减少模板穿入纳米孔的组合物的制作方法

1.本技术涉及在通过纳米孔连接的聚合酶进行链聚合期间减少或阻断有害模板穿入的组合物，以及在基于纳米孔的核酸检测技术(诸如纳米孔测序)中使用该组合物的方法。


背景技术：

2.纳米孔单分子边合成边测序(“sbs”)使用与纳米孔共价连接的聚合酶(或其他扩链酶)来合成与靶序列模板互补的dna链(即拷贝链)，并同时检测将每个核苷酸单体添加到该生长链中时的身份。参见例如美国专利公开第2013/0244340 a1、2013/0264207 a1、2014/0134616 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1号，并公开了国际申请wo 2019/166457 al。通过监测由于在合成拷贝链时穿过位于聚合酶活性位点附近的纳米孔的离子流的变化引起的信号来检测每个添加的核苷酸单体。获得准确、可再现的离子流信号需要将聚合酶活性位点定位在纳米孔附近，以便允许附接至每个添加的核苷酸的标签部分进入并改变穿过纳米孔的离子流。为了获得最佳性能，标签部分应在纳米孔中停留足够长的时间，以提供与改变穿过纳米孔的离子流(相对于基线“开放电流”流)相关的可检测、可识别和可再现的信号，使得与标签相关的特定核苷酸可以明确地区分与sbs溶液中的其他带标签的核苷酸。
3.kumar et al.，(2012)“peg-labeled nucleotides and nanopore detection for single molecule dna sequencing by synthesis，”scientific reports，2：684；doi：10.1038/srep00684描述了使用纳米孔来区分通过末端5
′‑
氨基磷酸酯连接到dg核苷酸的四种不同长度的peg-香豆素标签，并分别证明了这四种peg-香豆素标记的dg核苷酸通过dna聚合酶的有效和准确掺入。另见美国专利申请公开2013/0244340 a1、2013/0264207 a1、2014/0134616 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1。
4.wo 2013/154999和wo 2013/191793描述了用于纳米孔sbs的带标签的核苷酸的用途，并公开了附接至包含支链的peg链的单个标签的单个核苷酸的可能用途。
5.wo 2015/148402描述了用于纳米孔sbs带标签的核苷酸的用途，其包含连接到单个标签的单个核苷酸，其中该标签包含具有30个单体单元或更长的长度的一系列寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)中的任一种。
6.us 9410172 b2描述了用于等温核酸扩增的方法和试剂盒，其使用寡阳离子-寡核苷酸缀合物引物来扩增靶核酸。所公开的方法使用链置换dna聚合酶和聚胺寡核苷酸缀合物引物。
7.已经开发出纳米孔α-溶血素(“α-hl”)的“宽孔”突变体，该突变体用于纳米孔装置并暴露于用于进行高通量纳米孔测序的电化学条件下时，展现出更长的寿命。参见例如wo 2019/166457 a1，2019年9月6日公布。更长的纳米孔寿命提供更大的读段长度和测序的整体准确性。在结构上，宽孔突变体被设计成有效地消除天然发生的收缩位点(即孔的最窄部分)，该位点位于距离孔顺式开口约40埃的深度处，并且其具有约10埃的直径。宽孔突变产
生了位于孔的更深处的新的收缩位点，距顺式开口约65埃，并且更宽-直径约13埃。
8.尽管具有提高寿命的优点，但宽孔α-hl纳米孔在用于纳米孔sbs时仍然会遭受有害的停止事件。这些有害事件被认为是由于模板链穿入附近的纳米孔并在聚合进行时干扰标签部分的进一步检测。该模板穿入现象导致纳米孔sbs的序列读段缩短和通量总体降低。
9.因此，仍然需要在使用纳米孔时减少或防止有害模板穿入并由此产生高通量纳米孔检测技术(诸如核酸sbs)效率提高的组合物和方法。


技术实现要素：

10.在至少一个实施方案中，本公开提供了一种包含式(i)化合物的组合物：
[0011]5′‑
[封闭部分]-[引物]-3
′
[0012](i)[0013]
其中，封闭部分包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团；并且引物包含能够通过连接到纳米孔的聚合酶引发拷贝链的聚合的寡核苷酸。
[0014]
在组合物的至少一个实施方案中，式(i)化合物包含选自以下的化合物：
[0015]
(a)式(ia)化合物：
[0016][0017]
其中n为1至10；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；
[0018]
(b)式(ib)化合物：
[0019][0020]
其中n为1至10；且r独立地选自o-、ch3和h；
[0021]
(c)式(ic)化合物：
[0022][0023]
其中n为1至10；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；
[0024]
(d)式(id)化合物：
[0025][0026]
其中，n为1至10；b为经修饰的核碱基；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；或者
[0027]
(e)根据权利要求1所述的化合物，其中式(i)化合物包含式(ie)化合物：
[0028][0029]
其中n为1至10；b为经修饰的核碱基；且r独立地选自o-、s-、ch3和h。
[0030]
在组合物的至少一个实施方案中，式(i)化合物进一步包含连接至封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签。
[0031]
在至少一个实施方案中，本公开提供了一种包含式(ii)化合物的组合物：
[0032]5′‑
[生物素标签]-[封闭部分]-[引物]-3
′
[0033]
(ii)
[0034]
其中，生物素标签包含生物素标签；封闭部分包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团；并且引物包含能够通过连接到纳米孔的聚合酶引发拷贝链的聚合的寡核苷酸。
[0035]
在组合物的至少一个实施方案中，式(ii)化合物包含选自以下的化合物：
[0036]
(a)式(iia)化合物：
[0037]
[0038]
其中n为1至10；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；
[0039]
(b)一种式(iib)化合物：
[0040][0041]
其中n为1至10；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；
[0042]
(c)一种式(iic)化合物：
[0043][0044]
其中n为1至10；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；
[0045]
(d)一种式(iid)化合物：
[0046][0047]
其中，n为1至10；b为经修饰的核碱基；且r独立地选自o-、s-、ch3和h；或者
[0048]
(e)一种式(iie)化合物：
[0049][0050]
其中n为1至10；b为经修饰的核碱基；且r独立地选自o-、s-、ch3和h。
[0051]
在包含式(ii)化合物的组合物的至少一个实施方案中，生物素标签包含式(iii)的结构：
gen1氨基]-[引物]-3
′
和5
′‑
(苝-du)-[引物]-3
′
。
[0068]
在包含式(i)或式(ii)化合物的组合物的至少一个实施方案中，引物包含：
[0069]
(a)至少9聚体、至少12聚体或至少15聚体的寡核苷酸；
[0070]
(b)锁核酸；
[0071]
(c)选自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺和硼磷酸酯的键；和/或
[0072]
(d)选自以下的序列：aacggaggaggagga(seq id no：10)、aacggaggaggaggacgta(seq id no：11)、taa^cgga^gga^gga^gga-3
