tcr异源二聚体和cd3复合物)承担。“第二代”cars包括来自各种共刺激受体的胞内结构域，例如cd28、4-1bb、icos、ox40等，位于car的胞质尾部以向细胞提供额外的信号。“第二代”cars既提供共刺激(例如，通过cd28或4-1bb结构域)，又提供激活(例如,通过cd3ζ信号传导结构域)。研究表明，“第二代”cars可提高t细胞的抗肿瘤活性。“第三代”cars提供多种共刺激(例如，通过同时包含cd28和4-1bb的结构域)，以及激活(例如,通过包含cd3δ激活结构域)。
[0327]
如上所述，car还包含在表达car的免疫效应细胞中起作用的信号传导结构域。这样的信号传导结构域可以，例如，来源于cdζ、fc受体γ、fcγriia、fcrβ(fcεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10或dap12。一般而言，信号传导结构域将在转导的免疫效应细胞(如t细胞)中诱导持久性、转运和/或效应功能(sharpe et al.,dis.model mech.8:337-350(2015)；finney et al.,j.immunol.161:2791-2797(1998)；krause et al.,j.exp.med.188:619-626(1998))。在cdζ或fc受体γ的情况下，所述信号传导结构域对应于相应多肽的胞内结构域，或对应于足以进行信号传导的胞内结构域片段。下面更详细地描述示例性信号传导结构域。
[0328]
在某些非限制性实施方案中，car的胞内结构域可进一步包括至少一个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，car的胞内结构域可以包括两个共刺激信号传导结构域。这样的共刺激信号传导结构域可以提供免疫效应细胞的增强激活。共刺激信号传导结构域可源自于cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap10多肽、2b4多肽、cd27多肽、cd30多肽、cd40多肽等。先前已经描述了包含胞内结构域的cars，该胞内结构域包含含有4-1bb、icos或dap-10的共刺激信号传导区(参见u.s.7,446,190，其通过引用并入本发明，其还描述了4-1bb、icos和dap-10的代表性序列)。在一些实施方案中，car的胞内结构域可以包括共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包括两个共刺激受体，例如，cd28和4-1bb(参见sadelain et al.,cancer discov.3(4):388-398(2013))，或cd28和ox40，或本发明公开的其他共刺激配体的组合。
[0329]
car的胞外结构域可与引导新生蛋白进入内质网并随后转运到细胞表面的先导肽或信号肽融合。应当理解的是，一旦含有信号肽的多肽在细胞表面表达，在内质网中的多肽加工和移位到细胞表面期间，信号肽通常已经被蛋白水解去除。因此，多肽，例如car，通常在细胞表面以缺乏信号肽的成熟蛋白形式表达，即使多肽的前体形式包括信号肽。如果car要糖基化和/或锚定在细胞膜上，信号肽或先导可能是必不可少的。信号序列或先导序列是一种肽序列，通常存在于新合成蛋白质的n端，指导它们进入分泌途径。该信号肽作为融合蛋白共价连接到car的胞外抗原结合结构域的n-端。如本领域所熟知的，任何合适的信号肽都可以应用于car，以在免疫细胞中提供细胞表面表达(参见gierasch biochem.28:923-930(1989)；von heijne,j.mol.biol.184(1):99
–
105(1985))。特别有用的信号肽可以来源于在本发明提供的免疫细胞中自然表达的细胞表面蛋白，包括本发明公开的多肽中的任何一种信号肽。因此，任何合适的信号肽可以用于引导car在本发明提供的免疫效应细胞的细胞表面表达。
[0330]
在某些非限制性实施方案中，car还可以包括将car的结构域相互连接的间隔子或
序列。例如，间隔子可以被包括在信号肽和抗原结合结构域之间、在抗原结合结构域和跨膜结构域之间、在跨膜结构域和胞内结构域之间、和/或在胞内结构域内的结构域之间，例如在刺激结构域和共刺激结构域之间。间隔子可以足够灵活以允许各种结构域与其他多肽的相互作用，例如，允许抗原结合结构域在方向上具有灵活性以促进抗原识别。间隔子可以是，例如，来自igg的铰链区、免疫球蛋白的ch2ch3(恒定)区域，和/或cd3的部分(分化簇3)或适合作为间隔子的某些其他序列。
[0331]
car的跨膜结构域通常包括跨越至少一部分膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。抗原识别后，受体聚集并将信号传递到细胞。在一个实施方案中，car的跨膜结构域可来源于免疫效应细胞中自然表达的另一种多肽。在一个实施方案中，car具有来源于cd8,cd28,cd3ζ,cd4,4-1bb,ox40,icos,ctla-4,pd-1,lag-3,2b4,btla,t-cell receptor(tcr)α链,tcrβ链,or tcrδ链,cd28,cd3ε,cd45,cd5,cd8,cd9,cd16,cd22,cd33,cd37,cd64,cd80,cd86,cd134,cd137,cd154,或免疫效应细胞中表达的其他多肽的跨膜结构域。或者，跨膜结构域可以是人工合成的，在这种情况下，它主要包括疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。任选地，跨膜结构域可以来源于免疫效应细胞中非自然表达的多肽，只要跨膜结构域能够将信号从结合在car的抗原转导到胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以在每一端包括苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接子，优选长度在2至10个氨基酸之间，可以在car的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸偶联物提供了特别合适的连接子。
[0332]
cd3ζ。在非限制性实施方案中，car可包括源自cd3ζ多肽的信号传导结构域，例如源自cd3ζ胞内结构域的信号传导结构域，其可激活或刺激免疫效应细胞，例如t细胞。cd3ζ包含3个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itams)，并在抗原结合后将激活信号传递给细胞，例如淋巴系的细胞，如t细胞。cd3ζ多肽可以具有与genbank no.np_932170(np_932170.1，gi:37595565；见下文)的序列相对应的氨基酸序列，或其片段。在一个实施方案中，cd3ζ多肽具有以下提供的cd3ζ多肽序列的氨基酸52至164的氨基酸序列，或其足以用于信号传导活性片段。示例性car具有包含cd3ζ多肽的胞内结构域，所述cd3ζ多肽包含以下提供的cd3ζ多肽序列的氨基酸52至164。另一示例性car具有包含cd3ζ多肽的胞内结构域，所述cd3ζ多肽包含以下提供的cd3δ多肽的氨基酸52至164。再一个示例性car具有包含cd3ζ多肽的胞内结构域，所述cd3ζ多肽包含以下提供的cd3ζ多肽的氨基酸52至164。参见genbank np_932170以参考cd3ζ内的域，如信号肽、氨基酸1-21等，胞外结构域，氨基酸22～30；跨膜结构域，氨基酸31～51；胞内结构域，氨基酸52-164。
[0333]
fcrγigg受体fcγrs的激活类型形成多聚体复合物，该多聚体复合物包括fc受体γ链(fcrγ)，该链含有细胞内酪氨酸激活基序(itam)，其激活触发活性氧迸发、细胞因子释放、吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和脱颗粒。在一个实施方案中，car可包括源自fcrγ的跨膜结构域。在一个实施方案中，car可包括源自fcrγ的共刺激结构域。fcrγ多肽可以具有与下文提供的ncbi参考序列：np_004097.1(gi:4758344)相对应的氨基酸序
列，或其片段。在一个实施方案中，car可以具有包含fcrγ胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施方案中，car可以具有fcrγ或其片段的跨膜结构域。可以理解的是，“fcrγ多核苷酸”是指编码fcrγ多肽的多核苷酸。
[0334]
dap10。dap10又称造血细胞信号转导子，是与造血细胞受体家族密切相关的信号传导亚基。在一些实施方案中，本发明提供了包含激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域的融合蛋白，其中第二结构域包含dap10多肽或其功能片段。在一些实施方案中，第二结构域包括dap10的胞质结构域。在一些实施方案中，本发明提供了包含激活apc的第一结构域和激活免疫效应细胞的第二结构域的融合蛋白，其中第二结构域包含结合dap10的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括源自dap10的共刺激结构域。dap10多肽可以具有与下面提供的genbank no.np055081.1(gi:15826850)的序列对应的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，本发明提供的融合蛋白的第二结构域可以包括共刺激结构域，该共刺激结构域包括对应于氨基酸70至93或其功能片段的dap10的胞质结构域(下面序列中下划线部分，seq id no:29)。可以理解的是，如果需要，可以将短于或长于特定描述结构域的dap10序列包括在融合蛋白中。
[0335]
dap12。dap12存在于髓系细胞中，例如巨噬细胞和粒细胞，在这些细胞中，例如，dap12与髓系细胞成员(trem)上表达的触发受体和mdl1(髓系dap12-相关凝集素1/clec5a)相关，两者都参与对抗病原体(如病毒和细菌)的炎症反应。在淋巴系细胞中，dap12在nk细胞中表达，并分别与激活受体(如c型凝集素受体nkg2c)、自然细胞毒性受体nkp44、短尾型kir3ds1和kir2ds1/2/5相关。特别是，ngk2c是用于控制人和小鼠cmv感染的主要的激活nk细胞受体。研究发现，含dap12的car与其ag交联后，在nk细胞中产生足够的激活信号。et al.,j immunol 194:3201-12(2015)。在一个实施方案中，car可包括源自dap12的共刺激结构域。dap10多肽可以具有与下面提供的genbank no.aad09437.1(gi:2905996)序列或其片段对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，car可以具有包括dap12的胞内结构域或其片段的信号传导结构域。在另一个实施方案中，car可以具有dap12或其片段的跨膜结构域。可以理解的是，“dap12多核苷酸”是指编码dap12多肽的多核苷酸。
[0336]
cd28。分化簇28(cd28)是在t细胞上表达的蛋白，为t细胞的活化和存活提供共刺激信号。cd28是cd80(b7.1)和cd86(b7.2)蛋白的受体。在一个实施方案中，car可包括源自cd28的共刺激信号传导结构域。例如，如本发明所公开的，car可包括cd28胞内/胞质结构域的至少一部分，如可用作共刺激信号传导结构域的胞内/胞质结构域。cd28多肽可以具有对应于如下所述的具有genbank no.p10747(p10747.1，gi:115973)或np_006130(np_006130.1，gi:5453611)的序列或其片段的氨基酸序列。如果需要，胞内结构域之外的cd28
序列可以包括在本发明的car中。例如，car可以包括cd28多肽的跨膜。在一个实施方案中，car可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含与cd28的氨基酸180至220或其片段(seq id no:14)相对应的cd28的胞内结构域。在另一个实施方案中，car可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含与氨基酸153至179或其片段对应的cd28跨膜结构域。示例性car可包括对应于cd28胞内结构域的共刺激信号传导结构域。示例性car可包括源自于cd28的跨膜结构域。因此，示例性car可以包括来自cd28的两个结构域，共刺激信号传导结构域和跨膜结构域。在一个实施方案中，car具有包括cd28的跨膜结构域和胞内结构域的氨基酸序列，并且car包括cd28的氨基酸153至220。在另一个实施方案中，car包含cd28的氨基酸117至220。具有cd28的跨膜结构域和胞内结构域的另一示例性car是p28z。在一个实施方案中，car可包含源自cd28多肽的跨膜结构域，该cd28多肽包含以下提供的cd28多肽的氨基酸153至179(seq id no:15)。参见genbank np_006130以参考cd28内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至18；胞外结构域，氨基酸19～152；跨膜结构域，氨基酸153～179；胞内结构域，氨基酸180-220。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd28序列可以包括在car中。
[0337]
4-1bb。4-1bb又称肿瘤坏死因子受体超家族成员9，可作为肿瘤坏死因子(tnf)配体，具有刺激活性。在一个实施方案中，car可包括源自4-1bb的共刺激信号传导结构域。4-1bb多肽可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列对应于具有genbank no.p41273(p41273.1，gi:728739)或np_001552(np_001552.2，gi:5730095)或其片段的序列。在一个实施方案中，car可以具有共刺激结构域，该共刺激结构域包括对应于氨基酸214至255或其片段的4-1bb胞内结构域。在另一个实施方案中，car可以具有对应于氨基酸187至213或其片段的4-1bb跨膜结构域。示例性car是mbbz，其具有包含4-1bb多肽(例如，np_001552的氨基酸214至255，seq id no:17)的胞内结构域。参见genbank np_001552以参考4-1bb内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-17；胞外结构域，氨基酸18～186；跨膜结构域，氨基酸187～213(seq id no:18)；胞内结构域，氨基酸214-255(seq id no:17)。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的4-1bb序列可以包括在car中。还可以理解的是，“4-1bb多核苷酸”是指编码4-1bb多肽的多核苷酸。1bb多肽的多核苷酸。
[0338]
ox40。ox40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4前体或cd134，是tnfr-受体超家族的一员。在一个实施方案中，car可包括源自ox40的共刺激信号传导结构域。ox40多肽可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列与下面提供的具有genbank no.p43489(p43489.1，gi:1171933)或np_003318(np_003318.1，gi:4507579)的序列或其片段对应。在一个实施方案
中，car可以具有共刺激结构域，该共刺激结构域包括对应于氨基酸236至277(seq id no:26)或其片段的ox40的胞内结构域。在另一个实施方案中，car可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含对应于ox40的氨基酸215至235(seq id no:27)或其片段的ox40跨膜结构域。参见genbank np_003318以参考ox40内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至28；胞外结构域，氨基酸29～214；跨膜结构域，氨基酸215-235(seq id no:27)；胞内结构域，氨基酸236-277(seq id no:26)。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的ox40序列可以包括在car中。还可以理解的是，“ox40多核苷酸”是指编码ox40多肽的多核苷酸。
[0339]
icos.可诱导t细胞共刺激分子前体(icos)又称cd278，是在活化的t细胞上表达的cd28超家族共刺激受体。在一个实施例中，car可包括源自icos的共刺激信号传导结构域。icos多肽可以具有与下面提供的具有genbank no.np_036224(np_036224.1，gi:15029518)的序列或其片段对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，car可以具有共刺激结构域，该共刺激结构域包括与icos的氨基酸162至199(seq id no:20)相对应的icos胞内结构域。在另一个实施方案中，car可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含与icos的氨基酸141至161(seq id no:21)或其片段相对应的icos跨膜结构域。参见genbank np_036224以的参考icos内的结构域，例如，信号肽，氨基酸1至20；胞外结构域，氨基酸21～140；跨膜结构域，氨基酸141-161(seq id no:21)；胞内结构域，氨基酸162-199(seq id no:20)。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的ico序列可以包括在car中。还可以理解的是，“icos多核苷酸”是指编码icos多肽的多核苷酸。
[0340]
dap10。dap10又称造血细胞信号转导子，是与造血细胞中受体大家族密切相关的信号传导亚基。在一个实施方案中，car可包括源自dap10的共刺激结构域。dap10多肽可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列对应于下面提供的具有genbank no.np_055081.1(gi:15826850)的序列或其片段。在一个实施方案中，car可以具有共刺激结构域，该共刺激结构域包括对应于氨基酸70至93(seq id no:29)或其片段的dap10胞内结构域。在另一个实施方案中，car可以具有对应于氨基酸49至69(seq id no:30)或其片段的dap10跨膜结构域。参见genbank np_055081.1以参考dap10内的结构域，例如信号肽，氨基酸1至19；胞外结构域，氨基酸20～48；跨膜结构域，氨基酸49～69(seq id no:30)；胞内结构域，氨基酸70-93(seq id no:29)。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的dap10序列可以包括在car中。还可以理解的是，“dap10多核苷酸”是指编码dap10多肽的多核苷酸。
[0341]
cd27：cd27(tnfrsf7)是一种跨膜受体，在人cd8 和cd4 t细胞亚群、nkt细胞、nk细胞亚群和造血祖细胞上表达，并在foxp3 cd4t细胞和b细胞亚群中诱导。以前的研究发现，cd27可以在体内主动提供共刺激信号，提高人t细胞存活率和抗肿瘤活性。(参见song and powell；oncoimmunology 1,no.4(2012):547-549)。在一个实施方案中，car可包括源自cd27的共刺激结构域。在一个实施方案中，car可以具有共刺激结构域，该共刺激结构域包括对应于氨基酸213至260(seq id no:23)或其片段的cd2710胞内结构域。在另一个实施方案中，car可具有对应于氨基酸192至212(seq id no:24)或其片段的cd27跨膜结构域。cd27多肽可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列对应于下面提供的具有uniprotkb/swiss-prot no.:p26842.2(gi:269849546)的序列或其片段。
[0342]
在一个实施方案中，car可以具有包含cd27或其片段的胞内结构域的共刺激结构域。在另一个实施方案中，car可以具有cd27的跨膜结构域或其片段。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd27序列可以包括在car中。还可以理解的是，cd27多核苷酸是指编码cd27多肽的多核苷酸。
[0343]
cd30：cd30及其配体(cd30l)分别属于肿瘤坏死因子受体(tnfr)和肿瘤坏死因子(tnf)超家族。cd30在许多方面的行为与ox40相似，并能增强由tcr刺激诱导的增殖和细胞因子的产生。(goronzy and weyand,arthritis research&therapy 10,no.s1(2008):s3.)在一个实施方案中，car可包括源自cd30的共刺激结构域。在一个实施方案中，car可包括源自cd30的共刺激结构域。在一个实施方案中，car可以具有共刺激结构域，该共刺激结构域包括对应于氨基酸407至595(seq id no:32)或其片段的cd30胞内结构域。在另一个实施方案中，car可具有对应于氨基酸386至406(seq id no:33)或其片段的cd30跨膜结构域。cd30多肽可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列对应于下面提供的具有genbank no.:aaa51947.1(gi:180096)的序列或其片段。
[0344]
在一个实施方案中，car可以具有包含cd30胞内结构域或其片段的共刺激结构域。在另一个实施方案中，car可以具有cd30的跨膜结构域或其片段。可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd30序列可以包括在car中。还可以理解的是，cd30多核苷酸是指编码cd30多肽的多核苷酸。
[0345]