′
(seq id no：12)和aacggaggagga*g*g*a-3
′
(seq id no：13)。
[0073]
在包含式(i)或式(ii)化合物的组合物的至少一个实施方案中，所述化合物选自：
[0074]
[0075][0076]
在包含式(i)或式(ii)化合物的组合物的至少一个实施方案中，所述组合物还包含连接至纳米孔的聚合酶；任选地，其中聚合酶是pol6聚合酶；任选地，其中纳米孔是宽孔突变体α-hl纳米孔；任选地，其中宽孔突变体α-hl纳米孔选自p-01、p-02、p-03、p-04、p-05、p-05、p-06、p-07、p-08、p-09、p-10、p-11和p-12。
[0077]
在包含式(i)或式(ii)化合物的组合物的至少一个实施方案中，所述化合物：
[0078]
(a)能够通过与纳米孔连接的聚合酶引发拷贝链的聚合，该纳米孔具有至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或更长的读段长度；和/或
[0079]
(b)能够以小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或更低的模板穿入率通过与纳米孔连接的聚合酶引发拷贝链的聚合。
[0080]
在至少一个实施例中，本公开提供了一种纳米孔组合物，其包含：具有在膜的顺式侧和反式侧上的电极的膜；其孔延伸穿过膜的纳米孔；位于纳米孔附近的活性聚合酶；包含与两个电极接触的离子的电解质溶液；以及式(i)和/或式(ii)化合物；任选地，其中纳米孔是宽孔突变体α-hl纳米孔，和/或聚合酶是pol6聚合酶。
[0081]
在至少一个实施例中，本公开提供了一种试剂盒，包括：纳米孔装置，其包括在膜的顺式侧和反式侧具有电极的膜、其孔延伸穿过膜的纳米孔、以及位于纳米孔附近的活性聚合酶、四个带标签的核苷酸的组以及包含式(i)或式(ii)化合物的组合物。
[0082]
在至少一个实施方案中，本公开提供了一种用于测定核酸序列的方法，所述方法包括：(a)提供纳米孔组合物，其包含：膜、在膜的顺式侧和反式侧上的电极、其孔延伸穿过膜的纳米孔、位于纳米孔附近的活性聚合酶、与两个电极接触的包含离子的电解质溶液和包含式(i)或式(ii)化合物的组合物；(b)使(a)的纳米孔组合物与以下项接触：(i)核酸；以及(ii)四个带标签的核苷酸的组，每个都能够充当聚合酶底物，并且每个都连接到不同的标签，所述不同的标签导致当所述标签进入所述纳米孔时，穿过所述纳米孔的离子流发生不同变化；以及(c)检测不同的标签随时间推移进入纳米孔中导致的离子流的不同变化，并且与聚合酶并入的与核酸序列互补的不同的化合物中的每一者相关联，从而测定核酸序列。
附图说明
[0083]
图1描绘了用于修饰具有叠氮苝大体积基团的寡核苷酸内的炔基-du核苷单元的示例性cuaac反应方案。
[0084]
图2描绘了用于制备穿入阻断剂引物5
′‑
(生物素)-(sp18)-ttttuuuttt-(t＊-[phe(4-no2)-εlys-(lys)8])-aacggaggaggagga-3
′
的示例性cuaac反应，其中封闭部分包含经8碳接头炔基修饰的单个du核苷，所述8碳接头炔基经由cuaac化学与8赖氨酸聚阳离子基团[phe(4-no2)-εlys-(lys)8]进一步碱基修饰。
[0085]
图3描绘了穿入阻断剂引物5
′‑
(生物素)-(sp18)-ttttuuuttt-(t＊-[phe(4-no2)-εlys-(lys)
12
])-aacggaggaggagga-3
′
的示意结构，其中，封闭部分包含经由cuaac化学用12赖氨酸聚阳离子基团[phe(4-no2)-εlys-(lys)
12
]进行碱基修饰的单个t核苷，以及连接至封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签，其中生物素标签包含接头，所述接头包含sp18间隔子和ttttuuuttt可裂解寡核苷酸。
[0086]
图4描绘了穿入阻断剂引物的示意结构，5
′‑
(生物素)-(sp18)-ttttuuuttt-(t＊-[pamam gen1氨基])-aacggaggaggagga-3
′
，其中封闭部分包含经由cuaac化学用聚阳离子“pamam gen1氨基”基团进行碱基修饰的单个t核苷，以及连接至封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签，其中生物素标签包含接头，所述接头包含sp18间隔子和ttttuuuttt可裂解寡核苷酸。
具体实施方式
[0087]
对于本文和所附权利要求中的描述，单数形式“一个”和“一种”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。因此，例如，提到“一种蛋白质”包括超过一种蛋白质，并且提到“一种化合物”是指超过一种化合物。“包含”和“包括”可互换使用，并且不旨在限制。应进一步理解，如果对多个实施例的描述使用了术语“包含”，本领域技术人员应理解，在一些特定情况下，可使用语言“基本上由
…
组成”或“由
…
组成”替代性地描述实施例。
[0088]
若提供数值的范围，则除非上下文另外明确规定，否则应理解为，介于该范围上限与下限之间的该数值的每个中间整数和该数值的每个中间整数的每十分之一(除非上下文另外明确规定)以及所指定范围内的任何其他指定值或中间值，为本发明所涵盖。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小范围内，并且也为本发明所涵盖，以所指定范围内任何明确排除的限制为准。若所指定范围包括一个或两个限值，则排除那些所包括限制中的(i)任意一个或(ii)两个的范围也包括在本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。
[0089]
应理解，前述通用性说明(包括附图)和下述详细说明两者均为示例性的且仅为解释性的，并且不是对本公开的限制。
[0090]
定义
[0091]
如本文所用，“核苷”是指包含连接至糖部分(例如，核糖或脱氧核糖)的天然出现或非天然出现的核碱基的分子部分。
[0092]
如本文所用，“核苷酸”是指核苷-5
′‑
寡磷酸化合物或核苷-5
′‑
寡磷酸的结构类似物。示例性的核苷酸包括但不限于，核苷-5
′‑
三磷酸酯(例如，datp、dctp、dgtp、dttp和dutp)；具有长度为4个或更多个磷酸酯的5
′‑
寡磷酸酯链(例如，5
′‑
四磷酸酯、5
′‑
五磷酸
酯、5
′‑
六磷酸酯、5
′‑
七磷酸酯、5
′‑
八磷酸酯的核苷(例如，da、dc、dg、dt和du)；以及核苷-5
′‑
三磷酸酯的结构类似物，其可具有修饰的核酸碱基部分(例如，取代的嘧啶核碱基，例如5-乙炔基-du)、修饰的糖部分(例如，o-烷基化的糖，或2
′‑4′“
锁”核糖)和/或修饰的寡磷酸酯部分(例如，包含硫代磷酸酯、亚甲基和/或其他磷酸酯间桥的寡磷酸酯)。
[0093]
如本文所用，“核酸”是指一个或多个核酸亚基的分子，该核酸亚基包含核酸碱基即腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体中的一种。核酸可以指核苷酸(例如，damp、dcmp、dgmp、dtmp)的聚合物，还可以指多核苷酸，并且核酸包括单链形式和双链形式的dna、rna及其杂合物。
[0094]
如本文所用，“寡核苷酸”是指包含核苷酸寡聚物的分子部分。其意图为，“寡核苷酸”可以指包含核苷酸的寡聚物的分子部分，该寡聚物还包括一个或多个不是核苷酸的单体单元(例如，间隔子(诸如，spc2、spc3、dsp、sp18)或大基团(诸如，精胺、芘))。“寡核苷酸”还旨在可以指在单体单元之间包含磷酸二酯键和/或其他非天然键(例如，硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、硼磷酸酯)的分子部分。
[0095]
如本文所用，“寡磷酸盐”是指包含磷酸基寡聚物的分子部分。例如，低聚磷酸盐可包含2至20个磷酸盐的寡聚物、3至12个磷酸盐的寡聚物、3至9个磷酸盐的寡聚物。
[0096]