cd8。分化簇8(cd8)是跨膜糖蛋白，其作为t细胞受体(tcr)的共受体。cd8与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合，并且对i类mhc蛋白具有特异性。在一个实施方案中，car可包括源自cd8的跨膜结构域。cd8多肽可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列对应于下面提供的具有genbank no.:np_001139345.1(gi:225007536)的序列或其片段。在一个实施方案中，car可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含对应于氨基酸183至203或其片段的cd8跨膜结构域。在一个实施方案中，示例性car具有源自cd8多肽的跨膜结构域。在一个非限制性实施方案中，car可包含跨膜结构域，该跨膜结构域源自包含氨基酸183至203的cd8多肽。此外，car可以包括铰链结构域，该铰链结构域包括下面提供的cd8多肽的氨基酸137-182。在另一个实施方案中，car可以包括下面提供的cd8多肽的氨基酸137-203。在另一个实施方案中，car可以包含以下提供的cd8多肽的氨基酸137至209。参见genbank np_001139345.1以参考cd8内的结构域，例如信号肽，氨基酸1至21；胞外结构域，氨基酸22～182；跨膜结构域氨基酸，183～203；胞内结构域，氨基酸204至235。可以理解的是，如果需要，氨基酸183至203的跨膜结构域之外的cd8附加序列可以包括在car中。进一步可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd8序列可以包括在car中。还可以理解的是，cd8多核苷酸是指编码cd8多肽的多核苷酸。
[0346]
cd4。分化簇4(cd4)又称t细胞表面糖蛋白cd4，是存在于辅助性t细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞表面的糖蛋白。在一个实施方案中，car可包括源自cd4的跨膜结构域。cd4存在多种异构体。可以理解的是，可以选择任何异构体来实现所需的功能。示例性的异构体包括异构体1(np_000607.1，gi:10835167)、异构体2(np_001181943.1，gi:303522479)、异构体3(np_001181944.1，gi:303522485；或np_001181945.1，gi:303522491；或np_001181946.1，gi:303522569)等。下面提供了示例性的异构体序列，即异构体1。在一个实施方案中，car可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含对应于氨基酸397至418或其片段的cd4跨膜结构域。参见genbank np_000607.1以参考cd4内的结构域，例如信号肽，氨基酸1至25；胞外结构域，氨基酸26～396；跨膜结构域氨基酸，397～418；胞内结构域，氨基酸419至458。可以理解，如果需要，氨基酸397至418的跨膜结构域之外的cd4附加序列可以包括在car中。进一步可以理解的是，如果需要，短于或长于特定描述结构域的cd4序列可以包括在car中。还可以理解的是，“cd4多核苷酸”是指编码cd4多肽的多核苷酸。
[0347]
除了t细胞外，car还可以被改造到其他类型的免疫效应细胞，如nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞或粒细胞。在一些实施方案中，工程细胞是nk细胞。本发明提供的car可以将nk细胞重新靶向肿瘤表面抗原(参见例如,hu et al.acta pharmacol sin 39,167
–
176(2018))。car-nk细胞可以使用含有cd3ζ作为胞内信号传导结构域的第一代car构建体或者可以使用与cd3ζ联合表达第二信号传导结构域(如，cd28，4-1bb)的第二代car构建体。一般来说，nk细胞中的第二代cars比第一代cars更活跃。在一些实施方案中，car构建体基于nk细胞的激活特征。例如，已知dnax-激活蛋白12(dap12)能激活nk细胞的信号传导。
[0348]
本发明提供的cars可以包括如上所述的目标结合结构域。在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白可以与靶向肿瘤抗原的car共表达，该肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白与靶向肿瘤抗原的car结合，该肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步包含编码靶向肿瘤抗原的car的多核苷酸，该肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。在一些实施方案中，本发明提供的对免疫效应细胞进行基因工程改造进一步重组表达靶向肿瘤抗原的car，该肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。
[0349]
在一些实施方案中，car靶向her2。在一些实施方案中，靶向her2的car具有seq id no:107的氨基酸序列，所述氨基酸序列可由例如seq id no:146的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向cd19。在一些实施方案中，靶向cd19的car具有seq id no:108的氨基酸序列，其可由例如seq id no:147的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向间皮素。在一些实施方案中，靶向间皮素的car具有seq id no:109的氨基酸序列，其可由例如seq id no:148的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向psma。在一些实施方案中，靶向psma的car具有seq id no:110的氨基酸序列，其可由例如seq id no:149的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向c-met。在一些实施方案中，靶向c-met的car具有seq id no:111的氨基酸序列，其可由例如seq id no:150的核苷酸序列编码。在一些实施方案
中，car靶向bcma。在一些实施方案中，靶向bcma的car具有seq id no:112的氨基酸序列，其可由例如seq id no:151的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，靶向bcma的car具有seq id no:113的氨基酸序列，其可由例如seq id no:152的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，靶向bcma的car具有seq id no:114的氨基酸序列，其可由例如seq id no:153的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向gpc3。在一些实施方案中，靶向gpc3的car具有seq id no:115的氨基酸序列，其可由例如seq id no:154的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向il13ra2。在一些实施方案中，靶向il13ra2的car具有seq id no:116的氨基酸序列。在一些实施方案中，car靶向egfr。在一些实施方案中，靶向egfr的car具有seq id no:117的氨基酸序列，其可由例如seq id no:155的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向cd123。在一些实施方案中，靶向cd123的car具有seq id no:118的氨基酸序列，其可由例如seq id no:157的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向cd7。在一些实施方案中，靶向cd7的car具有seq id no:119的氨基酸序列，其可由例如seq id no:159的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向gd2。在一些实施方案中，靶向gd2的car具有seq id no:120的氨基酸序列，其可由例如seq id no:158的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向psca。在一些实施方案中，靶向psca的car具有seq id no:121的氨基酸序列，其可由例如seq id no:156的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，car靶向cd70。在一些实施方案中，靶向cd70的car具有seq id no:203的氨基酸序列。
[0350]
在一些实施方案中，本发明提供的car包括结合病毒抗原的靶结合结构域。在一些实施方案中，病毒抗原是ebv。在一些实施方案中，病毒抗原是hpv。在一些实施方案中，病毒抗原是hiv。
5.4.2 tcrs
[0351]
本发明提供的融合蛋白可以在本发明提供的基因工程细胞中与tcr共表达或与tcr结合。在一些实施方案中，本发明提供了对免疫效应细胞进行基因工程改造，其重组表达本发明公开的融合蛋白，进一步重组表达tcr。在一些实施方案中，本发明提供了对免疫效应细胞进行基因工程改造，其包括编码本发明公开的融合蛋白的多核苷酸，进一步还包括编码tcr的多核苷酸。
[0352]
t细胞受体(tcrs)是抗原特异性分子，负责识别在apcs表面或任何有核细胞表面的mhc产物的背景下出现的抗原肽。该系统通过其tcrs赋予t细胞识别由细胞表达的整个细胞内抗原阵列(包括病毒蛋白)的潜在能力，这些抗原被加工成短肽，结合到细胞内mhc分子上，并作为肽-mhc复合物传递到表面。该系统允许外源蛋白(如变异的癌抗原或病毒蛋白)或异常表达的蛋白作为t细胞的靶标(例如,davis and bjorkman(1988)nature,334,395-402；davis et al.(1998)annu rev immunol,16,523-544)。
[0353]
tcr和肽-mhc复合物的相互作用可以驱动t细胞进入不同的激活状态，这取决于结合的亲和力(或解离率)。tcr识别过程允许t细胞通过提供多样的tcrs库来区分正常、健康细胞和例如通过病毒或恶性肿瘤转化的细胞，其中很有可能存在一个或多个tcrs，其与结合在mhc分子上的外源肽的结合亲和力高于刺激t细胞活性的阈值(manning and kranz(1999)immunology today,20,417-422)。
[0354]
经体外培养鉴定的从人类或小鼠t细胞克隆中分离出的野生型tcr已被证明具有相对较低的结合亲和力(kd＝1-300μm)(davis et al.(1998)annu rev immunol,16,523-544)。这在一定程度上是因为胸腺内发育的t细胞对自身肽-mhc配体进行了阴性选择(耐受性诱导)，因此使亲和力过高的t细胞被清除。为了补偿这些相对较低的亲和力，t细胞进化出一种共受体系统，其中细胞表面分子cd4和cd8与mhc分子(分别为ii类和i类)结合，并与tcr协同介导信号传导活性。cd8在这一过程中特别有效，允许具有非常低亲和力的tcrs(例如，kd＝300μm)介导强大的抗原特异性活性。
[0355]
定向进化可用于生成对特定肽-mhc复合物具有更高亲和力的tcrs。可以使用的方法包括酵母菌展示(holler et al.(2003)nat immunol,4,55-62；holler et al.(2000)proc natl acad sci u s a,97,5387-92)、噬菌体展示(li et al.(2005)nat biotechnol,23,349-54)和t细胞展示(chervin et al.(2008)j immunol methods,339,175-84)。所有三种方法都涉及改造或修饰表现出野生型tcr的正常、低亲和力的tcr，以增加对同源肽-mhc复合物(t细胞特异性的原始抗原)的亲和力。
[0356]
因此，在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可以在细胞中与tcr共表达。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可以与tcr结合。在一些实施方案中，tcr包括α(α)链和β(β)链。在一些实施方案中，tcr包括γ链(γ)和δ链(δ)。αβ链(或γδ链)的胞外结构域负责抗原识别和接合。抗原结合通过多聚cd3复合物刺激下游信号传导，该复合物以三种二聚体(εγ，εδ，ζζ)的形式与αβ(或γδ)链的胞内结构域相结合。
[0357]
本发明提供的tcrs可以通过基因工程结合特异性抗原。在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白可与靶向细胞中肿瘤抗原的tcr共表达。在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白可以与靶向肿瘤抗原的tcr结合。在一些实施方案中，本发明提供了重组表达融合蛋白和靶向肿瘤抗原的tcr的基因工程细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包括编码融合蛋白的多核苷酸和编码靶向肿瘤抗原的tcr的多核苷酸的基因工程细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。
[0358]
在一些实施方案中，tcr包括靶向ny-eso-1的tcrα链。所述靶向ny-eso-1的tcrα链可以具有seq id no:122的氨基酸序列，其可由例如seq id no:160的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，tcr包括靶向ny-eso-1的tcrβ链。所述靶向ny-eso-1的tcrβ链可以具有seq id no:123的氨基酸序列，其可由例如seq id no:161的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，靶向ny-eso-1的tcr包括tcrα链和tcrβ链。
[0359]
在一些实施方案中，tcr包括靶向ebv16-e7的tcrα链。靶向ebv16-e7的tcrα链可以具有seq id no:125的氨基酸序列。在一些实施方案中，tcr包括靶向ebv16-e7的tcrβ链。所述靶向ebv16-e7的tcrβ链可以具有seq id no:126的氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向ebv16-e7的tcr包括tcrα链和tcrβ链。靶向ebv16-e7的tcr可以具有seq id no:124的氨基酸序列，其可由例如seq id no:162的核苷酸序列编码。
[0360]
在一些实施方案中，tcr包括靶向h3.3的tcrα链。靶向h3.3的tcrα链可以具有seq id no:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，tcr包括靶向h3.3的tcrβ链。靶向h3.3的tcrβ链可以具有seq id no:129的氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向h3.3的tcr包括tcrα链和tcrβ链。靶向h3.3的tcr可以具有seq id no:127的氨基酸序列，其可由例如seq id no:163的核苷酸序列编码。
[0361]
在一些实施方案中，本发明提供的tcr包括结合病毒抗原的靶结合结构域。在一些实施方案中，所述病毒抗原是ebv。在一些实施方案中，所述病毒抗原是hpv。在一些实施方案中，所述病毒抗原是hiv。
5.4.3 bites
[0362]
双特异性t细胞接合子(bites)是与t细胞抗原(如cd3)和肿瘤抗原结合的双特异性抗体。bites已被证明能诱导靶向肿瘤细胞的定向裂解，从而为癌症和其他疾病提供巨大的潜在疗法。本发明提供的融合蛋白可以在本发明提供的基因工程细胞中与bite共表达或与bite结合。在一些实施方案中，本发明提供了对免疫效应细胞进行基因工程改造，其重组
表达本发明公开的融合蛋白，进一步重组表达bite。在一些实施方案中，本发明提供了对免疫效应细胞进行基因工程改造，其包括编码本发明公开的融合蛋白的多核苷酸，进一步还包括编码bites的多核苷酸。
[0363]
bites是与t细胞抗原(如cd3)和肿瘤抗原结合的双特异性抗体。在一些实施方案中，bites结合cd3。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。
[0364]
在一些实施方案中，bites包括结合cd3和cd19的双特异性抗体。结合cd3和cd19的bites可以具有seq id no:130的氨基酸序列，其可由例如seq id no:164的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，bites包括结合cd3和cd19的双特异性抗体。在一些实施方案中，bites包括结合cd3和her2的双特异性抗体。结合cd3和her2的bites可以具有seq id no:224的氨基酸序列，其可由例如seq id no:225的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，bites包括结合cd3和egfrviii的双特异性抗体。结合cd3的egfrviii的bites可以具有seq id no:131的氨基酸序列，其可由例如seq id no:165的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，bites包括结合cd3和间皮素的双特异性抗体。在一些实施方案中，bites包括结合cd3和bcma的双特异性抗体。
[0365]
在一些实施方案中，本发明提供的bites包括结合病毒抗原的靶结合结构域。在一些实施方案中，所述病毒抗原是ebv。在一些实施方案中，所述病毒抗原是hpv。在一些实施方案中，所述病毒抗原是hiv。
5.5制备方法5.5.1多核苷酸与融合蛋白
[0366]
本发明提供的多核苷酸可以使用本领域已知和可用的各种成熟技术中的任何一种来制备、操作和/或表达。可以使用许多载体。载体的例子有质粒、自主复制序列和转座元件。可以使用典型的转座子系统，如睡美人(sleeping beauty)和piggybac，它们可以被稳定地整合到基因组中(例如,ivics et al.,cell,91(4):501
–
510(1997)；et al.,(2007)nucleic acids research.35(12):e87)。其他的示例性载体包括但不限于质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac))、噬菌体(如λ噬菌体或m13噬菌体)和动物病毒。可用作载体的动物病毒种类的例子包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如sv40)。表达载体的例子有用于在哺乳动物细胞中表达的pclneo载体(promega)；用于慢病毒介导的基因转导和在哺乳动物细胞中的表达的plenti4/v5-dest
tm
、plenti6/v5-dest
tm
和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen)。
[0367]
在一些实施方案中，载体是游离载体(episomal vector)或维持在染色体外的载
体。如本发明所使用的，术语“游离”是指能够在不整合到宿主的染色体dna中且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丢失的情况下进行复制的载体，也意味着该载体在染色体外复制或以游离形式进行复制。该载体被改造以包含编码来自淋巴营养疱疹病毒或伽马疱疹病毒、腺病毒、sv40、牛乳头状瘤病毒或酵母的dna复制起点或“ori”的序列，特别是与ebv的orip相对应的淋巴疱疹病毒或γ疱疹病毒的复制起点。在一些实施方案中，淋巴疱疹病毒可以是爱泼斯坦巴尔二氏病毒(ebv)、卡波西肉瘤疱疹病毒(kshv)、松鼠猴疱疹病毒(hs)或马立克氏病病毒(mdv)。爱泼斯坦巴尔二氏病毒(ebv)和卡波西肉瘤疱疹病毒(kshv)也是γ疱疹病毒的例子。通常，宿主细胞包括激活复制的病毒复制反式激活蛋白。
[0368]
表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是指载体的非翻译区(如复制起点、选择试剂、启动子、增强子、翻译起始信号(shine dalgarno序列或kozak序列)内含子、多聚腺苷酸序列、5'和3'非翻译区)，它们与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性各不相同。根据使用的载体系统和宿主，可以使用任意数量的合适的转录和翻译元件，包括普遍存在的启动子和诱导型启动子。
[0369]
可用于本发明的说明性的普遍的表达控制序列包括但不限于巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子，病毒性猴病毒(sv40)启动子(例如，早期或晚期)，莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)ltr启动子，劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr，单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子，来自痘苗病毒的h5、p7.5和p11启动子，延伸因子1-α(ef1a)启动子，早期生长反应因子1(egr1)，铁蛋白h(ferh)，铁蛋白l(ferl)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)，真核细胞翻译起始因子4a1(eif4a1)，热休克70kda蛋白5(hspa5)，热休克蛋白90kdaβ-成员1(hsp90b1)，热休克蛋白70kda(hspa5)，β-驱动蛋白(β-kin)，人rosa 26基因位点(irions et al.,nature biotechnology 25,1477-1482(2007))，泛素c启动子(ubc)，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子和β-肌动蛋白启动子。
[0370]
说明性的诱导型启动子/系统例子包括但不限于类固醇诱导型启动子(例如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因启动子(通过相应激素的处理进行诱导))、金属硫蛋白启动子(通过各种重金属的处理进行诱导)、mx-1启动子(通过干扰素进行诱导)、“基因开关”米非司酮-调控系统(sirin et al.,2003,gene,323:67)，cumate诱导基因开关(wo 2002/088346)，四环素依赖的调控系统，等等。本发明描述的融合蛋白可以通过本领域已知的任何方法制备，包括化学合成和重组表达技术。除非另有说明，本发明的实践采用了分子生物学、微生物学、遗传分析、重组dna、有机化学、生物化学、pcr、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本技术领域内的相关常规技术。这些技术在本发明引用的参考文献中有所描述，并在文献中进行了充分解释。参见，例如，maniatis et al.(1982)molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press；sambrook et al.(1989),molecular cloning:a laboratory manual,second edition,cold spring harbor laboratory press；sambrook et al.(2001)molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny；ausubel et al.,current protocols in molecular biology,john wiley&sons(1987and annual updates)；current protocols in immunology,john wiley&sons(1987and annual updates)gait(ed.)(1984)oligonucleotide synthesis:a practical approach,irl press；eckstein(ed.)(1991)oligonucleotides and analogues:a practical approach,
irl press；birren et al.(eds.)(1999)genome analysis:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press；borrebaeck(ed.)(1995)antibody engineering,second edition,oxford university press；lo(ed.)(2006)antibody engineering:methods and protocols(methods in molecular biology)；vol.248,humana press,inc；其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。
[0371]
本发明描述的融合蛋白可以使用本领域已知的方法制备和分离。肽可以用化学方法全部或部分合成(参见，例如，caruthers(1980).nucleic acids res.symp.ser.215；horn(1980)；and banga,a.k.,therapeutic peptides and proteins,formulation,processing and delivery systems(1995)technomic publishing co.,lancaster,pa)。肽的合成可以使用各种固相技术进行(参见，例如，roberge science 269:202(1995)；merrifield,methods.enzymol.289:3(1997))并且可以实现自动合成，例如，按照制造商的说明使用abi 431a肽合成仪(perkin elmer)。肽也可以使用组合方法合成。人工合成的残基和多肽可以使用本领域已知的各种程序和方法合成(参见，例如，organic syntheses collective volumes,gilman,et al.(eds)john wiley&sons,inc.,ny)。修饰过的多肽可以通过化学修饰方法产生(参见，例如，belousov,nucleic acids res.25:3440(1997)；frenkel,free radic.biol.med.19:373(1995)；and blommers,biochemistry33:7886(1994))。肽序列变异、衍生物、替换和修饰也可以使用寡核苷酸介导(定点)突变、丙氨酸扫描和基于pcr的诱变等方法进行。定点诱变(carter et al.,nucl.acids res.,13:4331(1986)；zoller et al.,nucl.acids res.10:6487(1987))、盒式诱变(wells et al.,gene 34:315(1985))、限制性选择诱变(wells et al.,philos.trans.r.soc.london sera 317:415(1986))以及其他技术可以在克隆的dna上进行，以产生本发明的肽序列、变体、融合和嵌合体以及其变异体、衍生物、替换和修饰。
[0372]
本发明描述的融合蛋白可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤和重组技术，或其组合。在一些实施方案中，重组表达载体用于表达编码本发明描述融合蛋白的多核苷酸。例如，重组表达载体可以是可复制的dna构建体，其包括合成的或cdna衍生的dna片段，所述dna片段编码与源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适转录和/或翻译调控元件可操作相接的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白的编码序列可以连接到这样的表达载体中以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，使用病毒载体。当dna区域在功能上相互联系时，它们就可操作相连起来。例如，如果启动子控制序列的转录，则其与编码序列可操作相连；或者如果核糖体结合位点的位置允许翻译，则其与编码序列可操作相连。在一些实施方案中，拟用于酵母表达系统的结构元件包括先导序列，该先导序列可以使宿主细胞能够在细胞外分泌翻译蛋白。在一些实施方案中，在重组蛋白的表达没有先导或转运序列的情况下，多肽可以包括n-末端蛋氨酸残基。
[0373]
可以使用多种表达宿主/载体的组合。适合表达的宿主细胞包括原核生物、酵母细胞、昆虫细胞或在适当启动子控制下的高等真核细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体，以及蛋白质制备方法，包括抗体制备方法在本领域是众所周知的。对细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pcr1、pbr322、pmb9及其衍生物，以及更广泛宿主范围的质粒，如m13和其他丝状单链dna噬菌体。
[0374]
对真核宿主有用的表达载体包括，例如，包含来自sv40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括但不限于cos-7(来源于猴肾)、l-929(来源于鼠成纤维细胞)、c127(来源于鼠乳腺肿瘤)、3t3(来源于鼠成纤维细胞)、cho(来源于中国仓鼠卵巢)、hela(来源于人宫颈癌)、bhk(来源于仓鼠肾成纤维细胞)、hek-293(来源于人胚肾)细胞系及其变体。哺乳动物表达载体可以包括非转录元件(例如,复制起点)，与待表达基因连接的合适启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼的非转录序列和5'或3'非翻译序列(例如，必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点，以及转录终止序列)。重组蛋白在昆虫细胞培养系统(如杆状病毒)中的表达也为生产正确折叠和生物功能的蛋白提供了强有力的方法。用于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统是本领域技术人员所熟知的。5.5.2抗体和抗原结合片段
[0375]
本发明提供的抗体及其抗原结合片段包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体及其抗原结合片段。
[0376]
抗体制备方法是本领域众所周知的。参见，例如，harlow et al.,antibodies:a laboratory manual,(cold spring harbor laboratory press,2nd ed.1988)；hammerling et al.,in:monoclonal antibodies and t-cell hybridomas 563 681(elsevier,n.y.,1981),其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。对于在人体体内使用的抗体，使用人抗体可能更可取。完全地人抗体对于人类受试者的治疗性治疗是特别需要的。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。同样，参见，u.s.pat.nos.4,444,887and 4,716,111；and pct publications wo 98/46645,wo 98/50433,wo 98/24893,wo98/16654,wo 96/34096,wo 96/33735,and wo 91/10741；其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。人抗体也可以是一种抗体，其中重链和轻链由源自一种或多种人dna来源的核苷酸序列编码。
[0377]
人抗体也可以用转基因小鼠生产，这些小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞。另外，除了人的重链和轻链基因外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区可被导入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组的方式单独或同时导入人免疫球蛋白基因位点，使其失去功能。例如，据描述，嵌合体和种系突变小鼠中抗体重链连接区(jh)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将修饰后的胚胎干细胞扩增并微量注射到囊胚中以产生嵌合体小鼠。然后培育嵌合体小鼠以产生表达人抗体的纯合子后代。用选定的抗原(例如，本发明全部或部分的多肽)以正常方式免疫转基因小鼠。例如，使用常规杂交瘤技术，可以从免疫的转基因小鼠中获得针对人cd19抗原的抗cd19抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在b细胞分化过程中发生重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这样的技术，可以生产治疗上有用的igg、iga、igm和ige抗体，包括但不限于igg1(γ1)和igg3。关于生产人抗体的该技术概述，参见lonberg and huszar(int.rev.immunol.,13:65-93(1995))。关于生产人抗体和人单克隆抗体的技术的详细讨论，以及生产这种抗体的方案参见，例如，pct publication nos.wo 98/24893,wo 96/34096,and wo 96/33735；and u.s.pat.nos.5,413,923；5,625,
126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。此外，abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(jose,calif.)可以使用上述技术相似的方法提供针对选定抗原的人抗体。关于在种系突变小鼠中转导人种系免疫球蛋白基因阵列的具体讨论参见，例如jakobovits et al.,proc.natl.acad.sci.usa,90:2551(1993)；jakobovits et al.,nature,362:255-258(1993)；bruggermann et al.,year in immunol.,7:33(1993)；and duchosal et al.,nature,355:258(1992)，该基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体。
[0378]
人抗体也可以从噬菌体展示库中获得(hoogenboom et al.,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks et al.,j.mol.biol.,222:581-597(1991)；vaughan et al.,nature biotech.,14:309(1996))。噬菌体展示技术(mccafferty et al.,nature,348:552-553(1990))可用于在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(v)区基因库中生产人抗体和抗体片段。根据这项技术，抗体v区基因被克隆到丝状噬菌体的主或次要外壳蛋白基因的框架中，如m13或fd，并在噬菌体颗粒表面显示为功能抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链dna的拷贝，基于抗体功能性的选择也会导致对编码具有这些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了b细胞的某些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；有关他们的综述参见，例如，johnson and chiswell,current opinion in structural biology 3:564-571(1993)。几种来源的v基因片段可用于噬菌体展示。clackson et al.,nature,352:624-628(1991)从自未免疫小鼠的脾衍生的v基因小型随机组合文库分离了一批不同的抗噁唑酮抗体。可以从未免疫的人供体构建v基因库，并且可以通过marks et al.,j.mol.biol.,222:581-597(1991),or griffith et al.,embo j.,12:725-734(1993)中描述的方法来分离出针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体。也可参照，u.s.pat.nos.5,565,332and 5,573,905,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。
[0379]
人抗体也可以由体外激活的b细胞产生(参见，u.s.pat.nos.5,567,610and5,229,275,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明)。人抗体也可以使用杂交瘤技术在体外生成，例如但不限于roder et al.(methods enzymol.,121:140-167(1986))描述的技术。
[0380]
或者，在一些实施方案中，非人抗体被人源化，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人体内自然产生的抗体的相似性。在一些实施方案中，抗原结合结构域部分是人源化的。
[0381]
人源化抗体可以使用本领域已知的各种技术生产，包括但不限于cdr-移植(参见，例如，european patent no.ep 239,400；international publication no.wo 91/09967；and u.s.pat.nos.5,225,539,5,530,101,and 5,585,089,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明)、镶饰法(veneering)或表面重塑法(resurfacing)(参见，例如，european patent nos.ep 592,106and ep519,596；padlan,1991,molecular immunology,28(4/5):489-498；studnicka et al.,1994,protein engineering,7(6):805-814；and roguska et al.,1994,pnas,91:969-973,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明)、链改组(参见，例如，u.s.pat.no.5,565,332,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明)和例如u.s.patent application publication no.us2005/0042664,u.s.patent application publication no.us2005/0048617,u.s.pat.no.6,407,213,u.s.pat.no.5,766,886,
international publication no.wo 9317105,tan et al.,j.immunol.,169:1119-25(2002),caldas et al.,protein eng.,13(5):353-60(2000),morea et al.,methods,20(3):267-79(2000),baca et al.,j.biol.chem.,272(16):10678-84(1997),roguska et al.,protein eng.,9(10):895-904(1996),couto et al.,cancer res.,55(23supp):5973s-5977s(1995),couto et al.,cancer res.,55(8):1717-22(1995),sandhu j s,gene,150(2):409-10(1994),and pedersen et al.,j.mol.biol.,235(3):959-73(1994)中披露的技术,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。通常，框架区中的框架残基可以被来自cdr供体抗体的相应残基取代，以改变，优选地改善抗原结合。通过本领域公知的方法来识别这些框架替换，例如，通过模拟cdr与框架残基的相互作用来识别对抗原结合重要的框架残基，并通过序列比较来识别特定位置上异常的框架残基。(参见，例如，queen et al.,u.s.pat.no.5,585,089；and riechmann et al.,1988,nature,332:323,其中的每一项通过引用将其全部并入本发明。)
[0382]
人源化抗体具有一个或多个从非人源性来源引入的氨基酸残基。这些非人源性氨基酸残基通常被称为”输入”残基，该”输入”残基通常取自”输入”可变区。因此，人源化抗体包括一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的cdr和来自人的框架区。抗体的人源化在本领域是众所周知的，基本上可以按照winter和其同事的方法进行(jones et al.,nature,321:522-525(1986)；riechmann et al.,nature,332:323-327(1988)；verhoeyen et al.,science,239:1534-1536(1988))，用啮齿动物的cdr或cdr序列替代人抗体的相应序列，即cdr-移植(ep 239,400；pct publication no.wo 91/09967；and u.s.pat.nos.4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640,其内容在此通过引用全部并入本发明)。在这种人源化嵌合抗体中，明显少于完整人可变结构域被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化抗体是典型的人抗体，其中一些cdr残基和可能的一些fr残基被啮齿类动物的抗体中类似位点的残基取代。抗体的人源化也可通过镶饰法(veneering)或表面重塑法(resurfacing)(ep 592,106；ep 519,596；padlan,1991,molecular immunology,28(4/5):489-498；studnicka et al.,protein engineering,7(6):805-814(1994)和roguska et al.,pnas,91:969-973(1994))或者链改组(u.s.pat.no.5,565,332)实现，其内容在此通过引用全部并入本发明。
[0383]
在制备人源化抗体时，选择人可变结构域(包括轻链和重链)是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳匹配”方法，针对整个已知的人可变区序列库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后将最接近啮齿类动物序列的人的序列作为人源化抗体的人框架(fr)(sims et al.,j.immunol.,151:2296(1993)；chothia et al.,j.mol.biol.,196:901(1987),其内容在此通过引用全部并入本发明)。另一种方法使用来源于特定轻链或重链亚组的全部人抗体共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(carter et al.,proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta et al.,j.immunol.,151:2623(1993),其内容在此通过引用全部并入本发明)。
[0384]
抗体可以人源化，并保留对目标抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。例如，人源化抗体可以通过分析亲本序列以及使用亲本序列和人源化序列的三维模型的各种概念性人源化产品来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可用的，并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可以说明和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查
这些展示物允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方法，能够选择并且从受体和输入序列组合fr残基使得实现所需要的抗体特征，例如对靶抗原的增强的亲和力。通常而言，cdr残基直接并且最基本地涉及对抗原结合的影响。
[0385]“人源化”抗体保留了与原始抗体相似的抗原特异性，例如结合人cd40抗原的能力。然而，使用某些人源化方法，可以使用“定向进化”方法来提高抗体与特定抗原结合的亲和力和/或特异性，该方法描述于wu et al.,j.mol.biol.,294:151(1999)，其内容在此通过引用全部并入本发明。5.5.3基因工程免疫效应细胞
[0386]