如本文所用，“聚合酶”是指能够催化聚合反应诸如核苷酸单体的聚合以形成核酸聚合物的任何天然或非天然出现的酶或其他催化剂。术语聚合酶包括多种扩链酶，包括但不限于dna聚合酶、rna聚合酶和逆转录酶。可用于本公开组合物和方法中的示例性聚合酶包括核酸聚合酶，诸如dna聚合酶(例如，ec 2.7.7.7类的酶)、rna聚合酶(例如，ec 2.7.7.6类或ec 2.7.7.48类的酶)、逆转录酶(例如，ec 2.7.7.49类的酶)和dna连接酶(例如，ec 6.5.1.1类的酶)。
[0097]
如本文所用的“读段长度”是指扩链酶(例如聚合酶)在从模板解离之前以模板依赖性方式掺入核酸链中的核苷酸数。
[0098]“模板dna分子”和“模板链”在本文中可互换使用，是指被扩链酶(例如，dna聚合酶)用于合成互补核酸链(或拷贝链)的核酸分子链，例如，在引物延伸反应中。
[0099]
如本文所用的“模板依赖性方式”是指引物分子通过扩链酶(例如，dna聚合酶)的延伸，其中新合成的链的序列由众所周知的互补碱基配对规则决定模板链(参见，例如，watson，j.d.et al.，in：molecular biology of the gene，4th ed.，w.a.benjamin，inc.，menlo park，calif.(1987))。
[0100]
如本文所用的“引物”是指寡核苷酸，无论是天然出现的还是合成产生的，其能够在合适的条件下充当扩链酶(例如，dna聚合酶)的模板依赖性核酸合成的起始点用于合成与模板链(或拷贝链)互补的引物延伸产物，例如，在核苷酸存在下、在合适的缓冲液中和在合适的温度下。引物长度可以取决于模板链的目标序列的复杂性，引物寡核苷酸通常包含15-25个核苷酸，尽管它可能包含更多或很少的核苷酸。
[0101]
如本文所用的“酶-纳米孔复合物”是指与扩链酶例如dna聚合酶(例如变体pol6聚合酶)缔合、偶联或连接的纳米孔。在一些实施方案中，纳米孔可以可逆地或不可逆地结合至扩链酶。
[0102]
如本文所用，“部分”是指分子的一部分。
[0103]
如本文所用，“接头”是指在两个或更多个分子、分子基团和/或分子部分之间提供
具有一定空间的键合附接的任何分子部分。
[0104]
如本文所用，“标签”是指部分或分子的一部分，其使得具有增强或直接或间接地检测和/或鉴定与该标签偶联的分子或分子复合物的能力。例如，标签可提供可检测的性质或特征，诸如空间体量或体积、静电电荷、电化学电势和/或光谱标志。
[0105]
如本文所用，“纳米孔”是指形成在或以其他方式提供在膜或其他屏障材料中的孔隙、隧道或通道，其具有约1埃至约10,000埃的特征宽度或直径。纳米孔可由天然存在的成孔蛋白(诸如，来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的α-溶血素)或野生型成孔蛋白的突变体或变体组成，该突变体或变体可以是非自然存在(即，经工程化)的(诸如，α-hl-c46)或天然存在的。膜可以是有机膜诸如脂质双层，或由非天然出现的聚合性材料制作的合成膜。纳米孔可以设置成邻近或靠近传感器、传感电路或与传感电路(诸如，举例而言，互补金属氧化物半导体(cmos)或场效应晶体管(fet)电路)偶联的电极。
[0106]
如本文所用，“宽孔突变体”是指经工程设计具有直径约13埃的收缩位点的纳米孔，该收缩位点位于深度约65埃处，当其嵌入膜中时，从孔的顺式侧的最宽部分测量。如本文别处所公开的，示例性的宽孔突变体包括α-hl七聚体，其包含6∶1比率的突变体α-hl亚基。
[0107]
如本文所用，“纳米孔可检测的标签”是指一种标签，其可以进入纳米孔、变成被定位在纳米孔中、被纳米孔捕获、转运通过纳米孔和/或穿过纳米孔，并因此造成穿过该纳米孔的电流的可检测的变化。示例性的纳米孔可检测的标签包括但不限于，天然聚合物或合成聚合物，诸如聚乙二醇、寡核苷酸、多肽、碳水化合物、肽核酸聚合物、锁核酸聚合物，其任一者都可以可选地以化学基团修饰或与化学基团链接，该化学基团可导致可检测的纳米孔电流变化，诸如染料部分或荧光团。
[0108]
如本文所用，“离子流动”是由于电动势诸如阳极与阴极间的电势造成的离子运动(典型是在溶液中)。典型地，离子流动可测量为电流或静电势的衰减。
[0109]
如本文所用，在纳米孔检测的语境中，“离子流动改变”是指导致穿过纳米孔的离子流动相对于穿过处于其“开放隧道”(o.c.)状态的该纳米孔的离子流动减少或增加的特征。
[0110]
如本文所用，“开放隧道电流”、“o.c.电流”或“背景电流”是指，当施加电势并且纳米孔开放(例如，纳米孔中没有标签存在)时，跨该纳米孔测量的电流水平。
[0111]
如本文所用，“标签电流”是指当施加电势并且标签存在于纳米孔中时，跨该纳米孔测量的电流水平。例如，取决于标签的特定特征(例如，整体电荷、结构等)，标签在纳米孔中的存在可减少穿过该纳米孔的离子流，并因此导致所测量的标签电流水平降低。
[0112]
各种实施例的详细描述
[0113]
a.穿入阻断剂引物化合物
[0114]
本公开提供了已被优化以在用作引物时减少有害模板穿入的化合物，其中扩链酶(例如，聚合酶)位于纳米孔(例如α-溶血素)附近。这些化合物可用于基于纳米孔的方法来检测和/或测序核酸，该方法利用标记核苷和位于纳米孔附近的扩链酶，诸如聚合酶。
[0115]
通常，基于纳米孔的核酸检测和/或测序使用位于膜包埋纳米孔(例如，α-hl)附近的扩链酶(例如，pol6 dna聚合酶)和可以通过扩链酶掺入到正在生长的链中的四种核苷酸类似物(例如，da6p、dc6p、dg6p和dt6p)的混合物。每个核苷酸类似物都有一个共价连接的
标签部分，当用纳米孔检测时，该标签部分提供可识别和可区分的特征。扩链酶形成模板核酸链和引物的复合物，并特异性结合与模板核酸链互补的带标签的核苷酸类似物。然后，扩链酶将带标签的核苷酸类似物的核苷酸部分催化偶联(即，掺入)到引物的3
′‑
末端。催化掺入事件的完成导致标签部分的释放，然后该标签部分穿过相邻的纳米孔。然而，即使在它经历将其从掺入的核苷酸中释放出来的催化过程之前，a的标签部分就进入了嵌入膜的纳米孔的孔中。当纳米孔处于外加电位下时，标签部分的这种进入会改变通过纳米孔的离子流并提供可检测的标签电流信号。
[0116]
包括与膜包埋的纳米孔相邻的扩链酶的多种纳米孔系统以及将它们与引物和带标签的核苷酸一起用于核酸测序的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公开2009/0298072 a1、2013/0244340 a1、2013/0264207 a1、2014/0134616 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1，以及公开的国际申请wo 2013/154999、wo2015/148402、wo 2017/042038和wo 2019/166457 a1，其各自通过引用整体并入本文。
[0117]
如上文描述和本文其他地方所述，带标签的核苷酸的掺入也导致核酸链的延伸。在与纳米孔相邻的聚合酶的情况下，并且不打算通过机制结合，据信延伸的链可以穿入附近的纳米孔并在聚合进行时干扰标签部分的进一步检测。此外，据信这种模板穿入现象可导致使用纳米孔进行核酸检测和/或测序的序列读段缩短和总体通量降低。本公开的出人意料的结果和出人意料的优势在于，使用包含某些结构(例如封闭部分)的引物可以减少或防止有害的模板穿入，并大大提高了使用纳米孔进行核酸检测和/或测序的通量。
[0118]
通常，本公开的穿入阻断剂引物包含式(i)化合物：
[0119]5′‑
[封闭部分]-[引物]-3
′
[0120](i)[0121]
其中封闭部分包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团；引物包含寡核苷酸，该寡核苷酸能够通过与纳米孔连接的聚合酶引发拷贝链的聚合。可用作本公开的穿入阻断引物的封闭部分的示例性聚阳离子基团、大体积基团和碱基修饰的核苷在本文包括实施例中进一步描述。
[0122]
式(i)的穿入阻断剂引物化合物的另外的实施方案通过如下文公开的一系列子结构和其他性质来描述并且包括实施例中描述的具体实施方案。
[0123]
考虑使用本领域众所周知的寡核苷酸合成将封闭部分连接到引物的5