在一些实施方案中，本发明提供了重组表达本发明公开的融合蛋白的基因工程免疫效应细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码本发明公开的融合蛋白的多核苷酸的基因工程免疫效应细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含载体的基因工程免疫效应细胞，该载体包含编码本发明公开的融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了重组表达本发明公开的融合蛋白和car、tcr或bite(car/tcr/bite)的基因工程免疫效应细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含编码本发明公开的融合蛋白和car/tcr/bite的多核苷酸的基因工程免疫效应细胞。5.5.3.1基因工程方法
[0387]
关于产生重组表达本发明公开的融合蛋白的细胞，使用合适的表达载体将编码融合蛋白的一个或多个多核苷酸引入靶细胞。靶免疫效应细胞(例如，t细胞)被转入一个或多个编码融合蛋白，或编码car/tcr/bite和融合蛋白的多核苷酸。根据需要，编码car/tcr/bite和融合蛋白的多核苷酸可以在单独的载体上，也可以在同一载体上。例如，本发明公开的编码car或融合蛋白的多核苷酸可以克隆到合适的载体中，例如病毒载体，并使用众所周知的分子生物学技术导入靶细胞(参见ausubel et al.,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md(1999))。任何适合于在细胞中表达的载体，特别是在人细胞中表达的载体都可以使用。所述载体含有合适的表达元件，例如在靶细胞中提供编码核酸表达的启动子。以逆转录病毒载体为例，可选择性地将细胞激活以提高转导效率(参见parente-pereira et al.,j.biol.methods 1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；movassagh et al.,hum.gene ther.11:1189-1200(2000)；rettig et al.,mol.ther.8:29-41(2003)；agarwal et al.,j.virol.72:3720-3728(1998)；pollok et al.,hum.gene ther.10:2221-2236(1998)；quinn et al.,hum.gene ther.9:1457-1467(1998)；也可参见市售的方法，如dynabeads
tm
人t细胞激活剂产品，thermo fisher scientific,waltham,ma)。
[0388]
在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒或慢病毒载体，其用于将融合蛋白和/或car、tcr或bite引入靶细胞。为了对细胞进行基因修饰以表达融合蛋白和/或car、tcr或bite，可以使用逆转录病毒载体进行转导。然而，应当理解的是，任何合适的病毒载体或非病毒递送系统均可以使用。逆转录病毒载体和适当的包装细胞系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将对感染人细胞起作用。已知各种产生兼向性病毒(amphotropic virus)的细胞系，包括但不限于pa12(miller et al.,mol.cell.biol.5:431-437(1985))；pa317(miller et al.,mol.cell.biol.6:2895-2902(1986))；和crip
(danos et al.,proc.natl.acad.sci.usa85:6460-6464(1988))。非兼向性颗粒也适用，例如，用vsvg、rd114或galv包膜和本领域已知的任何其他假型颗粒(relander et al.,mol.therap.11:452-459(2005))。可能的转导方法还包括细胞与生产细胞直接共培养(例如,bregni et al.,blood 80:1418-1422(1992))或单独与病毒上清液或浓缩载体原液(有或者没有合适的生长因子或者聚阳离子下)培养(参见，例如，xu et al.,exp.hemat.22:223-230(1994)；hughes,et al.j.clin.invest.89:1817-1824(1992))。
[0389]
可使用的其他病毒载体包括，例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒衍生载体或疱疹病毒，如爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(参见，例如，miller,hum.gene ther.1(1):5-14(1990)；friedman,science 244:1275-1281(1989)；eglitis et al.,biotechniques6:608-614(1988)；tolstoshev et al.,current opin.biotechnol.1:55-61(1990)；sharp,lancet337:1277-1278(1991)；cornetta et al.,prog.nucleic acid res.mol.biol.36:311-322(1989)；anderson,science 226:401-409(1984)；moen,blood cells 17:407-416(1991)；miller et al.,biotechnology 7:980-990(1989)；le gal la salle et al.,science 259:988-990(1993)；and johnson,chest 107:77s-83s(1995))。逆转录病毒载体发展得很好，并已被用于临床(rosenberg et al.,n.engl.j.med.323:370(1990)；anderson et al.,u.s.pat.no.5,399,346)。通常，选择的载体表现出高的感染效率以及稳定的整合和表达(参见，例如，cayouette et al.,human gene therapy8:423-430(1997)；kido et al.,current eye research 15:833-844(1996)；bloomer et al.,j.virol.71:6641-6649(1997)；naldini et al.,science 272:263-267(1996)；and miyoshi et al.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:10319-10323(1997))。
[0390]
用于表达本发明公开的融合蛋白和/或car/tcr/bite的特别有用的载体包括已用于人类基因治疗的载体。在一个非限制性实施方案中，载体是逆转录病毒载体。使用逆转录病毒载体在t细胞或其他免疫效应细胞(包括工程t细胞)中表达已被描述(参见scholler et al.,sci.transl.med.4:132-153(2012；parente-pereira et al.,j.biol.methods 1(2):e7(1-9)(2014)；lamers et al.,blood 117(1):72-82(2011)；reviere et al.,proc.natl.acad.sci.usa 92:6733-6737(1995))。在一个实施方案中，该载体是sgf逆转录病毒载体，例如sgfγ-逆转录病毒载体，其是基于moloney鼠白血病的逆转录病毒载体。sgf载体在前面已经描述过(参见，例如，wang et al.,gene therapy 15:1454-1459(2008))。
[0391]
本发明所用的载体采用合适的启动子在特定宿主细胞中表达。该启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方案中，表达载体的启动子在干细胞(例如造血干细胞)中提供表达。在一些实施方案中，表达载体的启动子在免疫效应细胞(例如t细胞)中提供表达。非病毒载体也可以使用，只要载体含有适合在靶细胞中表达的表达元件。有些载体，如逆转录病毒载体，可以整合到宿主基因组中。
[0392]
在一些实施方案中，本发明提供了通过使用非病毒递送系统将本发明提供的多核苷酸转移到免疫效应细胞中以对免疫效应细胞进行基因工程改造的方法。例如，将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、粒子轰击法、显微注射法、电穿孔法等。在一些实施方案中，可采用rna电穿孔法(van driessche et al.folia histochemica et cytobiologica 43:4 213-216(2005))。在一些实施方案中，可以使用dna转染和转座子。在一些实施方案中，使用了sleeping beauty系统或piggybac系统(例
如，ivics et al.,cell,91(4):501-510(1997)；et al.(2007)nucleic acids research.35(12):e87)。将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子配合物、纳米胶囊、微球、微珠和脂质系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
[0393]
在一些实施方案中，本发明提供了通过使用基因编辑将本发明提供的多核苷酸转移到免疫效应细胞中以对免疫效应细胞进行基因工程改造的方法。如果需要，可以使用诸如核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(talens)、锌指核酸酶(zfns)、规律成簇间隔短回文重复序列(crisprs)、同源重组、非同源末端连接、微同源介导的末端连接、同源介导的末端连接等技术来实现定点整合(gersbach et al.,nucl.acids res.39:7868-7878(2011)；vasileva,et al.cell death dis.6:e1831.(jul 23 2015)；sontheimer,hum.gene ther.26(7):413-424(2015)；yao et al.cell research volume 27,801-814(2017))。在一些实施方案中，本发明提供的方法使用zfn系统。锌指核酸酶由dna识别结构域和非特异性核酸内切酶组成。dna识别结构域由一系列串联的cys2-his2锌指蛋白组成，每个锌指单元包含约30个氨基酸用于与dna特异性结合。非特异性核酸内切酶是foki内切酶，其形成二聚体来切割dna。在一些实施方案中，本发明提供的方法使用talen系统。talen是转录激活因子样效应物核酸酶。tale蛋白是dna结合域的核心成分，通常由多个串联的基本重复单元组成。所设计和组合的系列单元可以特异性识别dna序列，并通过耦合foki核酸内切酶来切割特定的dna序列。
[0394]
在一些实施方案中，本发明提供的方法使用crispr-cas系统。crispr-cas系统可以是crispr-cas9系统。crispr/cas系统是核酸酶系统，其由规律成簇间隔短回文重复序列(crispr)和crispr结合蛋白(即cas蛋白)组成，它可以切割真核生物细胞中几乎所有与原型间隔区相邻基序(pam)相邻的基因组序列(cong et al.science 2013.339:819-823)。“crispr/cas系统”被用来统称涉及crispr相关(“cas”)基因的转录本，以及涉及其表达或指导其活性的其他元件，包括编码cas基因的序列、tracr(反式激活的crispr)序列(例如，tracrrna或活性部分tracrrna)、tracr配对序列(在内源性crispr系统的背景中，覆盖“直接重复”和加工的部分直接重复)、引导序列或来自crispr位点和转录本的其他序列。一般来说，crispr系统的特征是在靶序列的位点促进crispr复合物的形成的元件(在内源性crispr系统中也称为前间隔区)。cas蛋白的不受限制的例子包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4同系物，或其修饰形式。在一些实施方案中，cas蛋白是cas9蛋白(gasiunas,barrangou et al.2012；jinek,chylinski et al.2012；deltcheva,chylinski et al.2011；makarova,grishin et al.(2006))。cas9蛋白的氨基酸序列是本领域已知的。示例序列可以被找到，例如，在swissprot数据库中，登录号为q99zw2，在uniprot数据库中，登录号为a1iq68、q03lf7或j7rua5。
[0395]
载体和构建体可以选择地设计为包括报告子。例如，所述载体可被设计为表达报告蛋白，该报告蛋白可用于识别包含所述载体或所述载体上提供的多核苷酸(例如，已整合到宿主染色体中的多核苷酸)的细胞。在一个实施方案中，报告子可与融合蛋白或car/tcr/
bite作为双顺反子或多顺反子表达构建体表达。示例性报告蛋白包括但不限于荧光蛋白，例如mcherry、绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)以及黄色荧光蛋白(例如yfp、citrine、venus和ypet)。
[0396]
可以使用常规分子生物学技术来测定本发明公开的融合蛋白或car/tcr/bite的转导效率。如果在构建体中包含了标记物(例如荧光蛋白)，则可以通过facs分析来监测基因转移效率，以量化转导的(例如gfp

)免疫效应细胞(如t细胞)的比例，和/或通过定量pcr监测基因转移效率。使用成熟的共培养系统(gade et al.,cancer res.65:9080-9088(2005)；gong et al.,neoplasia 1:123-127(1999)；latouche et al.,nat.biotechnol.18:405-409(2000))，可以确定表达癌抗原的成纤维细胞aapcs(与对照相比)是否引导从转导的免疫效应细胞(如表达car的t细胞(il-2、il-4、il-10、ifn-γ、tnf-α和gm-csf的细胞上清液luminex(austin tx)试验))释放细胞因子，t细胞增殖(通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记)和t细胞存活(通过annexin v染色))。可以评价cd80和/或4-1bbl对t细胞存活、增殖和功效的影响。t细胞可暴露于癌抗原阳性靶细胞的重复刺激，并可确定t细胞增殖和细胞因子应答是随重复刺激保持相似还是减弱。癌抗原car构建体可以在等效试验条件下进行并排比较。可以使用铬释放试验进行多种e：t比值的细胞毒性试验。
[0397]
本发明描述的或本领域其他已知的各种方法的组合和排列被明确地考虑以制备本发明所公开的基因工程细胞。5.5.3.2免疫效应细胞来源
[0398]
本发明提供的免疫效应细胞可从受试者获得。本发明提供的免疫效应细胞来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或其他来源的造血细胞。免疫效应细胞(例如，t细胞)可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用本领域中可用的细胞系。本发明提供的免疫效应细胞可以通过本领域众所周知的方法分离，包括市售的分离方法(参见，例如，rowland-jones et al.,lymphocytes:a practical approach,oxford university press,new york(1999))。先前已经描述了用于分离免疫效应细胞的各种方法，并且可以使用包括但不限于，使用外周供体淋巴细胞(sadelain et al.,nat.rev.cancer 3:35-45(2003)；morgan et al.,science 314:126-129(2006))和选择性使用在体外扩增的抗原特异性外周血淋巴细胞，其使用人工抗原提呈细胞(aapcs)或树突状细胞(dupont et al.,cancer res.65:5417-5427(2005)；papanicolaou et al.,blood 102:2498-2505(2003))。
[0399]
在某些实施方案中，本发明公开的免疫效应细胞(例如，t细胞)可以使用本领域技术人员已知的任何技术(例如ficoll
tm
分离)从受试者处采集的血液单位中获得。在一些实施方案中，通过单采获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，通过单采收集的细胞可以被洗涤以除去血浆部分并将细胞放置在适当的缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐溶液(pbs)洗涤。在另一个实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在不存在钙的情况下，初始激活步骤导致放大激活。如本领域的普通技术人员容易理解
的，可以通过本领域技术人员已知的方法来完成洗涤步骤，例如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate或自体血液回收机5)。洗涤后，细胞可在各种生物相容性缓冲液中重新悬浮，例如无ca
2
，无mg
2
的pbs、勃脉力a(plasmalyte a)或其他含或不含缓冲液的生理盐水溶液。或者，可以去除单采样品中不希望的成分，并将细胞在培养基中直接重新悬浮。
[0400]
在另一个实施方案中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞(例如通过percoll
tm
梯度离心或逆流离心洗脱)，从外周血淋巴细胞中分离t细胞。一种t细胞的特定亚群，如cd3

,cd28

,cd4

,cd8

，cd45ra

和cd45ro

t细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施方案中，通过与抗cd3/抗cd28(即3
×
28)偶联微珠(如m-450cd3/cd28 t)孵育足够的时间段以用于对需要的t细胞进行阳性选择。在一个实施方案中，时间段约为30分钟。在另一个实施方案中，时间段范围为30分钟到36小时或更长，以及包括在此之间的所有整数值。在另一实施例中，时间段至少为1、2、3、4、5或6小时。在又一优选实施方案中，时间段为10至24小时。在一个优选实施方案中，孵育时间段为24小时。对于白血病患者的t细胞分离，使用更长的孵育时间(如24小时)，可以增加细胞产量。与其他细胞类型相比，在t细胞较少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离t细胞，例如从肿瘤组织或免疫受损的个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。此外，使用更长的孵育时间可以提高捕获cd8 t细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长t细胞与cd3/cd28微珠结合的时间和/或通过增加或减少微珠与t细胞的比例(如本发明进一步描述的)，可以在培养开始时或在过程中的其他时间点优先选择出或淘汰t细胞亚群。此外，通过增加或减少微珠或其他表面上的抗cd3和/或抗cd28抗体的比例，可以在培养开始时或在其他所需时间点优先选择出或淘汰t细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的背景下也可以使用多轮选择。
[0401]
可以采用各种技术来分离细胞以富集所需的免疫效应细胞。例如，可以使用阴性选择方法来去除不是所需免疫效应细胞的细胞。此外，可以使用阳性选择方法来分离或富集所需的免疫效应细胞或其前体细胞，或者可以使用阳性选择方法和阴性选择方法的组合。单克隆抗体(mabs)对于识别与阳性和阴性选择相关的特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记都特别有用。如果要分离特定类型的细胞，例如特定类型的t细胞，可以使用各种细胞表面标记或标记组合以分离细胞，包括但不限于cd3、cd4、cd8、cd34(用于造血干/祖细胞)等，这在本领域是众所周知的(参见，kearse,t cell protocols:development and activation,humana press,totowa nj(2000)；de libero,t cell protocols,vol.514of methods in molecular biology,humana press,totowa nj(2009))。在一些实施方案中，通过阴性选择来富集t细胞群可以用针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体结合来完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述流式细胞术使用针对阴性选择细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集cd4

细胞，单克隆抗体混合物通常包括cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择调节性t细胞，其通常表达cd4

,cd25

,cd62l
hi
,gitr

和foxp3

。或者，在某些实施方案中，t调节性细胞通过抗c25偶联微珠或其他类似的选择方法被消除。
[0402]
免疫效应细胞的分离程序包括但不限于密度梯度离心、偶联修饰细胞密度的颗粒、用抗体包被的磁珠磁性分离、亲和层析；与单克隆抗体(mab)结合或偶联使用的细胞毒
剂，包括但不限于补体和细胞毒素，以及附着在固体基质上的抗体淘筛，例如平板或芯片，洗脱，流式细胞术，或任何其他方便的技术(参见，例如，recktenwald et al.,cell separation methods and applications,marcel dekker,inc.,new york(1998))。可以理解的是，本发明提供的方法中使用的免疫效应细胞可以是实质上纯的细胞，也可以是多克隆群体。在一些实施方案中，多克隆群体可以富集为所需的免疫效应细胞。根据需要，这种富集可以在对细胞进行基因工程改造以表达本发明提供的融合蛋白之前或之后进行。
[0403]
免疫效应细胞对于受试者可以是自体的或非自体的，这些受试者按照本发明公开的治疗方法给药。自体细胞是从施用了工程改造细胞的受试者体内分离出来。任选地，可以通过白细胞单采获得细胞，其中白细胞选择性地从提取的血液中取出，制成重组体，然后再输注到供体的体内。或者，可以使用来自非受试者的非自体供体的同种异体细胞。在非自体供体的情况下，对细胞进行分型并与人类白细胞抗原(hla)匹配，以确定合适的相容性水平，这在本领域是众所周知的。细胞可任选地在分离和/或基因工程改造和/或基因工程改造后细胞扩增后冷藏保存(参见kaiser et al.,supra,2015))。冷藏保存细胞的方法在本领域众所周知(参见，例如，freshney,culture of animal cells:a manual of basic techniques,4th ed.,wiley-liss,new york(2000)；harrison and rae,general techniques of cell culture,cambridge university press(1997))。