′‑
末端。此类方法允许在封闭部分与引物之间形成磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、h-膦酸酯键或膦酸甲酯键。因此，在一些实施方案中，式(i)的穿入阻断引物包含式(ia)化合物
[0124][0125]
其中，n为1至10，并且r独立地选自o-、s-、ch3和h。在一些实施例中，r为o-并且该键为磷酸二酯，即，封闭部分为磷酸二酯连接的到引物的5
′‑
末端。
[0126]
如上文对于式(i)引物化合物(式(ia)化合物为该引物化合物的子结构)所述，式(ia)引物化合物的封闭部分可以包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团；并且引物包含能够通过连接到纳米孔的聚合酶引发拷贝链的聚合的寡核苷酸。然而，如式(ia)所示，进一步预期封闭部分涵盖封闭部分基团的寡聚物，诸如聚阳离子基团或大体积基团，并且此类寡聚物可以包含磷酸二酯、硫代磷酸酯、h-膦酸酯或膦酸甲酯键。如本文其他地方所述，这些寡聚封闭部分可以使用市售的试剂和标准的自动化寡核苷酸合成技术来进行制备。
[0127]
在一些实施例中，式(i)或(ia)的穿入阻断剂引物包含式(ib)化合物
[0128][0129][0130]
其中，n为1至10，并且r独立地选自o-、s-、ch3和h。在本文中(包括在实例中)进一步描述了示例性聚阳离子基团。
[0131]
在一些实施例中，式(i)或(ia)的穿入阻断剂引物包含式(ic)化合物
[0132][0133]
其中，n为1至10，并且r独立地选自o-、s-、ch3和h。在本文中(包括在实例中)进一步描述了示例性大体积基团。
[0134]
如上所述，预期式(i)或(ia)的穿入阻断剂引物的封闭部分可包含碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团。在一些实施例中，式(i)的穿入阻断剂引物包含式(id)化合物：
[0135]
[0136]
其中，b为修饰的核碱基，r独立地选自o-、s-、ch3和h，并且n为1至10。
[0137]
在一些实施例中，式(i)的穿入阻断剂引物包含式(ie)化合物：
[0138][0139]
其中，b为修饰的核碱基，r独立地选自o-、s-、ch3和h，并且n为1至10。在式(id)和(ie)的穿入阻断剂引物的一些实施例中，封闭部分包含不是寡聚的并且包含单个碱基修饰的核苷。在本文中(包括在实例中)进一步描述了示例性碱基修饰的核苷。
[0140]
在一些实施例中，本公开提供了式(i)或(ia)至(ie)的穿入阻断剂引物化合物，其中化合物选自表1中列出的那些。
[0141]
表1：式(i)的示例性穿入阻断剂引物
[0142]
[0143][0144]
如本文其他处所述，本公开的穿入阻断剂引物提供减少和/或防止在使用聚合酶连接的纳米孔装置进行核酸检测和测序期间可能发生的有害穿入的优点。此类基于纳米孔的方法可以为本领域众所周知的利用生物素进行核酸纯化、分离和隔离的广泛过程的一部分。因此，预期在一些实施例中，本公开的穿入阻断剂引物可以包括促进并入这些引物的核酸链的纯化、分离和/或隔离的生物素标签。
[0145]
在一些实施例中，包含式(i)化合物(例如，式(ia)-(ie)化合物中的任一者)的本公开的穿入阻断剂引物可以进一步包含连接到封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签。
[0146]
如本文所用，术语“生物素标签”旨在包括直接或通过接头部分间接连接到封闭部分的5
′‑
末端的生物素部分、脱硫生物素部分或亚氨基生物素部分。即，术语“生物素标签”可以包括生物素、脱硫生物素或亚氨基生物素部分连同接头部分。
[0147]
在一些实施例中，本公开的穿入阻断剂引物(例如，式(i)、(ia)和(ib)-(ie)化合物)可以包含式(ii)化合物：
[0148]5′‑
[生物素标签]-[封闭部分]-[引物]-3
′
[0149]
(ii)
[0150]
其中，封闭部分包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团；生物素标签包含生物素标签；并且引物包含能够通过连接到纳米孔的聚合酶引发拷贝链的聚合的寡核苷酸。可用作本公开的穿入阻断引物的封闭部分的示例性聚阳离子基团、大体积基团和碱基修饰的核苷在本文包括实施例中进一步描述。在式(ii)化合物的一些实施例中，连接到式(ii)的穿入阻断剂引物的封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签可以包含生物素部分和接头部分，或者脱硫生物素部分和接头部分。
[0151]
式(ii)的穿入阻断剂引物化合物的附加实施例通过如下文公开的一系列子结构和其他特性来进行描述并且包括实例中描述的特定实施例。
[0152]
在一些实施例中，式(ii)的穿入阻断剂引物包含式(iia)化合物
[0153][0154]
其中，n为1至10，并且r独立地选自o-、s-、ch3和h。在一些实施例中，r为o-并且该键为磷酸二酯，即，封闭部分为磷酸二酯连接的到引物的5
′‑
末端。
[0155]
如上文对于式(ii)引物化合物(式(iia)为该引物化合物的子结构)所述，式(iia)引物化合物的封闭部分可以包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团；并且引物包含能够通过连
接到纳米孔的聚合酶引发拷贝链的聚合的寡核苷酸。然而，如式(iia)所示，进一步预期封闭部分涵盖封闭部分基团的寡聚物，诸如聚阳离子基团或大体积基团，并且此类寡聚物可以包含磷酸二酯、硫代磷酸酯、h-膦酸酯或膦酸甲酯键。如本文其他地方所述，这些寡聚封闭部分可以使用市售的试剂和标准的自动化寡核苷酸合成技术来进行制备。
[0156]
在一些实施例中，式(ii)的穿入阻断剂引物包含式(iib)化合物
[0157][0158]
其中，n为1至10，并且r独立地选自o-、s-、ch3和h。在本文中(包括在实例中)进一步描述了示例性聚阳离子基团。
[0159]
在一些实施例中，式(ii)的穿入阻断剂引物包含式(iic)化合物
[0160][0161][0162]
其中，n为1至10，并且r独立地选自o-、s-、ch3和h。在本文中(包括在实例中)进一步描述了示例性大体积基团。
[0163]
如上所述，预期式(ii)或(iia)的穿入阻断剂引物的封闭部分可包含碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团。在一些实施例中，式(ii)的穿入阻断剂引物包含式(iid)化合物：
[0164][0165]
其中，b为修饰的核碱基，r独立地选自o-、s-、ch3和h，并且n为1至10。
[0166]
在一些实施例中，式(ii)的穿入阻断剂引物包含式(iie)化合物：
[0167][0168]
其中，b为修饰的核碱基，r独立地选自o-、s-、ch3和h，并且n为1至10。在式(iid)和(iie)的穿入阻断剂引物的一些实施例中，封闭部分包含不是寡聚的并且包含单个碱基修饰的核苷。在本文中(包括在实例中)进一步描述了示例性碱基修饰的核苷。
[0169]
在一些实施例中，本公开提供了式(ii)或(iia)至(iie)的穿入阻断剂引物化合物，其中化合物选自表2中列出的那些。
[0170]
表2：式(i)的示例性穿入阻断剂引物
[0171][0172]
如本文其他地方所公开的，向本公开的穿入阻断剂引物添加5
′
生物素标签可以促进以各种众所周知的核酸过程或测定来进一步处理并入引物的延伸的核酸链，诸如纯化、分离和/或隔离。进一步预期，在一些过程中，期望从延伸的核酸链切割生物素标签(例如在
链延伸聚合之后)，以便促进使用核酸的其他过程或测定。
[0173]