[0404]
在一些实施方案中，分离的免疫效应细胞在体外进行基因工程改造，用于重组表达融合蛋白。在一些实施方案中，分离的免疫效应细胞在体外进行基因工程改造，用于重组表达融合蛋白和car/tcr/bite。在一些实施方案中，本发明提供的免疫效应细胞是通过体外致敏(sensitization)获得的，其中致敏反应可以在免疫效应细胞被基因工程改造以重组表达本发明公开的融合蛋白之前或之后发生。在一个实施方案中，从体内来源分离致敏免疫效应细胞(如t细胞)，已经致敏的免疫效应细胞发生基因工程改造将是不言而喻的。
[0405]
在本发明中还考虑了在可能需要如本发明所述的基因工程细胞之前的一段时间内从受试者采集血液样本或单采制品。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞来源，并分离和冷冻所需的细胞(如t细胞)，以供以后用于任何数量的疾病或病症的t细胞治疗，这些疾病或病症(例如本发明所述的那些)将受益于t细胞治疗。在一个实施方案中，血液样本或单采取自一般健康的受试者。在某些实施方案中，血液样本或单采取自有发病风险但尚未发病的一般健康的受试者，并分离和冷冻需要的细胞以供以后使用。在某些实施方案中，t细胞可以扩增、冷冻并在以后的时间使用。在某些实施方案中，在诊断出如本发明所述的特定疾病后不久但在任何治疗之前，从患者体内收集样本。在另一个实施方案中，在采用任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样本或单采样中分离细胞，所述治疗方式包括但不限于用药物治疗(如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放疗、免疫抑制剂(如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸和fk506)、抗体或其他免疫抑制剂(如campath、抗cd3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228)和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和fk506)或抑制对生长因子诱导信号传导很重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liu et al.,cell 66:807-815,1991；henderson et al.,immun73:316-321,1991；bierer et al.,curr.opin.immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方案中，为患者分离并冷冻细胞以备后续与骨髓移植或干细胞移植(例如，在移植之前、同时或之后)，使用化疗剂(如氟达拉滨)、外部电子束辐射治
疗(xrt)、环磷酰胺或抗体(如okt3或campath)的t细胞消融治疗联合使用。在另一个实施方案中，细胞在b细胞消融治疗之前被分离，并且可以被冷冻，以便以后用于之后的治疗，例如与cd20反应的药物(例如rituxan)。
[0406]
在进一步的实施方案中，t细胞直接从治疗后的患者处获得。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是使用损害免疫系统的药物的治疗后，治疗后不久的时期内，患者通常从治疗中恢复，所获得的t细胞的质量因其体外扩增能力可以达到最佳或改善。同样地，使用本发明描述的方法进行体外操作后，这些细胞可以处于增强移植和体内扩增的优选状态。因此，考虑在该恢复阶段收集血细胞，包括t细胞、nk细胞或造血谱系的其他免疫效应细胞。此外，在某些实施方案中，动员(mobilization)(例如，用gm-csf动员)和预处理方案可用于在受试者中创造有利于特定细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，特别是在治疗后的限定时间窗期间。举例说明的细胞类型包括t细胞、b细胞、树突状细胞和免疫系统的其他细胞。
[0407]
本发明所公开的免疫效应细胞可以经受本领域公知的有利于细胞维持或扩增的条件。(de libero,t cell protocols,vol.514of methods in molecular biology,humana press,totowa nj(2009)；parente-pereira et al.,j.biol.methods 1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；movassagh et al.,hum.gene ther.11:1189-1200(2000)；rettig et al.,mol.ther.8:29-41(2003)；agarwal et al.,j.virol.72:3720-3728(1998)；pollok et al.,hum.gene ther.10:2221-2236(1999)；quinn et al.,hum.gene ther.9:1457-1467(1998)；另见商业上可用的方法，如dynabeads
tm
人t细胞活化剂产品,thermo fisher scientific,waltham,ma))。本发明公开的免疫效应细胞(例如，t细胞)可以任选地在体外基因工程改造之前或之后扩增。细胞的扩增对于增加用于给药的受试者的细胞数量特别有用。这样的用于细胞扩增方法在本领域是众所周知的(参见，例如，kaiser et al.,cancer gene therapy 22:72-78(2015)；wolfl et al.,nat.protocols 9:950-966(2014))。此外，细胞可任选地在分离和/或基因工程和/或基因工程细胞扩增后冷藏保存(参见kaiser et al.,supra,2015))。用于冷藏保存细胞的方法在本领域是众所周知的(参见，例如，freshney,culture of animal cells:a manual of basic techniques,4th ed.,wiley-liss,new york(2000)；harrison and rae,general techniques of cell culture,cambridge university press(1997))。
[0408]
在一些实施方案中，本发明提供了免疫效应细胞，例如t细胞，其识别病毒抗原或肿瘤抗原或对病毒抗原或肿瘤抗原致敏，并且还重组表达本发明提供的融合蛋白。这种免疫效应细胞，例如t细胞，可以但不需要表达与病毒抗原或肿瘤抗原结合的car，因为其已经是抗原特异性的，因此它们的免疫应答(例如，细胞毒性)被此类抗原特异性刺激。这种免疫效应细胞，例如t细胞，识别病毒抗原或肿瘤抗原并对病毒抗原或肿瘤抗原致敏，可以通过已知的方法获得，例如，使用幼稚t细胞(参见，例如，wolfl et al.,nat.protocols 9:950-966(2014))或造血前体细胞(参见，例如，van lent et al.,j.immunol.179:4959-4968(2007))的体外致敏方法；或者从暴露于抗原并对抗原产生免疫应答的受试者中获得，例如受试者有病毒感染或肿瘤抗原(即体内致敏的免疫效应细胞)。从受试者中分离抗原特异性t细胞的方法是本领域公知的。这种方法包括但不限于细胞因子捕获系统或细胞因子分泌试验，其基于抗原刺激的t细胞分泌的细胞因子，可用于识别和分离抗原特异性，并在体外
扩增细胞(参见，assenmacher et al.,cytometric cytokine secretion assay,in analyzing t cell responses:how to analyze cellular immune responses against tumor associated antigens,nagorsen et al.,eds.,chapter 10,pp.183-195,springer,the netherlands(2005)；haney et al.,j.immunol.methods 369:33-41(2011)；bunos et al.,vox sanguinis doi:10.1i l l/vox.12291(2015)；montes et al.,clin.exp.immunol.1 42:292-302(2005)；adusumilli et al.,sci translmed.6:261ral51(2014))。这类细胞因子包括但不限于干扰素-γ和肿瘤坏死因子-a。抗原特异性t细胞可以使用上述用于分离免疫效应细胞的众所周知的技术来分离，这些技术包括但不限于流式细胞术、磁珠、固相上淘选(panning on a solid phase)等。抗原特异性t细胞分离技术也可在市面上买到，可用于或适应临床应用(参见，例如，miltenyi biotec,cambridge,ma；proimmune,oxford,uk等)。t细胞激活和扩增的方法在例如，u.s.pat.nos.6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514和6,867,041中描述。
[0409]
通常，本发明提供的t细胞可以通过与表面接触而扩增，该表面上附着有刺激cd3/tcr复合物相关信号的试剂和刺激t细胞表面上的共刺激受体的配体。特别地，可以如本发明所述刺激t细胞群，例如通过接触抗cd3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗cd2抗体，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶c激活剂(例如苔藓抑素)进行接触。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合该辅助分子的配体。例如，在适合刺激t细胞增殖的条件下，可以用抗cd3抗体和抗cd28抗体接触t细胞群。抗cd3抗体和抗cd28抗体刺激cd4

t细胞或cd8

t细胞的增殖。抗cd28抗体的示例包括9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone,besancon,france)，也可使用本领域常见的其他方法(berg et al.,transplant proc.30(8):3975-3977,1998；haanen et al.,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland et al.,j.immunol meth.227(1-2):53-63,1999)。5.6药物组合物
[0410]
本发明还提供了包含本发明公开的可溶性融合蛋白的药物组合物。本发明还提供了包含本发明公开的基因工程免疫效应细胞的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的本发明公开的融合蛋白和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的本发明公开的基因工程细胞和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物在免疫治疗中是有用的。在一些实施方案中，药物组合物在免疫肿瘤学(immuno-oncology)中是有用的。在一些实施方案中，药物组合物在抑制受试者(例如，人类病人)的肿瘤生长是有用的。在一些实施方案中，药物组合物在治疗受试者(例如，人类病人)的癌症是有用的。在一些实施方案中，药物组合物在治疗病毒感染中是有用的。
[0411]
在一些实施方案中，本发明提供的药物组合物包含本发明提供的可溶性融合蛋白。融合蛋白可以以不同的浓度存在。在一些实施方案中，本发明提供的药物组合物包含本发明提供的以1-1000mg/ml的可溶性融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含本发明提供的10-500mg/ml、10-400mg/ml、10-300mg/ml、10-200mg/ml、10-100mg/ml、20-100mg/ml或50-100mg/ml的可溶性融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包含本发明提供的可溶性融合蛋白，本发明提供的组合物包括本发明提供的1-1000mg/ml可溶性融合蛋白。在一些
实施方案中，本发明提供的药物组合物包含本发明提供的可溶性融合蛋白，其含量为约10mg/ml、约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml，约70mg/ml，约80mg/ml，约90mg/ml，约100mg/ml，约120mg/ml，约150mg/ml,约180mg/ml，约200mg/ml，约300mg/ml，约500mg/ml，约800mg/ml，或约1000mg/ml。
[0412]
本发明公开的包含基因工程细胞的药物组合物可以包含纯化的细胞群。如本发明所述，本领域技术人员可以使用各种公知的方法很容易地确定细胞群中的细胞百分比。本发明提供的细胞群中包含基因修饰细胞的纯度范围可以是约20％至约25％，约25％至约30％，约30％至约35％，约35％至约40％，约40％至约45％，约45％至约50％，约55％至约60％，约65％至约70％，约70％至约75％，约75％至约80％，约80％至约85％；约85％至约90％，约90％至约95％，或者约95％至约100％。在一些实施方案中，本发明提供的细胞群中包含基因修饰细胞的纯度范围可以是约20％至约30％、约20％至约50％、约20％至约80％、约20％至约100％、约50％至约80％、或约50％至约100％。本领域技术人员可以方便地调整剂量；例如，纯度的降低可能需要剂量的增加。
[0413]
本发明还提供了用于制备含有本发明公开的融合蛋白的药物组合物的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括存在于一个或多个容器中的本发明公开的融合蛋白和药学上可接受的辅料。在另一个实施方案中，该试剂盒可以包括本发明公开的用于给受试者给药的融合蛋白。在特定的实施方案中，该试剂盒包括关于融合蛋白的制备和/或给药的说明。
[0414]
本发明还提供了用于制备本发明公开的细胞的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包括用于产生表达本发明公开的融合蛋白的基因工程细胞(例如t细胞)的一种或多种载体。所述试剂盒可用于从自体或非自体细胞产生基因工程细胞，以给药给相容的受试者。在另一个实施方案中，该试剂盒可以包括本发明公开的用于给受试者给药的细胞。在特定实施方案中，该试剂盒包括在一个或多个容器中的本发明公开的细胞。在特定的实施方案中，该试剂盒包括关于基因工程细胞的制备和/或给药的说明。
[0415]
在一些实施方案中，本发明提供了含有本发明提供的融合蛋白或细胞的药物组合物，其中该组合物适合于局部给药。在一些方面，局部给药包括瘤内注射、瘤周注射、瘤旁注射(juxtatumoral injection)、病灶内注射和/或注射到肿瘤引流淋巴结中，或基本上任何肿瘤靶向注射，其中抗肿瘤剂预期会泄漏到邻近靶向实体瘤的原发性淋巴结中。
[0416]
可用于本发明提供的组合物或制剂中的药学上可接受的载体包括任何和所有的溶剂、分散介质、包被层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等具有生理相容性的物质。在一些实施方案中，载体适用于静脉、肌内、皮下、胃肠外、脊椎或表皮给药(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，活性成分(即基因工程改造的融合蛋白或细胞)可以被包被在材料中以保护活性成分免受酸和其他可以使活性成分失活的自然条件的作用。
[0417]
本发明还提供了改善融合蛋白或细胞稳定性以允许其长期储存的药物组合物或制剂。在一些实施方案中，本发明公开的药物组合物或制剂包括：(a)本发明公开的融合蛋白或细胞；(b)缓冲剂；(c)稳定剂；(d)盐；(e)填充剂；和/或(f)表面活性剂。在一些实施方案中，药物组合物或制剂稳定至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少5年或更长时间。在一些实施方案中，药物组合物或制剂在4℃、25℃或40℃下储存时是稳定的。
[0418]
在本发明公开的药物组合物或制剂中有用的缓冲剂可以是弱酸或弱碱，以用于在添加另一酸或碱后将溶液的酸度(ph)保持在选定值附近。适当的缓冲剂可以通过保持对制剂ph值的控制来最大限度地提高制剂的稳定性。适当的缓冲剂还可以保证生理相容性或优化溶解度。流变学、粘度和其他性能也取决于制剂的ph值。常见的缓冲剂包括但不限于组氨酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐和磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲剂包括具有等渗剂的组氨酸(例如l-组氨酸)，并可能用本领域已知的酸或碱调整ph值。在某些实施方案中，缓冲剂是l-组氨酸。在某些实施方案中，制剂的ph保持在约2至约10，或约4至约8之间。
[0419]
将稳定剂添加到药物产品中以稳定该产品。这类试剂可以以多种不同的方式稳定蛋白质。常见的稳定剂包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸或苏氨酸)、碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖或麦芽糖)、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇、环糊精或任何种类和分子量的葡聚糖)或peg。在本发明的一个方面，选择稳定剂是为了最大限度地提高冻干制剂中fix多肽的稳定性。在某些实施方案中，稳定剂是蔗糖和/或精氨酸。
[0420]
填充剂可以添加到药物组合物或制剂中，以增加产品的体积和质量，从而促进其精确计量和处理。常见的填充剂包括但不限于乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、碳酸钙或硬脂酸镁。
[0421]
表面活性剂是具有亲水基和疏水基的两性物质。表面活性剂可以是阴离子型、阳离子型、两性离子型或非离子型。非离子型表面活性剂包括但不限于烷基乙氧基化物、壬基聚氧乙烯醚、乙氧基化物、聚乙烯氧化物、聚丙烯氧化物、脂肪醇(如鲸蜡醇或油醇)、椰油酰胺mea、椰油酰胺dea、聚山梨酯或十二烷基二甲基胺氧化物。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80。
[0422]
本发明公开的药物组合物或制剂可进一步包括缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂中的一种或多种，以及它们的各种组合。在药物组合物或制剂中使用防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂是本领域技术人员所熟知的。可参考remington:the science and practice ofpharmacy,19
th edition,1995。
[0423]
在一些实施方案中，药物组合物或制剂是水性制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮液，但也可以包括胶体、分散体、乳液和多相材料。术语“水性制剂”被定义为含有至少50％w/w水的制剂。同样，术语“水溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，术语“水悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
[0424]
在一些实施方案中，本发明公开的药物组合物或制剂被冷冻干燥，医生或患者在使用之前向其中添加溶剂和/或稀释剂。
[0425]
本发明公开的药物组合物或制剂还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的示例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、2,6-二叔丁基对甲酚(bht)、卵磷脂，没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0426]
可用于本发明所述药物组合物或制剂中的合适的水性和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。通过使用包被材料(如卵磷脂)，通过在分散体的情况下保持所
需的粒径，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
[0427]
这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等助剂。可以通过上述的灭菌程序以及加入各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖类、氯化钠等。此外，通过加入延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)，可使可注射药物剂型的吸收延长。
[0428]
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这种介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，其在本发明所述药物组合物中的使用是可预期的。药物组合物或制剂可以包含防腐剂，也可以不包含防腐剂。所述组合物中可以掺入补充的活性化合物。
[0429]
药物组合物或制剂在生产和储存条件下通常必须是无菌和稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳剂、脂质体、或适合高抗体浓度的其它有序结构。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。通过使用如卵磷脂的包被层，通过在分散体情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，所述组合物可以包括等渗剂，例如，组合物中的糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇或组合物)或氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收的药物，例如单硬脂酸盐和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。