因此，在本公开的穿入阻断剂引物(例如，式(i)和(ii)化合物)的一些实施例中，连接到封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签包含可选择性切割的(例如，可酶促切割的)序列的寡核苷酸。在一些实施例中，生物素标签包含可由酶选择性切割的寡核苷酸序列，例如序列ttttuuu(seq id no：14)。因此，在一些实施例中，本公开的任何穿入阻断剂引物化合物可以包含连接到封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签，其中生物素标签包含具有选自以下项的序列的寡核苷酸：ttttuuu(seq id no：15)；ttttuuut(seq id no：16)；ttttuuutt(seq id no：17)；ttttuuuttt(seq id no：18)；ttttuuutttt(seq id no：19)；ttttuutttttuut(seq id no：20)；tuuttttuu(seq id no：21)；tuutttttuu(seq id no：22)；和ttttuuuuuu(seq id no：23)。
[0174]
在本文公开的包含连接到封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签的穿入阻断剂引物化合物(例如，式(ii)和(iia)至(iie)化合物)的任何实施例中，生物素标签可以包含式(iii)的结构：
[0175]
b-l-[(n)
x-(u)
y-(n)z]w[0176]
(iii)
[0177]
其中b为生物素或脱硫生物素；l为接头；n为核苷酸；u为尿嘧啶；x和z为至少1；y为至少3；w为0或1。
[0178]
在本文公开的包含连接到封闭部分的5
′‑
末端的生物素标签的穿入阻断剂引物化合物(例如，式(ii)和(iia)化合物)的任何实施例中，生物素标签可以包含选自以下项的结构：5
′‑
(生物素)-(sp18)-tttuuutt-3
′
；5
′‑
(脱硫生物素)-(sp18)-tttuuutt-3
′
；5
′‑
(生物素teg)-(sp18)
2-tttuuutt-3
′
；5
′‑
(脱硫生物素teg)-(sp18)
2-tttuutt-3
′
；5
′‑
(生物素teg)-(sp18)
3-3
′
；5
′‑
(脱硫生物素teg)-(sp18)
3-tttuuutt-3
′
；或5
′‑
(生物素)
2-(sp18)-tttuuutt-3
′
。
[0179]
可获得广泛的亚磷酰胺试剂，该亚磷酰胺试剂可用于制备生物素标签和/或将生物素标签连接到本公开的穿入阻断剂引物的5
′‑
末端。例如，下表3中示出的市售的亚磷酰胺试剂(例如，可从glen research，inc.，sterling，va，usa购得)可用于标准的自动化寡核苷酸合成，以将生物素部分或脱硫生物素部分直接或者通过间隔基或接头(例如，sp18)连接到穿入阻断剂引物的5
′‑
末端。
[0180]
表3：
[0181][0182]
如本文另外公开的，本公开的穿入阻断剂引物(例如，式(i)、(ia)、(ii)或(iia)化合物)的一般结构特征包括连接到引物结构的5
′‑
末端的封闭部分结构。封闭部分可以包含聚阳离子基团、大体积基团或碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团。不希望受理论或机制的束缚，据信连接到纳米孔近端的扩链酶(例如，pol6dna聚合酶)的链置换活性导致引物延伸的链穿入纳米孔中，其中穿入对纳米孔在检测由酶并入的带标签的核苷酸时的持续功能是有害的，并且有效地阻止纳米孔装置在仅短处理之后进行进一步“读段”。连接到引物序列的5
′
末端的封闭部分的存在有效地减少或防止该有害的模板穿入现象。如上所述，有效的封闭部分可以具有选自以下项的一系列不同结构：(a)聚阳离子基团；(b)大体积基团；或(c)碱基修饰的核苷，其中碱基修饰的核苷包含与核苷碱基连接的聚阳离子基团或大体积基团。可用于本公开的穿入阻断剂引物化合物的封闭部分的各种实施例包括一系列子结构和其他特性，如下文公开的，并且可以包括实例中描述的特定实施例。
[0183]
在一些实施例中，封闭部分包含聚阳离子基团。在本公开的化合物中可用作封闭部分的示例性聚阳离子基团可以包括阳离子氨基烷基基团的寡聚物，诸如精胺、亚精胺、乙二胺、丙二胺、烯丙胺。因此，在一些实施例中，封闭部分包含选自以下项的聚阳离子基团：聚(精胺)、聚(亚精胺)、聚(乙二胺)、聚(丙二胺)、聚(烯丙胺)。在一些实施例中，可用于本公开的引物化合物的封闭部分包括：精胺的寡聚物，该精胺的寡聚物包括以下寡聚物：(精
胺)2、(精胺)3、(精胺)4和(精胺)5。
[0184]
通常，当封闭部分包含聚阳离子基团时，该基团包含阳离子基团的寡聚物(例如，精胺)。然而，预期在一些实施例中，这些阳离子基团的寡聚物可以使用标准的自动化寡核苷酸合成来进行制备，该合成产生磷酸二酯连接的寡聚物。可获得广泛的亚磷酰胺试剂，该亚磷酰胺试剂产生作为阳离子氨基烷基基团的磷酸二酯连接的寡聚物。例如，试剂精胺亚磷酰胺(如下所示)为市售的(例如，来自glen research，inc.)并且可以用于标准的自动化寡核苷酸合成，以将一个或多个精胺聚阳离子基团连接到本公开的穿入阻断剂引物上。
[0185][0186]
(化学名称：n
1-[4-(4，4
′‑
二甲氧基三苯甲氧基)丁基]-n1，n4，n9，n
12-四(三氟乙酰基)-精胺-n
12-丁基-4-[(2-氰基乙基)-(n，n-二-异丙基)]-亚磷酰胺)
[0187]
使用精胺亚磷酰胺而并入寡核苷酸中的该一个或多个精胺阳离子基团经由在标准的亚磷酰胺合成中形成的磷酸二酯键来进行连接。因此，在一些实施例中，其中封闭部分包含精胺基团的寡聚物，寡聚物为磷酸二酯连接的。
[0188][0189]
在一些实施例中，封闭部分包含聚阳离子基团，该聚阳离子基团为阳离子氨基酸的寡聚物。因此，在一些实施例中，封闭部分包含阳离子氨基酸的寡聚物，该阳离子氨基酸的寡聚物选自：赖氨酸、ε-赖氨酸、鸟氨酸、(氨基乙基)甘氨酸、精氨酸、组氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸和/或氨基脯氨酸。在一些实施例中，基于阳离子氨基酸的寡聚物，可用于本公开的引物化合物的封闭部分包括：[phe(4-no2)-εlys-(lys)8]、[phe(4-no2)-εlys-(lys)
12
]、[(lys)
8-εlys-phe(4-no2)]、[(lys)
12-εlys-phe(4-no2)]、[pamam genl氨基]。
[0190]
在一些实施例中，封闭部分包含大体积基团。可用于本公开的引物化合物的示例性大体积基团包括但不限于芳基基团、芳基烷基基团、杂芳基基团、杂芳基烷基基团、环烷基基团、杂环烷基基团或任何这些大体积基团的某种组合。在一些实施例中，大体积基团可以选自芘、胆固醇基、苝、苝酰亚胺、葫芦脲、β-环糊精、高聚(乙二醇)聚合物或任何这些大体积基团的组合。
[0191]
在一些实施例中，预期封闭部分包含大体积基团，其中大体积基团包含大体积基团的寡聚物，诸如芘、胆固醇基、苝、苝酰亚胺、葫芦脲、β-环糊精、高聚(乙二醇)聚合物(例如，peg聚合物)或它们的某种组合。如本文其他地方所述，可获得广泛的亚磷酰胺试剂，该亚磷酰胺试剂产生可以包括大体积基团的寡聚物的磷酸二酯连接的寡聚物。因此，在一些实施例中，其中封闭部分包含大体积基团的寡聚物，大体积基团可以为磷酸二酯连接的大体积基团。
[0192][0193]
(化学名称：1-二甲氧基三苯甲氧基-3-o-(n-胆固醇基-3-氨基丙基)-三甘醇-甘油基-2-o-(2-氰基乙基)-(n，n，-二异丙基)-亚磷酰胺)
[0194]
可以使用经由标准的亚磷酰胺合成中形成的磷酸二酯键连接的胆固醇基-teg亚磷酰胺，来将该一个或多个胆固醇基大体积基团并入寡核苷酸中。因此，在一些实施例中，其中封闭部分包含一个或多个大体积基团，寡聚物为磷酸二酯连接的胆固醇基。
[0195][0196]
如本文其他地方所述，本公开的化合物(例如，式(i)化合物)的引物包含能够通过连接到纳米孔的聚合酶引发拷贝链的聚合的寡核苷酸。因此，在一些实施例中，连接到引物的5
′‑
末端的封闭部分可以为使用标准的自动化寡核苷酸合成制备的并非核苷的磷酸二酯连接的基团的寡聚物。例如，磷酸二酯连接的聚阳离子基团或大体积基团的寡聚物。然而，也考虑到封闭部分可以包含碱基修饰的核苷。碱基修饰的(或碱基可修饰的)核苷为众所周知的，并且可以使用标准的自动化寡核苷酸合成轻松连接到寡核苷酸引物的5
′‑
末端。
[0197]
因此，在本公开的化合物的一些实施例中，封闭部分包含碱基修饰的核苷，其中碱基修饰包含聚阳离子基团或大体积基团。预期本文公开的聚阳离子基团或大体积基团中的任一者也可以用于碱基修饰的核苷实施例中。因此，在一些实施例中，碱基修饰可以包含选自以下项的聚阳离子基团：聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚(氨基乙基)甘氨酸、聚甲基赖氨酸、聚二甲基赖氨酸、聚三甲基赖氨酸、聚氨基脯氨酸和聚-ε-赖氨酸。在一些实施例中，碱基修饰可以包含选自苝、胆固醇基和β-环糊精的大体积基团。
[0198]
用于制备碱基修饰的核苷的方法为本领域众所周知的。叠氮化物与炔烃之间的铜(i)催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)反应可以用于形成与炔烃修饰的核碱基连接的共价1，2，3-三唑键，该炔烃修饰的核碱基先前并入使用亚磷酰胺试剂通过标准的自动化合成制备的寡核苷酸中。产生炔烃修饰的核碱基的多种亚磷酰胺试剂为市售的(参见，例如，glen research，sterling，va，usa)。这些试剂中的任何一种试剂均可以与标准的自动化寡核苷酸合成方法一起使用，然后进行cuaac修饰，以提供具有修饰的t(或du)的寡核苷酸，该修饰的t(或du)是用聚阳离子或大体积基团进行碱基修饰的。在表4中提供可用于制备具有碱基修饰的封闭部分的穿入阻断剂引物的示例性亚磷酰胺试剂。
[0199]
表4：可用于cuaac碱基修饰的亚磷酰胺试剂
[0200][0201]
在图1中示意性地描绘该类型的cuaac反应的一般示例。使用5-乙炔基-du-ce亚磷酰胺试剂来制备寡核苷酸内的单个5-乙炔基-du核苷(序列的其余部分未示出)。然后叠氮化物修饰的苝化合物与该炔烃修饰的寡核苷酸在标准cuaac反应条件下反应，以产生包括用苝大体积基团修饰的单个核碱基的寡核苷酸。产生与核碱基连接的短接头的该类型修饰在寡核苷酸序列式中表示为
“‑
(du-[苝])
‑”
单体单元。
[0202]
在图2中描绘用于制备本公开的穿入阻断剂引物的示例性cuaac反应。起始寡核苷酸5
′‑
(生物素)-(sp18)-ttttuuuttt-(c8-炔烃-dt)-aacggaggaggagga-3
′
使用试剂c8-炔烃-dt-ce亚磷酰胺经由标准的寡核苷酸合成来进行制备，以插入c8-炔烃修饰的dt单元(本文也称为“t＊”)。然后，叠氮化物修饰的8-赖氨酸多肽phe(4-no2)-εlys-(lys)8与炔烃修饰的寡核苷酸在标准cuaac反应条件下反应。所得产物为穿入阻断剂引物5
′‑
(生物素)-(sp18)-ttttuuuttt-(t＊-[phe(4-no2)-εlys-(lys)8])-aacggaggaggagga-3
′
。示例性封闭部分包含用8碳接头来碱基修饰的t核苷，该接头通过三唑基团来共价连接到8赖氨酸聚阳离子基团[phe(4-no2)-εlys-(lys)8]。
[0203]
图3和图4描绘了包含封闭部分的示例性穿入阻断剂引物化合物，其中封闭部分包含碱基修饰的核苷，其中碱基修饰为聚阳离子基团。图3描绘了一种引物化合物，5
′‑
(生物素)-(sp18)-tttuuutt-(t
＊-[phe(4-no2)-(ε-lys)-(lys)
12
])-taacggaggaggagga-3
′
。该化合物的特征在于包含t＊核苷的封闭部分，该核苷为在位置5处用c8接头(例如，使用“c8-炔烃-dt-ce亚磷酰胺”)进行碱基修饰的t核苷，然后通过cuaac形成的三唑来进一步连接到聚阳离子基团[phe(4-no2)-(ε-lys)-(lys)
12
]。图3描绘了引物化合物5
′‑
(生物素)-(sp18)-tttuuutt-(t＊-[pamam gen1氨基])-taacggaggaggagga-3
′
。该化合物的特征在于还包含t＊核苷的封闭部分，该核苷经由与“pamam gen1氨基”聚阳离子基团连接的三唑键来进行碱基修饰，该聚阳离子基团具有包含七个带正电荷的胺基基团的树枝状结构，如图3所示。
[0204]
在一些实施例中，本公开提供了式(i)或(ii)的穿入阻断剂引物化合物，其中化合物选自表5中列出的那些示例性化合物。
[0205]
表5
[0206][0207]
[0208]
通常，可用于本公开的穿入阻断剂引物的引物部分可以包括任何引物，该引物能够在适用于合成与模板链(即，拷贝链)互补的引物延伸产物的条件下，充当由聚合酶进行的模板依赖性核酸合成的启动点。在一些实施例中，式(i)或(ii)的穿入阻断剂引物的引物部分包含至少9-聚体、至少12-聚体或至少15-聚体的寡核苷酸。在一些实施例中，引物部分包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含天然出现的核碱基和糖部分以及介于单体单元之间的磷酸二酯键。例如，在至少一个实施例中，引物部分为包含选自aacggaggaggagga(seq id no：53)或aacggaggaggaggacgta(seq id no：54)的序列的寡核苷酸。
[0209]
还预期在一些实施例中，引物部分可以包含非天然出现的核碱基和/或糖部分。例如，寡核苷酸可以包含一个或多个锁核酸单元(例如，具有“锁定”核糖构象的2
′‑4′
键的核苷单元)。在一些实施例中，引物部分寡核苷酸包含选自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺和硼酸代磷酸酯的键。
[0210]
在至少一个实施例中，引物部分为寡核苷酸，其中寡核苷酸包含一个或多个锁核酸单元；任选地，其中寡核苷酸包含序列5
′‑
taa^cgga^gga^gga^gga-3
′
(seq id no：55)(其中a^表示a核苷为锁核酸单元)。
[0211]
在至少一个实施例中，引物部分为寡核苷酸，其中寡核苷酸在3
′‑
末端处包含硫代磷酸酯连接的核苷单元的子序列；任选地，其中寡核苷酸包含序列5
′‑
aacggaggagga*g*g*a-3
′
(seq id no：56)(其中*表示硫代磷酸酯键)。
[0212]
如本文其他地方所述，修饰的核碱基和3
′‑
加帽单元的缩写为通常用于使用市售的亚酰胺试剂的自动化寡核苷酸合成的那些(参见，例如，可以从以下公司购得的亚酰胺试剂目录：glen research，22825davis drive，sterling，va，usa；或chemgenes corp.，33industrial way，wilmington，ma，usa)。因此，“spc2”是指无碱基2碳间隔基；“spc3”是指无碱基3碳间隔基；“dsp”是指无碱基核糖间隔基；“c3”是指3
′‑
丙醇；“n3cedt”是指由3-n-氰基乙基-dt亚酰胺(在位置n3处具有氰基乙基基团的dt)产生的修饰的核碱基；“n3medt”是指由3-n-甲基-dt亚酰胺(在位置n3处具有甲基基团的dt)产生的修饰的核碱基；“5medc-phet”是指由n4-苯乙基-5-甲基-dc亚酰胺(在位置4胺处具有苯乙基的5-甲基-dc)产生的修饰的核碱基；“桥亚乙烯基-da”是指由1，n6-桥亚乙烯基-da亚酰胺(具有将n1连接到胺位置6的乙烯的da)产生的修饰的核碱基；“dcb”是指由n4-(o-乙酰丙酰基-6-氧基己基)-5-甲基-dc亚酰胺(在位置4胺处具有o-乙酰丙酰基-6-氧基己基“分支”的5-甲基-dc)产生的修饰的核碱基)；“tmp”是指带有甲基膦酸酯键的胸苷；并且“imp”是指具有甲基膦酸酯键的肌苷。
[0213]
b.穿入阻断剂引物的用途
[0214]
本公开的穿入阻断剂引物化合物为可用的纳米孔检测和/或测序方法，其中纳米孔装置用于在核苷酸部分通过位于纳米孔的近端的扩链酶(例如聚合酶、连接酶)而被并入时(或在其被并入和释放后)，检测带标签的核苷酸的标签。尽管本公开的穿入阻断剂引物在使用纳米孔-聚合酶缀合物和带标签的核苷酸化合物以用于基于纳米孔的边合成边测序(sbs)方法的用途中进行了举例说明，但预期可以在需要通过位于纳米孔，特别是宽孔纳米孔附近的扩链酶来对靶序列进行引物延伸的任何方法中使用本文公开的穿入阻断剂引物。如本文其他地方所述，已观察到扩链酶的链置换活性可能导致延伸引物或靶序列的互补链穿入纳米孔。进入纳米孔的该穿入对纳米孔装置的功能是有害的，因为它干扰了用于该方