[0430]
根据需要，可在适当溶剂中所需量的活性化合物中加入上述一种或多种成分，然后进行灭菌微滤，制备得到无菌注射液。通常，分散体是通过将活性化合物加入无菌载体中来制备的，所述无菌载体包含基本分散介质和本发明列举的所需的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，一些制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，可从其先前无菌过滤的溶液中获得活性成分及任何其他所需成分的粉末。
[0431]
本发明公开的药物组合物或制剂中可与载体材料结合的活性成分的含量可以改变。在一些实施方案中，可与载体材料结合的活性成分的含量是产生治疗效果的量。通常以百分数计，，活性成分与药学上可接受的载体组合中活性成分的该含量范围为约0.01％至约99％、约0.1％至约70％、或约1％至约30％。
[0432]
本发明公开的药物组合物或制剂可以用保护活性成分免受快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入剂、透皮贴剂和微囊递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利或是本领域技术人员普遍已知的。参见，例如，sustainedand controlled release drug delivery systems,j.r.robinson,ed.,marcel dekker,inc.,new york,1978。
[0433]
在一些实施方案中，本发明描述的融合蛋白或细胞可以配制以确保在体内适当分布。例如，血脑屏障(bbb)排除了许多高度亲水性化合物。为了确保本发明所述的活化成分穿过bbb(如果需要，例如，对于脑癌)，例如，它们可以被配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，u.s.patents 4,522,811；5,374,548；and 5,399,331。脂质体可以包括选择性转运至特定细胞或器官的一个或多个基团，从而增强靶向药物递送(参见，例如，v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29:685)。靶向基团的示例包括叶酸或生物素(参见，例如，u.s.patent5,416,016to low et al)，甘露糖苷类(umezawa et al,(1988)
biochem.biophys.res.commun.153:1038)，抗体(p.g.bloeman et al.(1995)febs lett.357:140；m.owais et al.(1995)antimicrob.agents chemother.39:180)，表面活性蛋白a受体(briscoe et al.(1995)am.j.physiol.1233:134)，pl20(schreier et al.(1994)j.biol.chem.269:9090)，也可参见k.keinanen；m.l.laukkanen(1994)febs lett.346:123；j.j.killion；i.j.fidler(1994)immunomethods 4:273。5.7方法和应用
[0434]
本发明提供的融合蛋白可以克服例如肿瘤或癌症组织中的免疫抑制微环境，并增强细胞介导的免疫应答。如本发明所公开的，本发明提供的融合蛋白可施用于受试者以引发或增强针对癌症组织或病毒感染的免疫应答。
[0435]
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可以作为单一治疗给药。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可与第二治疗结合给药，以增强治疗的疗效。第二种治疗可以是免疫疗法，其中本发明提供的融合蛋白的给药增强了免疫疗法的功效。在一些实施方案中，第二治疗是细胞疗法，其中将免疫效应细胞或细胞群给药到受试者中以激活受试者体内的免疫系统，以对抗病原体(例如病毒)或者疾病(例如癌症)，并且本发明提供的融合蛋白的给药增强了细胞疗法的功效。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可被施用以增强免疫效应细胞(例如，t细胞)的增殖和激活。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可被施用以刺激抗原提呈细胞的成熟和表位扩展活性。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可被给药以使免疫效应细胞克服肿瘤微环境中的免疫抑制。肿瘤微环境中的免疫抑制可通过例如pd1/pd-l1信号传导、调节性t细胞(tregs)或tgf-β信号传导介导。
[0436]
例如，在一些实施方案中，融合蛋白可以与激活的免疫效应细胞联合给药。激活的免疫效应细胞可以是，例如激活的t细胞、激活的nk细胞、激活的nkt细胞、激活的巨噬细胞、激活的中性粒细胞或激活的粒细胞。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白可与外周血白细胞(pbl)、浸润淋巴细胞(til)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)或骨髓浸润淋巴细胞(mils)联合给药。在一些其他实施方案中，本发明提供的融合蛋白可与cart细胞、tcrt细胞或bite联合给药。如本领域普通技术人员所理解的，与本发明公开的融合蛋白联合给药的免疫疗法(例如，细胞疗法)可以是本发明公开的或本领域已知的任何免疫疗法。当该融合蛋白与第二治疗结合给药时，它可以在第二治疗之前、同时或之后给药。本领域普通技术人员将能够确定给药的实际时间，以确保达到协同治疗效果。
[0437]
此外，如本发明所公开的，免疫效应细胞可以被基因工程改造以表达本发明提供的融合蛋白，以获得克服肿瘤或癌症组织中免疫抑制微环境的能力，并在受试者中产生针对疾病或病原体的增强免疫应答。因此，本发明还提供了在治疗癌症或肿瘤或病毒感染中使用本发明公开的融合蛋白、基因工程细胞或细胞群或药物组合物的方法。
[0438]
在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的本发明公开的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了本发明公开的融合蛋白在肿瘤或癌症治疗中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了本发明提供的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。
[0439]
在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的本发明公开的基因工程细胞。在一些实施方案中，本发明提
供了本发明公开的基因工程细胞在肿瘤或癌症治疗中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了本发明提供的基因工程细胞在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，在治疗中使用包括基因工程细胞的细胞群。细胞群可以是同源的。细胞群可以是异源的。
[0440]
在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的本发明公开的药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供了本发明公开的药物组合物在治疗肿瘤或癌症中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了本发明提供的药物组合物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。
[0441]
在另一个实施方案中，本发明提供的方法和用途包括向有需要的受试者给予癌抗原特异性免疫效应细胞，其中细胞重组表达car/tcr/bite，所述car/tcr/bite包括能够与癌抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白与癌抗原特异性免疫效应细胞联合给药。在一些实施方案中，癌抗原特异性免疫效应细胞还表达本发明提供的融合蛋白。所述癌抗原可以是本发明公开的或本领域其他已知的任何癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原选自由her2、ny-eso-1、cd19、cd20、cd22、psma、c-met、gpc3、il13ra2、egfr、cd123、cd7、gd2、psca、ebv16-e7、h3.3、egfrviii、bcma和间皮素组成的群组。
[0442]
本发明还提供了使用本发明公开的融合蛋白、基因工程细胞或药物组合物治疗病毒感染的方法。在一些实施方案中，本发明提供了在需要的受试者中治疗病毒感染的方法，包括向受试者给予治疗有效量的本发明公开的融合蛋白、基因工程细胞或药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供了本发明公开的融合蛋白、基因工程细胞或药物组合物在治疗病毒感染中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了本发明提供的融合蛋白、基因工程细胞或药物组合物在制备治疗病毒感染的药物中的用途。
[0443]
本发明所述药物组合物中活性成分(即本发明提供的融合蛋白或对免疫效应细胞进行基因工程改造)的实际剂量水平可以改变，以获得有效地实现特定患者所需治疗反应的活性成分的含量、组合物和给药方式，而不会对患者产生毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括本发明所述特定组合物的活性、给药途径、给药时间、排泄率、治疗持续时间、与所用特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中公知的类似因素。
[0444]
在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白被施用于有需要的受试者。融合蛋白可以以固定剂量给药(固定剂量方案)。在某些实施方案中，本发明公开的融合蛋白以基于体重的剂量给药。对于本发明公开的融合蛋白的给药，剂量范围约以宿主体重的0.0001至100mg/kg、0.01至50mg/kg、0.01至10mg/kg、0.01至5mg/kg、1-10mg/kg或1至5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重。
[0445]
本发明提供的融合蛋白可在多种场合给药。单次剂量之间的间隔可以是，例如，每周，每月，每三个月，每六个月，或每年。时间间隔也可以是不规则的，这是通过测量受试者血液中融合蛋白水平来表明的。在一些方法中，剂量被调整以达到约1-1000pg/ml的血浆浓度，在一些方法中约25-300pg/ml的血浆浓度。示例的治疗方案包括每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三至六个月一次。本发明所述融合蛋白的示例性剂量方案包括通过静脉给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，采用以下剂量方
案之一给予融合蛋白：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，随后1mg/kg体重，每3周一次。
[0446]
融合蛋白可以作为缓释制剂给药，在这种情况下不需要频繁给药。剂量和频率取决于融合蛋白在患者体内的半衰期而有所不同。在治疗应用中，有时需要在相对短的时间间隔内给予相对高的剂量，直到疾病的进展减轻或终止，并直到患者表现出的疾病症状部分改善或完全改善。
[0447]
如本发明所公开的，本发明公开的融合蛋白可与涉及激活的免疫效应细胞的细胞疗法结合使用，以增强细胞疗法的功效。在一些实施方案中，经基因改造以表达本发明公开的融合蛋白的免疫效应细胞可用于本发明公开的治疗方法。当采用细胞疗法时，本发明提供的细胞可以基于被给予细胞的受试者体重以每千克细胞(细胞/kg)的剂量给药。通常细胞剂量在约104到10
10
cell/kg体重，例如，约105到约109，约105到约108，约105到约107，或约105到约106，取决于给药的方式和位置。一般来说，在全身给药的情况下，使用比区域给药(在肿瘤区域给药)更高的剂量。示例性剂量范围包括但不限于1x104到1x108,2x104到1x108,3x104到1x108,4x104到1x108,5x104到1x108,6x104到1x108,7x104到1x108,8x104到1x108,9x104到1x108,1x105到1x108,例如,1x105到9x107,1x105到8x107,1x105到7x107,1x105到6x107,1x105到5x107,1x105到4x107,1x105到3x107,1x105到2x107,1x105到1x107,1x105到9x106,1x105到8x106,1x105到7x106,1x105到6x106,1x105到5x106,1x105到4x106,1x105到3x106,1x105到2x106,1x105到1x106,2x105到9x107,2x105到8x107,2x105到7x107,2x105到6x107,2x105到5x107,2x105到4x107,2x105到3x107,2x105到2x107,2x105到1x107,2x105到9x106,2x105到8x106,2x105到7x106,2x105到6x106,2x105到5x106,2x105到4x106,3x105到3x106cells/kg等。这种剂量范围对区域给药特别有用。在一个特定的实施方案中，细胞以1
×
105至1x108，例如1x105至1x107,1x105至1x106,1x106至1x108,1x106至1x107,1x107至1x108,1x105至5x106，特别是1x105至3x106或3x105至3x106cell/kg的剂量用于区域给药，例如胸腔内给药。示例性剂量范围还可以包括但不限于5x105至1x108，例如，6x105至1x108，7x105至1x108,8x105至1x108,9x105至1x108,1x106至1x108,1x106至9x107,1x106至8x107,1x106至7x107,1x106至6x107,1x106至5x107,1x106至4x107,1x106至3x107cell/kg等。这种剂量对全身给药特别有用。在一个特定的实施方案中，细胞以1
×
106至3x107cell/kg的剂量提供以用于全身给药。示例性细胞剂量包括但不限于1
×
104,2x104,3x104,4x104,5x104,6x104,7x104,8x104,9x104,1x105,2x105,3x105,4x105,5x105,6x105,7x105,8x105,9x105,1x106,2x106,3x106,4x106,5x106,6x106,7x106,8x106,9x106,1x107,2x107,3x107,4x107,5x107,6x107,7x107,8x107,9x107,1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109的剂量，以及范围在诸如约104到约10
10
cell/kg。此外，还可以调整剂量，以说明是否是单次给药或是否是多次给药。如上所述，精确确定什么是有效剂量可以基于每个受试者的个人因素，包括他们的体型、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员可以根据本发明的公开和本领域现有知识容易地确定剂量。
[0448]
本发明提供的融合蛋白、免疫效应细胞和药物组合物可通过本领域已知的任何方法给药给受试者，包括但不限于胸腔给药、静脉给药、皮下给药、结内给药(intranodal administration)、瘤内给药、肌内给药、皮内给药、鞘内给药、胸膜内给药、腹膜内给药、颅内给药、脊髓或其他肠外给药途径，例如通过注射或输注，或胸腺直接给药。本发明所用的
短语"肠外给药"是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常是通过注射给药，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和腹膜内注射和输注。在一些实施方案中，采用皮下给药。在一些实施方案中，采用静脉给药。在一些实施例中，采用口服给药。在一个实施方案中，本发明提供的细胞可以使用众所周知的方法局部递送到肿瘤，包括但不限于肝或主动脉泵；四肢、肺或肝灌注；在门静脉；通过静脉分流；在肿瘤附近的腔内或血管等。在另一个实施方案中，本发明提供的细胞可以全身给药。在一个优选实施方案中，细胞在肿瘤部位局部给药。所述细胞也可以在瘤内给药，例如，通过在肿瘤部位和/或进入肿瘤血管系统直接注射细胞。例如，在恶性胸膜疾病、间皮瘤或肺癌的情况下，最好通过胸膜内给药(参见，adusumilli et al.,science translational medicine 6(261):261ra151(2014))。本领域技术人员可以基于要治疗的肿瘤的类型和/或位置来选择合适的给药方式。所述细胞可通过注射或导管导入。在一个实施方案中，对有需要的受试者进行胸膜内给药，例如，使用胸膜内导管。任选地，可选择在细胞给药前、给药期间或给药后给予受试者扩增/或分化剂，以增加本发明提供的体内细胞生成。
[0449]
本发明提供的细胞的增殖通常是在体外进行的，并且在给药给受试者后在体内进行也是可取的(参见kaiser et al.,cancer gene therapy 22:72-78(2015))。细胞的增殖应伴随着细胞的存活，以允许细胞(如t细胞)的扩增和持续存在。
[0450]
在一些实施方案中，可以用本发明公开的融合蛋白、细胞或药物组合物治疗的癌症或肿瘤是实体肿瘤。使用本发明提供的融合蛋白、细胞或药物组合物治疗的癌症或肿瘤包括通常对免疫治疗有反应的癌症。在一些实施方案中，癌症或肿瘤可以是癌、肉瘤、黑色素瘤(例如，皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、胶质瘤(glioma)、胶质母细胞瘤、脑和脊髓肿瘤、生殖细胞肿瘤、神经内分泌肿瘤、类癌肿瘤、胃癌(gastric cancer)、食管癌、肝癌(liver cancer)、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、头颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、肾癌(kidney cancer)、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌(如激素难治性前列腺癌)、膀胱癌、结肠癌、内分泌癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、间皮瘤、默克尔细胞癌、骨癌、肠癌、肾癌(如透明细胞癌)(renal cancer)、咽喉癌、直肠癌、肛门区癌，脑癌，胃癌(stomach cancer)，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，小肠癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、脊髓轴突肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、滑膜肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肝癌(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、上皮癌、胶质瘤(glioma)、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
[0451]
在一些实施方案中，可以用本发明公开的融合蛋白、细胞或药物组合物治疗的癌症或肿瘤是血液系统癌症。在一些实施方案中，血液系统癌症可以是淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤(mm)或骨髓增生异常综合征(mds)。在一些实施方案中，血液系统癌症可以是真性红细胞增多症、急性白血症、急性髓细胞白血病(aml)、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白
血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病(cml)、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒-单核细胞白血病(cmml)、自然杀伤细胞白血病(nk白血病)、霍奇金病、非霍奇金病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、自然杀伤细胞淋巴瘤(nk淋巴瘤)、皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)或外周t细胞淋巴瘤(ptcl)。
[0452]
在癌症治疗中，可以消除受试者的癌症或肿瘤细胞，但任何临床改善都是有益的。抗肿瘤作用可以通过肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数量的减少、转移数量的减少、预期寿命的增加或与癌症状况相关的各种生理症状的改善来表现。抗肿瘤作用也可以通过本发明提供的细胞或药物组合物在第一时间预防肿瘤发生的能力来表现。在一些实施方案中，“抗肿瘤效应”可以通过减少癌症诱发的免疫抑制来表现。临床改善包括癌症或肿瘤的风险或进展速度降低或病理后果减轻。还应理解的是，治疗癌症的方法可以包括改善与癌症相关的体征或症状的任何效果。这种体征或症状包括但不限于减少肿瘤负荷，包括抑制肿瘤生长、减缓肿瘤生长速度、减小肿瘤大小、减少肿瘤数量、消除肿瘤，所有这些都可以使用本领域公知的常规肿瘤成像技术来测量。与癌症相关的其他体征或症状包括但不限于疲劳、疼痛、体重减轻以及与各种癌症相关的其他体征或症状。
[0453]
在一些实施方案中，本发明提供的方法或用途可减少肿瘤负荷。因此，本发明公开的融合蛋白、细胞或药物组合物的给药可以减少肿瘤细胞的数量，减小肿瘤大小，和/或根除受试者体内的肿瘤。用于监测患者对本发明公开的药物组合物的给药反应的方法是本领域中已知的，并且可以根据本发明公开的方法使用。在一些实施方案中，本领域中已知的方法可用于监测患者对本发明公开的治疗方法的给药的反应。在一些实施方案中，本领域已知的方法可用于监测病灶的大小和/或淋巴结的大小。作为非限制性示例，在一些实施方案中，对比增强ct扫描可以检测和/或监测患者体内的病灶和/或淋巴结。在一些实施方案中，本发明公开的药物组合物的给药可以减小患者体内由ct扫描检测到的病灶的大小。在一些实施方案中，本发明公开的药物组合物的给药可导致异常淋巴结的缩小。在一些实施方案中，本发明提供的方法或用途可提供增加或延长患有癌症的受试者的存活率。在一些实施方案中，本发明提供的方法或用途可提供用于增强受试者对抗癌症的免疫应答。