法中的带标签的核苷酸的检测，并且因此，可以有效地阻止纳米孔装置在仅短处理之后检测序列。
[0215]
如本文实例中所示，本公开的穿入阻断剂引物具有经改善的用于通过纳米孔装置来进行可重复检测的特征，特别是在采用宽孔突变体的情况下，并且导致与不含穿入阻断剂部分的对应引物化合物相比，有害穿入减少且序列读段更长。例如，在一些实施例中，本公开的穿入阻断剂引物(例如，式(i)或(ii)化合物)能够以至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或更多的读长，由与纳米孔连接的聚合酶来引发拷贝链的聚合。而且，在一些实施例中，本公开的穿入阻断剂引物(例如，式(i)或(ii)化合物)能够以小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或更小的模板穿入速率，由与纳米孔连接的聚合酶来引发拷贝链的聚合。
[0216]
通常，可用于使用本公开的穿入阻断剂引物化合物执行基于纳米孔的检测和/或测序的方法、材料、装置和系统在美国专利公开号2013/0244340 a1、2013/0264207 a1、2014/0134616 a1、2015/0119259 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1以及公开的国际申请wo 2019/166457 a1中有所描述，这些美国专利公开和国际申请中的每一者在此通过引用并入本文。
[0217]
在至少一个实施方案中，本公开提供了一种用于测定核酸序列的方法，所述方法包括：(a)提供一种纳米孔测序组合物，该纳米孔测序组合物包含：膜、在膜的顺式侧和反式侧上的电极、其孔延伸穿过膜的纳米孔、与两个电极都接触的电解质溶液、位于纳米孔附近的活性聚合酶，以及与聚合酶复合的引物链；(b)使纳米孔测序组合物与以下项接触：(i)核酸链；(ii)一组化合物，该组化合物各自包含与标签共价连接的不同的核苷5
′‑
寡磷酸酯部分，其中该组化合物中的每个成员都具有不同的标签，当标签进入纳米孔时，导致穿过纳米孔的不同离子流，并且不同的标签中的至少一种标签包含带负电荷的聚合物部分，当在离子的存在下进入纳米孔时，导致穿过纳米孔的离子流发生改变；以及(c)检测不同的标签随时间推移进入纳米孔中而导致的不同离子流，并且与通过聚合酶并入的与核酸序列互补的不同的化合物中的每一者相关联，从而测定核酸序列。
[0218]
在一些实施例中，本公开提供了一种用于测定核酸序列的方法，该方法包括：(a)提供一种纳米孔测序组合物，该纳米孔测序组合物包含：膜、在膜的顺式侧和反式侧上的电极、其孔延伸穿过膜的纳米孔、与两个电极都接触的电解质溶液、位于纳米孔附近的活性聚合酶，以及与聚合酶复合的引物链；(b)使纳米孔测序组合物与以下项接触：(i)核酸链；(ii)一组带标签的核苷酸，每个带标签的核苷酸都具有不同的标签，其中当每个不同的标签位于纳米孔中时，该每个不同的标签导致跨电极的不同标签电流水平，并且该组包含用于宽孔纳米孔检测的至少一种化合物，该至少一种化合物包含式(i)的带负电荷的聚合物部分，如本文其他地方所述。
[0219]
1.纳米孔
[0220]
纳米孔、包含纳米孔的装置和用于制备并在纳米孔检测应用(诸如使用本公开的穿入阻断剂引物来进行纳米孔测序)中使用其的方法为本领域中已知的(参见，例如，美国专利号7,005,264 b2、7,846,738、6,617,113、6,746,594、6,673,615、6,627,067、6,464,842、6,362,002、6,267,872、6,015,714、5,795,782以及美国专利申请号2015/0119259、2014/0134616、2013/0264207、2013/0244340、2004/0121525和2003/0104428，这些美国专
利和美国专利申请在此通过引用整体并入本文)。纳米孔和可用于测量纳米孔检测的纳米孔装置也在本文公开的实例中进行了描述。通常，纳米孔装置包含包埋在脂质双层膜中的纳米孔，其中该膜被固定在或连接到包含孔或储器的固体基底上。该纳米孔的孔隙延伸穿过膜，在该膜的顺式侧和反式侧之间创建流体联接。典型地，固体基底包含选自由聚合物、硅及其组合所组成组的材料。此外，固体基底包含邻近该纳米孔的传感器、传感电路或与传感电路(任选地，互补金属氧化物半导体(cmos)或场效应晶体管(fet)电路)偶联的电极。典型地，在膜的顺式侧和反式侧上存在电极，该电极允许跨该膜设定dc或ac电压电势，从而生成流经该纳米孔的孔隙的基线电流(或o.c.电流水平)。纳米孔中改变离子流的标签的存在导致穿过纳米孔的正离子流发生变化，从而生成了跨电极的电流水平相对于纳米孔o.c.电流的可测量的变化。
[0221]
预期包含本公开的穿入阻断剂引物的组合物和方法可与多种纳米孔装置合用，该纳米孔装置包含通过天然出现和非天然出现(例如，工程化或重组)的成孔蛋白而生成的纳米孔。可与组合物和方法一起使用的代表性的成孔蛋白包括但不限于，α-溶血素、β-溶血素、γ-溶血素、气单胞菌溶素、细胞溶素、杀白细胞素、蜂毒肽、mspa孔蛋白和孔蛋白a。
[0222]
在一些实施例中，可以使用来自金黄色葡萄球菌的成孔蛋白α-溶血素(本文中也称为“α-hl”)来形成纳米孔。α-hl为成孔蛋白类中被研究最多的成员之一，并且已经广泛用作纳米孔装置中的纳米孔。(参见，例如，美国公开号2015/0119259、2014/0134616、2013/0264207和2013/0244340。)也已经使用大量技术，包括定点诱变和化学标记，对α-hl进行测序、克隆、广泛的结构表征和功能表征(参见，例如，valeva等人(2001)，及其中引用的参考文献)。天然出现的(即，野生型)α-hl成孔蛋白亚基的氨基酸序列显示如下。
[0223]
野生型α-hl氨基酸序列(seq id no：57)
[0224]
adsdiniktg ttdigsnttv ktgdlvtydk engmhkkvfy sfiddknhnk kllvirtkgt 60
[0225]
iagqyrvyse eganksglaw psafkvqlql pdnevaqisd yyprnsidtk eymstltygf 120
[0226]
ngnvtgddtg kiggliganv sightlkyvq pdfktilesp tdkkvgwkvi fnnmvnqnwg 180
[0227]
pydrdswnpv ygnqlfmktr ngsmkaadnf ldpnkassll ssgfspdfat vitmdrkask 240
[0228]
qqtnidviye rvrddyqlhw tstnwkgtnt kdkwtdrsse rykidwekee mtnglsawsh 300
[0229]
pqfek
[0230]
305
[0231]
seq id no：57的野生型α-hl氨基酸序列不包括通常在大肠杆菌中进行克隆时存在的初始甲硫氨酸残基，并且用于识别α-hl氨基酸取代的序列位置。
[0232]
已经制备了各种非天然出现的α-hl成孔蛋白，包括而不限于，包含以下替换中的一个或多个的变体α-hl亚基：h35g、e70k、h144a、e111n、m113a、d127g、d128g、d128k、t129g、k131g、k147n、和v149k。这些各种工程化的α-hl孔多肽的特性在例如美国公开专利申请号2017/0088588、2017/0088890、2017/0306397和2018/0002750中有所描述，这些美国公开专利申请中的每一者在此通过引用并入本文。
[0233]
2.宽孔突变体α-hl纳米孔
[0234]
预期包含本文所述的穿入阻断剂引物的组合物和方法可以与具有α-hl的宽孔突变体的纳米孔装置一起使用。宽孔突变体为非天然出现的α-hl蛋白，其被工程化以形成七聚纳米孔，该七聚纳米孔具有位于约65埃的深度处的直径约13埃的约束位点，如当该七聚