[0454]
在本发明公开的方法中，向需要癌症治疗的受试者施用治疗有效量的本发明公开的融合蛋白、细胞或药物组合物。受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。另一组合适的受试者可以是有癌症病史，但对另一种治疗模式有反应的受试者。先前的治疗可以包括但不限于，手术切除，放疗和化疗。在一些实施方案中，这些个体没有临床上可测量的肿瘤。然而，他们被怀疑有疾病进展的风险，要么是靠近原始肿瘤部位，要么是通过转移。这个组可以进一步细分为高风险和低风险的个体。细分是根据在最初处理之前或之后观察到的特征进行的。这些特征在临床中是已知的，并且这些特征被适当地定义用于不同类型的癌症。高风险亚组的典型特征是肿瘤侵犯邻近组织，或显示淋巴结转移。
[0455]
受试者可能具有晚期疾病，在这种情况下，治疗目标可以包括减轻或逆转疾病进展，和/或减轻副作用。受试者可以有已接受治疗的疾病史，在这种情况下，治疗目的可以是降低或延迟复发风险。此外，可使用本发明公开的融合蛋白、基因工程细胞或药物组合物治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
[0456]
对于治疗，给药的量是对产生预期效果有效的量。有效量或治疗有效量是在治疗
时足以提供有益或期望的临床结果的量。有效量可以在一次给药或一系列给药(一个或多个剂量)中提供。有效的量可以以快速输注(bolus)或通过连续灌注提供。就治疗而言，有效量是指足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展，或以其他方式减轻疾病病理后果的量。有效量可以由医生为特定的受试者确定。在确定达到有效量的适当剂量时，通常要考虑几个因素，包括例如受试者的年龄、性别和体重、正在治疗的病情以及病情的严重程度。
[0457]
本发明提供的融合蛋白、细胞或药物组合物可以与本领域已知的医疗设备一起给药。例如，在一些实施方案中，可以使用无针皮下注射装置，例如u.s.patent nos.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；or 4,596,556中公开的装置。本发明所述的众所周知的使用的植入物和模块的例子包括：u.s.patent no.4,487,603,其公开了一种植入式微型输液泵，用于以可控的速度分配药物；u.s.patent no.4,486,194,其公开了一种用于通过皮肤给药的治疗装置；u.s.patent no.4,447,233,其公开了一种药物输液泵，用于以精确的输液速度输送药物；u.s.patent no.4,447,224,其公开了一种用于连续给药的可变流量植入式输液装置；u.s.patent no.4,439,196,其公开了一种具有多腔室的渗透性药物输送系统；并且u.s.patent no.4,475,196,其公开了一种渗透性药物输送系统。这些专利通过引用引入于本发明。本领域技术人员已知许多其他此类植入物、输送系统和模块。
[0458]
使用不同作用机制的药剂进行联合治疗可以产生相加或协同效应。联合治疗可以允许每种药剂的剂量低于单一治疗中使用的剂量，从而减少毒副作用和/或增加本发明公开的药剂的治疗指数。联合治疗可以降低耐药癌细胞产生的可能性。在一些实施方案中，附加治疗导致本发明所述的细胞或药物组合物的治疗指数的提高。在一些实施方案中，附加治疗导致本发明所述的细胞或药物组合物的毒性和/或副作用的减少。在一些实施方案中，本发明所述的融合蛋白、细胞或药物组合物可与附加治疗联合给药。在一些实施方案中，附加治疗可以是外科切除、放疗或化疗。
[0459]
所述附加治疗可在施用本发明所述的融合蛋白、细胞或药物组合物之前、同时或之后给药。联合给药可以包括共同给药，可在单一药物制剂中或使用分开的制剂，或以任一顺序连续给药，但通常在一段时间内，以便所有活性剂可以同时发挥其生物活性。本领域技术人员可以基于被治疗受试者的需要很容易地确定适当方案，该方案用于本发明所述药物组合物和联合附加治疗的给药，包括在联合治疗中使用的附加药剂的时机和剂量。
[0460]
本发明在此使用确定的语言来描述众多实施例。本发明还具体包括完全或部分排除特定主题的实施方案，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析。因此，即使本发明一般不以本发明不包括的内容来表达，但在本发明中没有明确包含的方面仍然在本发明中披露。
[0461]
本发明描述了本发明的特定实施例，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了上述描述后，于从事本领域工作的人来说，所公开的实施例的变化将变得显而易见，并且期望那些熟练的技术人员可以适当地采用这种变化。因此，本发明旨在以不同于本发明具体描述的方式实施，并且本发明包括在适用法律允许的情况下对所附权利要求书中提到的主题的所有修改和等同物。此外，除非本发明另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。
[0462]
在本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其他参考文献都以全文引
用的方式并入本说明书中，其程度相当于每个单独的出版物或专利申请通过引用的方式被具体和单独引入本发明。提供本发明讨论的出版物仅用于它们在本技术的申请日之前的公开。本发明一些实施例的描述中对任何参考的引用或辨识不应解释为承认此参考可用作本发明的现有技术。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，需要独立确认。
[0463]
已经描述了本发明的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，实验中的描述旨在说明但不限制权利要求中描述的本发明的范围。5.8实验
[0464]
共刺激受体或其配体可通过基因导入免疫效应细胞(如t细胞)，以增强其效应功能、持久性和抗肿瘤活性(stephan mt et al.,nat med(2007)13(12):1440-1449；topp ms et al.j exp med(2003)198(6):947-955.daniel-meshulam i et al.,international journal of cancer(2013)133(12):2903-2913)。然而，由于共刺激受体和配体的表达缺乏，以及抑制性配体(如pd-l1)在tme中的过度表达，t细胞在肿瘤病灶中的功能不足(ankri c and cohen cj,oncoimmunology(2014)3(1):e27399)。在这里，我们生成了一组嵌合蛋白分子，称为淋巴细胞-apcs共刺激受体(“lymphocytes-apcs co-stimulators，即laco-stim”)，包括，例如：a.由cd40配体(cd40l)胞外结构域和cd28胞质结构域组成的膜融合蛋白；b.由cd40l胞外结构域和抗cd28抗体组成的可溶性融合蛋白(例如，scfvs)；c.抗cd40和cd28的双特异性抗体，d.由抗cd40抗体(例如，scfvs)和胞质结构域cd28组成的膜融合蛋白；e.由抗cd40抗体(例如，scfvs)和cd80(或cd86)胞外结构域组成的可溶性融合蛋白；以及f.由cd40l胞外结构域和cd80(或cd86)胞外结构域组成的可溶性融合蛋白(图1)。所有的分子都被设计成同时靶向t细胞中的cd28信号传导以增强t细胞功能和抗原提呈细胞(apcs)(如树突状细胞)中的cd40信号传导，以及tem中巨噬细胞和髓源性细胞中的cd40信号传导，以增加apc的肿瘤抗原呈递能力，并降低tem中巨噬细胞和髓源性细胞的抑制作用。该图旨在说明但不限于laco-stim的可能形式。应当理解的是，其他t细胞共刺激受体，包括本发明公开的或本领域其他已知的(例如，4-1bb、icos、cd27、ox40、dap10、2b4、cd30、cd2、light、gitr、tlr、dr3和cd43),可用于取代如本发明所示的cd28以形成laco-stim分子。还应理解的是，其他apc激活剂，包括本发明公开的或本领域其他已知的(例如，cd80、cd86、cd91、dec-205和dc-sign)，可用于取代如本发明所示的cd40以形成laco-stim分子。
[0465]
当与cars或tcrs共同导入人t细胞时，laco-stim分子对增强t细胞的抗肿瘤功能和刺激apcs、巨噬细胞和髓源性细胞的成熟表现出强烈的作用。结果表明，表达laco-stim分子的t细胞能够克服tem的抑制作用，例如，pd1/pd-l1、treg和tgf-β的抑制。研究还发现，laco-stim能协调t细胞与apcs的相互作用，并且促进apcs的表位扩展能力，并进一步提高抗肿瘤活性。5.8.1材料与方法
[0466]
细胞系和原代人淋巴细胞：a549和click beetle green(cbg)及egfp经慢病毒转导，然后经慢病毒转导hla-a2和ny-eso-1抗原生成a549-eso-cbg。按照描述(liu xet al,cancer res(2015)75(17)：3596-3607)，用cd3/cd28 dynabeads(life technologies)刺激来自正常供体的原代淋巴细胞，并在r10培养基(补充10％fcs的rpmi-1640；invitrogen)中培养。t细胞在第10天以1e8cell/vial被冷藏在在90％fcs和10％dmso的溶液中。
[0467]
用tcr或car转移的t细胞的生成：根据相关出版物合成ny-eso-1 8f tcr(zhao yet al,j immunol(2005)174(7):4415-4423)和4d5 erbb2(her2/neu)car(liu xet al,2015)。对于rna电穿孔，通过适当的限制性内切酶消化使体外转录(ivt)载体线性化，并根据试剂盒提供的程序，使用mmessaget7ultra试剂盒(life technologies)生成ivt rna。将冷冻刺激的t细胞解冻，在在r/10培养基中培养过夜后进行电穿孔。在电穿孔之前，用opti-mem洗涤t细胞三次，并且将t细胞在电穿孔前以1-3
×
108cell/ml的终浓度重新悬浮在opti-mem中。随后，将0.1ml t细胞与指定的ivt rna混合，并使用ecm830 electro square wave porator(harvard apparatus btx)在2mm比色皿(harvard apparatus btx,holliston,ma)中电穿孔(zhao yet al,cancer research(2010)70(22):9053-9061)。对于慢病毒转导，将靶基因克隆到慢病毒载体中，并在抗cd3/cd28珠刺激的1天后转导t细胞。使用先前发表的her2 car和ny-eso-1tcr(liu xet al,2015和zhao yet al,2005)。1个针对cd28的scfv(1412)和6个针对cd40的scfv(f2.103、f5.157、f5.55、4d11、a40c和119)被用于构建双特异性ab或融合蛋白。
[0468]
elisa试验：清洗靶细胞，并将其以1x106个细胞/ml悬浮于r10培养基中。值得注意的是，100μl的每种靶细胞类型一式三份添加至96孔圆底板(corning)。清洗效应t细胞，并且以1
×
106个细胞/ml重悬在r10培养基中，然后100μl的t细胞与指示的孔中的靶细胞组合。将平板在37℃下孵育18-24小时。在孵育后，收集上清液并进行elisa测定(ebioscience)。。
[0469]
诱导未成熟人树突状细胞标记物活化和成熟：将1亿pbmc悬浮于50mlaim-v中，加入t150烧瓶中，并且37℃培养2h，得到黏附细胞。孵育2小时后，将烧瓶略作摇晃，并丢弃悬浮细胞。将20ml aim-v培养基(invitrogen)加入到pbmcs的塑料黏附细胞(plastic-adherent cells)中，并补充1000units/ml重组人gm-csf和500units/ml rhil-4。细胞在37℃，湿润的co2(5％)孵化器中孵育。第3天，将gm-csf和il4分别添加到培养物中，达到1000u/ml和500u/ml。6天后，将重组人tnf-α、il-6、il-1β(每个10ng/ml)和肽(10μg/ml)加入未成熟树突状细胞(dc)。第7天，收获成熟的dc，用aim-v培养基洗涤2次，并重新悬浮在补充有5％人ab血清的aim-v培养基中，使细胞浓度达到4
×
105/ml。5.8.2 laco-stim的共表达显著提高了car-t和tcr-t控制肿瘤生长的能力
[0470]
构建了四种不同形式的laco-stim，它们同时靶向cd28和cd40(图1)。1)由cd40l的胞外结构域和cd28的胞质结构域组成的融合蛋白；2)由抗cd28 scfv和cd40l胞外区组成的融合蛋白(基于ab的可溶性蛋白)；3)由同时抗cd28和cd40的scfvs组成的双特异性抗体；以及4)由抗cd40 scfv作为胞外区与cd28胞内区组成的融合蛋白(基于ab的膜融合蛋白)。t细胞与her2 car(4d5.bbz)或表1中列出的抗ny-eso-1和laco-stim的tcr通过rna电穿孔共表达，并且car/laco-stim表达通过流式细胞术进行检测。表1与car/tcr和laco-stim共转移t细胞
[0471]
对于与car和laco-stim共转移的所有t细胞，检测到car染色和与cd40-fc蛋白的结合(图2)。在incucyte活细胞分析系统中检测t细胞抗肿瘤功能，incucyte活细胞分析系统是一种实时定量活细胞成像和分析平台，能够对细胞随时间的变化的行为实现可视化和量化。pd1-cd28开关受体同样用作对照，pd1-cd28开关受体是一种融合蛋白，由pd1的胞外部分和cd28的胞内部分组成，以前用于挽救t细胞免受肿瘤免疫抑制(prosser me et al,molecular immunology(2012)51(3-4):263-272；ankri c et al.j immunol(2013)191(8):4121-4129；kobold s et al j natl cancer inst(2015)107(8)；liu x et al,cancer research(2016)76(6):1578-1590；schlenker r et al:cancer research(2017)77(13):3577-3590)。
[0472]
使用经hla-a2和ny-eso-1(a549-eso)转导的her2阳性癌细胞系a549作为靶向肿瘤细胞系，发现与单纯car或car与pd1-cd28开关共表达相比，与car和laco-stim分子(1412-t4-cd40l、1412-f2.103、1412-f5.157或1412-f5.77)共表达的t细胞显示出更好的控制肿瘤生长的能力，表明可溶形式的laco-stim为t细胞提供了额外的cd28信号传导用于进一步的t细胞激活、增殖和存活，从而提高了控制肿瘤生长的能力(图3)。当laco-stim与ny-eso-1 tcr共导入时，发现与单纯tcr或tcr与pd1-cd28共转移相比，所有的laco-stim分子都能帮助tcr t细胞进一步抑制肿瘤生长(图4)。5.8.3当肿瘤细胞表达cd40时，laco-stim的共表达进一步提高了car-t细胞控制肿瘤生长的能力
[0473]
在另一个实验中，用her2 car(4d5.bbz)和laco-stim构建体(检测中加入一些cd40l-cd28或抗cd40 scfv-cd28膜融合蛋白的新构建体)转移的t细胞，使用由cd40、或pd-l1或cd40 pd-l1转移的a549肿瘤细胞系进行检测。图5显示了转移的t细胞(transferred t cells)的car表达以及a549肿瘤细胞系上的cd40或pd-l1表达。通过elisa试验检测上述经肿瘤细胞系刺激的t细胞产生的细胞因子(ifn-γ和il-2),发现大多数测试的laco-stim能
显著促进her2 car t细胞产生ifn-γ(图6)和il-2(图7),尤其是在表达cd40的a549细胞系刺激下。cd40在某些癌症中表达，包括肺癌(图8)，并且据报道a549也表达cd40，这说明即使没有将cd40转移到a549细胞系，大多数laco-stim也能促进her2 car t细胞分泌比仅表达her2car的t细胞多得多的细胞因子。使用incucyte活细胞分析系统，将由4d5.bbz car和laco-stim共转移的t细胞(如表2所列举)在a549、a549-cd40、a549-pd-l1和a549-cd40/pd-l1四个不同的a549肿瘤细胞系上进行检测。表2 car和laco-stim与t细胞共转移ep#carlaco-stim1carf2.103.cd282carf5.157.cd283carf5.77.cd284carf2.103.bb5car1412-t4-cd40l6car1412-f5.1577carpd1-cd288carcar alone9t cell alone [0474]
当靶向表达pd-l1的a549肿瘤细胞系时，与单独表达car的t细胞相比，共表达laco-stim的cart细胞以及共表达pd1-cd28开关的cart细胞表现出更强的肿瘤抑制作用；并且共表达laco-stim的cart细胞，尤其是f5.77.28(ep3)和1412-t4-cd40l(ep5)，与共表达pd1-cd28开关(ep7)的cart细胞相比，显示出更强的肿瘤生长抑制活性(图9、10、11a和11b)。当a549细胞或表达cd40的a549细胞作为目标靶向肿瘤时，大多数共表达cd28-cd40laco-stim的cart细胞比仅表达car的t细胞显示出强的多的肿瘤抑制作用；而与仅表达car的t细胞相比，共表达pd1-cd28开关的cart细胞在肿瘤生长抑制方面的改善为零或极少(图9、10、12a、12b、13a和13b)。5.8.4共表达laco-stim的t细胞对肿瘤微环境抑制的抵抗
[0475]
本实验测试t细胞是否从laco-stim获得足够的共刺激信号，以克服肿瘤微环境相关的抑制，如pd1/pd-l1、treg和tgf-β(图14-17)。将car、laco-stim分子和pd1共同导入t细胞(表3，ep1至ep9)。未导入pd1的相同t细胞作为对照(表3，ep11至ep18)。表3 car、laco-stim和pd1共转移t细胞
fc、pd-l1-fc和/或cd40-fc的组织培养板(每种蛋白10ug/ml)之前，先将tgf-β添加到t细胞中。24h后，收获培养上清液，进行elisa以检测il-2。结果表明，当提供cd40信号时，laco-stim表达促进t细胞分泌高水平的il-2(图20)。
[0481]
在进一步的实验中，用来自三种不同抗cd40抗体(4d11、a40c和119)的scfv产生另一组cd40-cd28 laco-stim分子，并与4d5.bbz her2 car共同转移到t细胞中，以pd1-cd28和f5.77.cd28为对照。如图21a所示，当肿瘤细胞系a549表达cd40时，三种laco-stims(4d11.cd28、a40c.cd28和119.cd28)均增强了cart对肿瘤生长的抑制作用。当以a549-pd-l1细胞为靶点时，具有laco-stims的cart细胞(f5.77.cd28、a40c.cd28和119.cd28)对肿瘤生长有较强的抑制作用(图21b)。
[0482]
与表达cd40的a549细胞不同，pc3细胞被报道为cd40阴性。用pc3细胞进行另一组实验，以证实laco-stim的表达可以保护t细胞免受tme中免疫抑制效应的影响。将egfp转导的pc3细胞系与cd40，或pd-l1，或cd40和pd-l1进行共转移，以分别产生pc3-cd40、pc3-pd-l1和pc3-cd40-pd-l1。将t细胞与her2 car(4d5.bbz)和pd1-cd28开关受体或两个选定的laco-stim(f5.77.cd28和f2.103.cd28)共转移，并添加到上述pc3细胞中。一组仅用laco-stim分子f5.77.cd28转移的t细胞作为对照组进行实验。pc3肿瘤生长情况用incucyte实时图像系统监测。如图22a所示的阳性对照组，当pc3肿瘤表达pd-l1时，与单独的cart对照组相比，pd1-cd28开关受体的表达显著改善了cart的肿瘤生长控制。同时，表达laco-stim f5.77.cd28的cart细胞也表现出与具有pd1-cd28的cart细胞类似的有效的肿瘤生长控制。以pc3-cd40为靶细胞系时，具有f5.77.cd28的cart细胞的抑制肿瘤生长活性显著高于单独表达car的t细胞和其他组，包括具有pd1-cd28的cart(图22b)。当pc3同时表达pd-l1和cd40时，pd1-cd28和f5.77.cd28均显示出增强的肿瘤生长控制(图22c)。
[0483]
结果发现即使pc3中没有外源性cd40表达，f5.77.cd28 laco-stim也能增强cart控制肿瘤生长的能力(图22d)。结合f5.77.cd28laco-stim能提高cart针对pc3-pd-l1肿瘤的控制肿瘤生长能力的发现，这些结果表明t细胞-肿瘤相互作用后，肿瘤或t细胞可以被诱导表达cd40，并且诱导的cd40可以与laco-stim分子结合以提高t细胞功能。相反，pd1-cd28开关的表达似乎对cart细胞抑制肿瘤生长的能力几乎没有影响，除非靶细胞被改造以表达pd-l1，这表明尽管pd-l1可以被诱导表达，但该信号不足以使pd1-cd28开关提高t细胞在肿瘤生长控制中的活性。值得注意的是，在所有实验中，单独的f5.77.cd28表达(不含car)并不影响t细胞在肿瘤生长控制中的作用，表明单独的laco-stim不能非特异性激活t细胞。5.8.5 laco-stims促进t细胞增殖
[0484]
在表达laco-stims的t细胞中，观察到增加的t细胞存活和增殖有助于提高肿瘤生长控制。为了证实，用f5.157.cd28转移t细胞(单独的t细胞以及pd1-cd28为对照组)，并用包被有okt3抗体，或用pd-l1-fc或cd40-fc蛋白或其组合共同包被的平板刺激t细胞。在nuclight快速红试剂(rapid red reagent)存在的情况下，应用incucyte s3实时成像监测t细胞增殖。如图23和图24所示，单独的t细胞和表达pd1-cd28的t细胞中观察到相似的低水平t细胞增殖，其在仅okt3或okt3 cd40-fc的存在下，在一定程度上被刺激。用okt3 pd-l1-fc刺激表达pd1-cd28的t细胞，可进一步促进其增殖。与此相反，表达laco-stim f5.157.cd28的t细胞的增殖显著高于其他组，包括okt3 pd-l1刺激下表达pd1-cd28的t细胞，这表明laco-stim分子有效地促进了t细胞的增殖。
[0485]
在进一步的实验中，用于t细胞的慢病毒构建体产生了，以使t细胞永久表达cd19car和laco-stim(图25)。产生单独表达cd19 car(cd19.bbz)或表达cd19 car和pd1-cd28开关受体(cd19.bbz pd1-cd28)或表达cd19 car和laco-stim(cd19.bbz f5.157.cd28，图25)的慢病毒载体，并用于转导t细胞。以同时表达egfp和pd-l1的cd19阳性白血病细胞系(nalm6-gfp-pdl1)为靶细胞，在incucyte s3实时成像系统中检测转导t细胞对肿瘤生长的控制。如图26所示，与单纯用cd19 car转导的t细胞(cd19.bbz)相比，pd1-cd28和laco-stim f5.157.cd28均显著改善了白血病细胞系的生长控制，再次证实laco-stim表达可增强t细胞抑制pd-l1肿瘤生长的功能。5.8.6 laco-stims促进树突状细胞表位扩展
[0486]
本实验表明，cd28-cd40 laco-stims不仅提供了增加t细胞活性的阳性信号，而且通过与髓系细胞、巨噬细胞和树突状细胞上cd40的结合，促进这些细胞的成熟，并降低这些细胞的免疫抑制状态，从而激活这些细胞。此外，cd40与laco-stims t细胞产生的细胞因子和趋化因子的结合，促进了巨噬细胞和树突状细胞的交叉呈递能力(cross-presentation ability)，以增加表位扩展。
[0487]
在从hla-a201阳性供者培养的树突状细胞和用ny-eso-1 tcr转移的t细胞存在的情况下，将共转移her2 car和laco-stim的t细胞与共转移her2和ny-eso-1抗原的k562进行共培养。根据不同细胞的存在，培养物被分成三组(如图27所示)。共培养24h后，收获细胞，并进行流式细胞术分析以检测激活的ny-eso-1 tcr(vb8)阳性cd8 t细胞，即通过交叉呈递ny-eso-1的hla-a201阳性树突状细胞激活的t细胞，减去3～5％背景，该背景是激活的转移有her2的car t细胞。如图27所示，与单独的car或pd1-cd28开关受体和car一起相比，用laco-stim进行共转移的her2 car t细胞显示出显著增加的激活的ny-eso-1 tcr阳性cd8 t细胞数量，说明t细胞中laco-stim的表达通过与树突状细胞上的cd40结合，促进了肿瘤抗原与抗原特异性t细胞的交叉呈递。
[0488]
因此，如图28所示，laco-stims(如本发明公开的cd28-cd40融合蛋白)可以协调t细胞和apcs，促进和改善基因修饰的t细胞的抗肿瘤活性，通过提供更持久有效的治疗，为改善癌症患者的t细胞治疗提供了新途径。5.8.7 laco-stims促进modcs成熟并诱导巨噬细胞的m1转化
[0489]
用携带编码laco-stim a40c.cd28的多核苷酸序列(“a40c”；seq id no:105)、编码cd19 car的多核苷酸序列(fmc63.bbz；“fmc63”；seq id no:108)、编码msln car的多核苷酸序列(ss1.bbz；“ss1”；seq id no:109)、编码a40c-fmc63或a40c-ss1的多核苷酸序列的慢病毒载体转导t细胞。流式细胞术用于证实a40c、fmc63和ss1的表达，如图29所示。
[0490]
通过cd14阳性选择法从健康供体pbmcs中获得cd14 单核细胞。将筛选出的cd14 单核细胞接种于r10完全培养基、100ng/ml重组人gm
·
csf和20ng/ml重组人il-4中培养9天，以获得单核细胞来源的树突状细胞(“modcs”)。将筛选出的cd14 单核细胞接种于r10完全培养基和10ng/ml重组人gm
·
csf中培养7天，以获得m0巨噬细胞。
[0491]
将自体modcs与lps(10ng/ml)、utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19 t共培养24h。(modc:t＝1:5)。使用小鼠抗人cd11b、cd80、cd83、cd86和hla-dr对modcs进行染色，以测定用于modc的这些成熟标记物的水平。如图30所示，laco-stim t细胞介导modcs的成熟。
[0492]
细胞因子的分泌也表明了laco-stim car t细胞诱导的自体modcs的成熟和激活(图31)。将自体modcs与lps(10ng/ml)、utd、laco-stim t、car-cd19 t细胞或laco-stim-car-cd19 t细胞共培养24h。(modc:t＝1:5)。用elisa法检测上清液中il12p70、il2、ifnγ、tnf-α和il1β的分泌情况。结果表明，自体modcs与laco-stim t细胞共培养，尤其是与laco-stim-car-cd19 t细胞共培养，可诱导细胞因子的分泌。
[0493]
将自体m0巨噬细胞与lps(10ng/ml)、il-4(20ng/ml)、il-10(20ng/ml)、utd、laco-stim t细胞、car-cd19 t细胞、laco-stim-car-cd19 t细胞共培养24h(mac:t＝1:5)。然后用小鼠抗人cd11b、cd80、cd86、hla-dr、cd206、cd163染色对巨噬细胞进行表型分析。如图32所示，自体laco-stim t细胞和laco-stim-car-cd19 t细胞诱导m0巨噬细胞向m1表型转化，并且抑制其向m2表型转化。
[0494]
此外，通过将与lps(10ng/ml)、utd、laco-stim t细胞、car-cd19 t细胞或laco-stim-car-cd19 t(24h；mac:t＝1:5)共培养的自体巨噬细胞上清液进行elisa或biolegend’s legendplex多重检测，以评估细胞因子il1β、ifn-l1、ifn-l23、ifnβ和il-10的分泌。如图所示，自体巨噬细胞与laco-stim-car-cd19以共培养诱导细胞因子分泌(图33)。
[0495]
采用与phrodo red e.coli(k-12)共培养2h和流式细胞术检测与utd、laco-stim t细胞、car-cd19 t细胞、laco-stim-car-cd19 t细胞或laco-stim-car-meso t细胞共培养24h的自体单核细胞来源巨噬细胞的吞噬功能。如图所示，laco-stim、laco-stim-car-cd19和laco-stim-car-meso抑制巨噬细胞的吞噬功能(图34)。
[0496]
为了测量非cd19特异性肿瘤杀伤作用，将自体modcs与非cd19表达肿瘤细胞系(molm14-cbg)共培养24h；然后补充utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19 t。通过incucyte记录肿瘤细胞系的总绿色对象累积强度(integrated intensity)。如图所示，自体modc(s)与laco-stim-car-cd19共培养诱导非cd19特异性(molm14)杀伤(图35)。
[0497]
同样地，巨噬细胞也与molm14-cbg共培养24h；然后补充utd、laco-stim t、car-cd19 t或laco-stim-car-cd19 t。通过incucyte记录肿瘤细胞系的总绿色对象累积强度。如图所示，自体巨噬细胞与laco-stim-car-cd19共培养诱导非cd19特异性(molm14)杀伤(图36)。
[0498]
进一步证实了laco-stim-car-t细胞促进modcs成熟的活性。将自体modcs与肿瘤细胞系共培养24h，补充lps(10ng/ml)、utd、laco-stim t细胞、car-cd19 t细胞、laco-stim-car-cd19 t细胞，car-meso t细胞或laco-stim-car-meso t细胞共培养24h(modc:肿瘤细胞:t＝1:1:5)。用小鼠抗人cd11b、cd80、cd83、cd86和hla-dr对modcs进行染色。如图所示，laco-stim t细胞介导modcs的成熟；laco-stim-car-cd19和laco-stim-car-meso进一步刺激了成熟(图37)。也使用elisa评估上清液。如图所示，在与肿瘤细胞系和laco-stim t、laco-stim-car-cd19和laco-stim-car-meso共培养的modcs中，刺激了细胞因子的产生，包括il12、il2、ifnγ、tnf-α和il1β(图38a-38c)。
[0499]
还对癌症刺激后的巨噬细胞进行了表型分析。将自体m0巨噬细胞与肿瘤细胞系共培养24h，然后补充lps(10ng/ml)、il-4(20ng/ml)、il-10(20ng/ml)、utd、laco-stim t细胞、car-cd19 t细胞、laco-stim-car-cd19 t细胞，car-meso t细胞或laco-stim-car-meso t细胞共培养24h(mac:肿瘤细胞:t＝1:1:5)。用小鼠抗人cd11b、cd80、cd86、hla-dr、cd206、
cd163对巨噬细胞进行染色。如图39a-39b所示，自体巨噬细胞与肿瘤细胞系共培养后，laco-stim t、laco-stim-car-cd19和laco-stim-car-meso诱导m0巨噬细胞的m1转化，并且抑制m0巨噬细胞的m2转化。
[0500]
此外，通过将与肿瘤细胞系lps(10ng/ml)、utd、laco-stim t细胞、car-cd19 t细胞或laco-stim-car-cd19 t(24h；mac:t＝1:5)共培养的自体巨噬细胞上清液进行elisa或biolegend’s legendplex多重检测，以评估细胞因子il12p70,il2,ifnγ,tnf-α,gm-csf,il8,il1β,ifn-l1,ifn-l23,ifnβ和il-10的分泌。如图40a-40c所示，自体巨噬细胞与肿瘤细胞系共培养后，laco-stim-car-cd19 t诱导细胞因子分泌。5.8.8 tricd40l-cd28 laco-stim分子增强car t细胞分泌细胞因子和杀伤肿瘤作用
[0501]
t细胞与4d5-bbz her2 car(4d5)mrna、cd28-cd40双特异性ab(1412-4d11)、cd40l、cd40l trimer-cd28融合蛋白(tricd40l_8-28：cd40l trimer-cd8跨膜结构域和cd28胞质结构域，seq id no：199；tricd40l_28-28：cd40l trimer-cd28跨膜结构域和cd28胞质结构域，seq id no：201)、a40c-28laco-stim、和/或pd1-cd28开关受体(pd1-28)共电穿孔，如图所示。通过流式细胞术检测cd40l的表达，如图41所示。通过使用流式细胞术检测cd40-fc来测量cd40的结合，如图42所示。通过流式细胞术检测car的表达，如图43所示。
[0502]
将表达指定的cars、laco-stim、laco-stim-cars、其他分子或其他融合物的t细胞与表达或不表达cd40的肿瘤细胞系a549-eso共培养。通过elisa检测t细胞ifn-γ分泌和il-2分泌。如图44(ifn-γ)和图45(il-2)所示，laco-stim分子tricd40l_8-28、tricd40l_28-28或a40c-28的共表达分别刺激了与肿瘤细胞(表达或不表达cd40)共培养的car t细胞的ifn-γ分泌和il-2分泌。
[0503]
测量了与指定的cars、laco-stim、laco-stim-cars、其他分子或其他融合物共电穿孔的t细胞对表达或不表达cd40的肿瘤细胞系a549-eso的杀伤活性。如图46所示，laco-stim分子tricd40l_8-28、tricd40l_28-28或a40c-28的共表达分别显著增强了car t细胞的肿瘤杀伤作用。5.8.9 laco-stim分子增强靶向cd70的car-t细胞的肿瘤杀伤作用
[0504]
cd27是cd70的天然配体。在本研究中，构建了靶向cd70的cars，包括cd27 car(seq id no：203)和laco-stim(a40 c28)-cd27-car(seq id no：204)。如图47所示，cd27-car由cd27-全长(fl)和cd3的ζ结构域组成。a40c28-cd27-car由cd8α信号肽、a40c28、f2a、cd27-fl和cd3的ζ结构域组成。
[0505]
用0μg或10μg cd40 mrna电穿孔人肾癌来源的细胞786-o-cbg。通过使用pe-anti-cd40抗体，并用流式细胞术检测cd40的表达(图48a)。通过使用cd40-fc和pe-anti-cd40抗体，并用流式细胞术检测表达a40c28-cd27-car的t细胞中a40c28的表达(图48b，上图)。通过使用pe-anti-cd27抗体，并用流式细胞术检测cd27-car的表达(图48b，下图)。
[0506]
肿瘤细胞的cd70表达水平通过facs用pe-抗-cd70抗体染色肿瘤细胞来评估，如下表所示。结果是根据基因表达水平提出的。为进一步评价cd27-car和cd27 car laco的功能，对经cd27 car，或cd27 car a40c.28(cd27 car laco)转导的t细胞或未转导的t细胞(ntd)，使用不同的肿瘤细胞进行刺激，用pe-anti-cd107a和fitc-anti-cd8抗体染色来检测cd107a水平，并用facs分析cd107a水平。结果显示cd107a阳性t细胞在cd8阳性t细胞群中
no：105)mrna或开关受体pd1-28 mrna一起电穿孔t细胞。电穿孔后一天用抗小鼠igg fab抗体检测car表达，未电穿孔的t细胞作为阴性对照组(图53)。
[0511]
在表达所述cd19 car(fmc63.bbz)的cd3 t细胞中，通过流式细胞术测量cd107a的表达百分率，无论该cd3 t细胞是单独的或是与119-28、a40c-28或pd1-28一起，并与指定的肿瘤细胞系共培养4h。如图所示，表达cd19的肿瘤细胞nalm6、k-19和raji(不是k562(其不表达cd19))的刺激激活了cd19 car t细胞(图54)。
[0512]
同样采用elisa测定cd19 car t细胞分泌细胞因子的情况。用单独的cd19 car(fmc63.bbz)mrna或与119-28mrna,a40c-28mrna或pd1-28 mrna一起电穿孔t细胞。电穿孔后1天，car-t细胞与指定的肿瘤细胞系共培养过夜。测定培养物上清液中细胞因子的分泌情况。如图所示，与表达cd19的肿瘤细胞共培养刺激了表达fmc63.bbz的t细胞释放ifn-γ(图55a)和il2(图55b)，并且与laco-stim共表达进一步增强了这两种细胞因子的分泌(图55a和55b)。
[0513]
采用基于阻抗的实时细胞毒性实验评估表达cd19的a549肿瘤细胞与多种cd19 car-t细胞共培养时的杀伤活性。用2μg cd19 mrna电穿孔a549肿瘤细胞，并且与经电穿孔的t细胞以e：t比为10：1共培养60h，所述经电穿孔的t细胞是指：单独使用cd19 car(fmc63.bbz)mrna进行电穿孔或者同时使用cd19 car(fmc63.bbz)mrna与119-28,a40c-28mrna或者pd1-28 mrna共同进行电穿孔的t细胞。如图56所示，cd19 car t细胞抑制了表达cd19的a549肿瘤细胞的生长，并且laco-stim的共表达导致了强烈的抑制作用。
[0514]
同时采用小鼠模型测量表达cd19 car的t细胞(有或没有laco-stim)的抗肿瘤作用。具体而言，通过电穿孔法修饰有cd19 car(fmc63.bbz)的t细胞或修饰有cd19 car和laco(fmc63.bbz a40 c-28)的t细胞在植入有raji-cbg的nsg小鼠中进行检测。小鼠在第1天植入raji-cbg肿瘤细胞(1e6cell/mouse，i.v.)。在raji-cbg肿瘤以2e7/mouse的剂量接种后的第4天和第9天，用t细胞(i.v.)处理小鼠。用非转导t细胞或pbs处理的小鼠作为对照组。在肿瘤接种后的指定时间对小鼠进行拍照。如图57所示，cd19 car-t细胞诱导移植有raji-cbg的nsg小鼠晚期肿瘤消退，并且laco-stim的共表达进一步增强了car-t细胞的抗肿瘤作用。
[0515]
cd19 car和laco-stim也可以通过慢病毒载体转导到t细胞。用携带cd19 car(fmc63.bbz)、fmc63.bbz-a40c-28、fmc63.bbz-119-28或pd1-28的慢病毒载体转导t细胞，并且用抗小鼠igg fab抗体检测car的表达，并且用cd40-fc检测a40c-28和119-28的表达(图58)。5.8.11 laco-stim的共表达提高靶向bcma的car-t细胞的肿瘤杀伤作用
[0516]
生成的bcma31 car t细胞、laco-bcma31 cart细胞、bcma31-laco cart细胞和b38m car t如下。首先，生成慢病毒并转导至t细胞以表达bcma31.bbz(seq id no：205)，laco-bcma31.bbz(seq id no：206)、bcma31-laco.bbz(seq id no：207)和b38m.bbz。car和laco-stim在t细胞中的表达得以证实(图59a-59b)。如图所示，laco-bcma31 cart细胞的扩增比bcma31 cart细胞和b38m cart细胞快得多(图60a)，并且bcma31和b38m cart细胞的大小大于laco-bcma31和ntd t细胞(图60b)。
[0517]
我们将这些t细胞与一组肿瘤细胞共培养，并检测t细胞产生inf-γ和il-2的情况。当与jeko-1和raji共培养时，laco-bcma31产生的il-2明显多于其他种类t细胞(图
ug间皮素mrna电穿孔的不同的癌细胞(包括h226、ovcar3和molm14)以e/t比值＝2:1共培养。如图67所示，m12 cart细胞和m12 a40c28 cart细胞都对表达间皮素的癌细胞有较强的杀伤作用，并且a40c28的共表达大大提高了杀伤效率。
[0525]
第二laco分子(1412-4d11；seq id no:211)也被制备并用于研究。制备了各种以mrna为基础的抗间皮素cart细胞，包括模拟(mock)t细胞(no ep)、m12 cart细胞、m12 1412-4d11 cart细胞、m32 cart细胞和m32 1412-4d11 cart细胞。将这些cart细胞与使用0μg或2μg间皮素mrna电穿孔的a549-gfp肿瘤细胞以e/t比值＝10:1共培养。如图68所示，m12和m32 cart细胞对表达间皮素的a549肿瘤细胞均有明显杀伤作用(2μg组)，并且1412-4d11的共表达大大提高了cart细胞的杀伤效率。5.8.13 laco-stim共表达提高靶向cd123的car-t细胞的肿瘤杀伤作用
[0526]
在肿瘤杀伤试验中测定所提供的cd123 carts细胞的杀伤活性。本研究采用laco分子a40c28。各种以mrna为基础的抗cd123 cart细胞(包括模拟(mock)t细胞(noep)、表达c5 car、c5 car和a40c28、c7 car、c7 car和a40c28、c11 car、c11 car和a40c28的t细胞)与肿瘤细胞molm-14、nalm6、jeko-1以e/t比值为10:1共培养。如图69所示，laco(a40c28)的共表达提高了所提供的cart细胞对所有肿瘤细胞的杀伤效率。
[0527]
使用0、0.1μg或10μg的cd123 mrna电穿孔的a549细胞进一步检测所提供的cd123 carts细胞的杀伤活性。如图70所示，cd123在a549细胞中的异位表达水平与cd123 carts对这类肿瘤的杀伤活性有关。同样，laco的共同表达持续增强了cart细胞的抗肿瘤作用(图70)。
[0528]
在cart杀伤试验中通过elisa检测ifn-γ释放。如图71所示，表达cd123的癌细胞，如molm14细胞，尤其是aml细胞(patient-001)促进cart细胞释放ifn-γ；并且laco(a40c28)的共表达进一步增强了这种释放。5.8.14 laco-stim共表达增强表达bite的t细胞的激活
[0529]
使用如下表5所示的mrna电穿孔的t细胞。表5使用各种mrna电穿孔的t细胞
car转移的t细胞与可溶性用laco-stim 4d11-1412转移的t细胞(#15)混合后，il-2分泌水平高于单纯的用cd19 car转移的t细胞(#6)，证明可溶性laco-stim可以负载到cart细胞并且增强cart细胞的功能。
[0533]
gfp和her2 bite(4d5-6-cd3)或car(4d5.bbz)在上表5所述的t细胞中的表达通过流式细胞术检测，如图76所示。用her2阳性肿瘤细胞系sk-ov3刺激这些t细胞。如图77所示，在#2和#7中可见到强烈的cd107a上调，其用her2 bite(4d5-6-cd3)或her2 car(4d5.bbz)转移，并且呈gfp阴性。用laco-stim(a40 c-28或4d11-1412)和gfp(#3和#4)转移的t细胞或单独用gfp(#5)转移的t细胞不能被sk-ov3激活，因此cd107a阴性。当这些gfp阳性t细胞(包括表达laco的t细胞)与表达bites(4d5-6-cd3)的t细胞混合时，它们变得具有肿瘤反应性，表现为高cd107a表达(#10、#12和#14)，因为从转移有4d5-6-cd3的t细胞分泌的bite加载到这些gfp阳性t细胞上。通过比较，当这些表达laco的gfp阳性t细胞与表达her2car(#16)的t细胞混合时，没有观察到这种效果。同样，这些结果表明，表达laco-stim的t细胞可以负载bites，证明表达laco-stim的t细胞可以与bite或表达bite的t细胞结合使用。
[0534]
通过elisa测定上文表5中描述的用her2阳性肿瘤细胞系sk-ov3刺激的t细胞的il-2分泌情况。如图78所示，用laco-stim(a40c-28或4d11-1412)和gfp(#3和#4)转移的t细胞或单独用gfp(#5)转移的t细胞没有il-2分泌。当这些gfp阳性t细胞与表达bites的t细胞(4d5-6-cd3)混合时，gfp阳性t细胞分泌高水平的il-2(#10和#12)。与仅用gfp转移的t细胞(#14)相比，用gfp和laco-stim转移的t细胞(#10和#12)分泌更高水平的il-2。这些结果也表明，bite负载的转移有laco-stim的t细胞的功能优于bite负载的但不含laco-stim的的t细胞。另外，当转移有her2 car的t细胞与可溶性转移有aco-stim 4d11-1412(#16)的t细胞混合后，其il-2分泌水平高于仅用her2 car转染的t细胞(#7)，证明可溶性laco-stim可负载于cart细胞，并且增强cart细胞功能。
[0535]
综上所述，这项研究证实，当表达laco的t细胞与bite或表达bite的t细胞联合使用时，可以实现协同效应。6.以电子方式提交的序列表参考
[0536]
本技术通过引用引入与本技术一起创建于2021年8月15日、大小为577,971字节的ascii文本文件"613a001wo02_st25.txt"的序列表。