纳米孔包埋在膜中时，从孔的顺式侧的最宽部分所测量的。在一些实施例中，宽孔突变体包含α-hl亚基，该亚基至少包含氨基酸取代e111n和m113a。在一些实施例中，宽孔突变体包含α-hl亚基，该亚基包含氨基酸取代e111n和m113a，并且进一步包含选自以下项的一个或多个氨基酸取代：d127g、d128g、d128k、t129g、k131g、k147n和v149k。可与本发明的化合物、组合物和方法一起使用的示例性宽孔突变体的6∶1七聚亚基组合物公开于下表6中。
[0235]
表6
[0236]
[0237]
[0238][0239]
如表6中所述，在一些实施例中，α-hl的宽孔突变体亚基也可以在氨基酸n293处截短。此外，宽孔突变体可以进一步包括如wo2017/125565a1中所公开的c末端spytag肽融合体和/或his标签，该文献在此通过引用并入本文，并且在下文进一步描述。在位置n293处截短的α-hl成孔蛋白亚基的氨基酸序列，如下所示。
[0240]
在n293处截短的α-hl氨基酸序列亚基(seq id no：58)
[0241]
adsdiniktg ttdigsnttv ktgdlvtydk engmhkkvfy sfiddknhnk kllvirtkgt 60
[0242]
iagqyrvyse eganksglaw psafkvqlql pdnevaqisd yyprnsidtk eymstltygf 120
[0243]
ngnvtgddtg kiggliganv sightlkyvq pdfktilesp tdkkvgwkvi fnnmvnqnwg 180
[0244]
pydrdswnpv ygnqlfmktr ngsmkaadnf ldpnkassll ssgfspdfat vitmdrkask 240
[0245]
qqtnidviye rvrddyqlhw tstnwkgtnt kdkwtdrsse rykidwekee mtn 293
[0246]
3与纳米孔的缀合
[0247]
众所周知，α-hl单体的七聚复合物自发地形成包埋在脂质双层膜内并创建穿过该脂质双层膜的孔隙的纳米孔。已经发现，包含比率为6∶1的天然α-hl亚基和突变体α-hl亚基的α-hl七聚体可形成纳米孔(参见，例如，valeva等人(2001)“membrane insertion of the heptameric staphylococcal alpha-toxin pore-a domino-like structural transition that is allosterically modulated by the target cell membrane”，j.biol.chem.276(18)：14835-14841，及其中引用的参考文献)。该七聚孔的一个α-hl单体亚基(即，“1x亚基”)可使用如wo 2015/148402和wo2017/125565a1中所述的spycatcher/spytag缀合方法与dna-聚合酶共价缀合，这些专利中的每一者在此通过引用并入本文(也参见，zakeri和howarth(2010)，j.am.chem.soc.132：4526-7)。简而言之，spytag肽作为重组融合体附接到α-hl的1x亚基的c末端，而spycatcher蛋白片段作为重组融合体附接到扩链酶例如pol6 dna聚合酶的n末端。spytag肽和spycatcher蛋白片段经历spycatcher蛋白的赖氨酸残基与spytag肽的天冬氨酸残基之间的反应，造成两个α-hl亚基与酶缀合的共价链接。
[0248]
通常，使用与本领域中已知的用于野生型或其他工程化α-hl蛋白质的相同方法，使用该宽孔突变体α-hl亚基来制备七聚α-hl纳米孔。因此，在一些实施例中，本公开的穿入阻断剂引物化合物可以与纳米孔装置一起使用，其中纳米孔为宽孔突变体。如表6的示例性宽孔突变体所示，6∶1七聚α-hl宽孔纳米孔具有六个亚基(即，“6x亚基”)，每个亚基都具有表6中公开的该组突变，并且具有一个1x亚基，该亚基具有略有不同的一组突变，如表6所示(例如，不包括h144a)。
[0249]
在一些实施例中，6x亚基被工程化以包括c末端融合体，该融合体包含硫磺矿硫化叶菌的64氨基酸dna结合蛋白7d(或“ss07d”)，其序列在uniprot条目p39476处有所描述(参见，例如，在www.uniprot.org/uniprot/p39476处；序列版本2，2007年1月23日出版)。ss07d融合可以起到稳定附近聚合酶的聚合酶-模板复合物的作用，以用于增强持续合成能力。
[0250]
为了促进dna聚合酶的缀合，1x亚基包括c末端融合体(在截短的野生型序列的位置293或294处开始)，该融合体包括spytag肽，例如ahivmvdayk(seq id no：59)。spytag肽允许纳米孔与spycatcher修饰的扩链酶诸如pol6 dna聚合酶的缀合。在一些实施例中，宽孔突变体的c末端spytag肽融合体包含接头肽(例如，ggssggssgg(seq id no：60))、spytag肽(例如，ahivmvdaykptk(seq id no：61))和末端his标签(例如，kghhhhhh(seq id no：62))。因此，c末端spytag肽融合体包含以下氨基酸序列：ggssggssggahivmvdaykptkkghhhhhh(seq id no：63)。在一些实施例(例如，表6中公开的那些)中，seq id no：57的c末端spytag肽融合体连接在相对于野生型α-hl亚基序列而截短的1x亚基的位置n293处，如在seq id no：57中)。在wo2017125565a1中描述了具有在n293处的
seq id no：57的spytag肽融合体的1xα-hl亚基的制备和缀合的更多细节，该文献在此通过引用并入本文(参见，例如，具有seq id no：2的c末端spytag肽融合体的α-hl亚基，该亚基公开于wo2017125565a1)。
[0251]
替代地，可使用在大量允许通过马来酰亚胺接头化学进行蛋白质共价修饰的位置处插入的半胱氨酸残基取代将α-hl单体工程化(参见，例如valeva等人(2001))。例如，可使用k46c突变修饰单个α-hl亚基，然后用接头简单地修饰，从而允许使用四嗪-反式-环辛烯点击化学将dna聚合酶的bst2.0变体附接到该七聚6：1纳米孔。此类实施例在2015年3月9日提交的美国临时申请号62/130,326和美国公开专利申请号2017/0175183a1中有所描述，这些美国临时申请和美国公开专利申请中的每一者在此通过引用并入本文。
[0252]
用于将扩链酶附接到纳米孔的其他方法包括天然化学连接(thapa等人，molecules 19：14461-14483[2014])、分选酶系统(wu and guo，j carbohydr chem 31：48-66[2012]；heck等人，appl microbiol biotechnol 97：461-475[2013])、转谷氨酰胺酶系统(dennler等人，bioconjug chem 25：569-578[2014])、甲酰甘氨酸链接(rashidian等人，bioconjug chem 24：1277-1294[2013])，或本领域中已知的化学连接技术。
[0253]
4.扩链酶
[0254]
本文提供的纳米孔穿入阻断剂引物组合物和方法可以与广泛的扩链酶(诸如本领域已知的dna聚合酶和连接酶)一起使用。
[0255]
dna聚合酶为使用单链dna作为模板以合成互补dna链的酶家族。dna聚合酶将游离核苷酸添加到新形成的链的3
′
末端，从而导致新链在5
′
至3
′
方向上延伸。大多数dna聚合酶还具有核酸外切活性。例如，许多dna聚合酶具有3
′→5′
核酸外切酶活性。此类多功能dna聚合酶可以识别错误并入的核苷酸并使用3
′→5′
核酸外切酶活性以切除错误的核苷酸，该活性称为校对。核苷酸切除后，聚合酶可以重新插入正确的核苷酸，并且链延伸可以继续。一些dna聚合酶也具有5
′→3′‑
核酸外切酶活性。
[0256]
dna聚合酶用于许多dna测序技术，包括基于纳米孔的边合成边测序。然而，dna链可以快速移动穿过纳米孔(例如，以每个碱基1μs至5μs的速率)，这可能使纳米孔检测每个聚合酶催化的并入事件变得难以测量，并且易于产生高背景噪声，这可能导致难以获得单核苷酸分辨率。控制dna聚合酶活性速率以及根据正确并入来增加信号水平的能力在边合成边测序期间非常重要，特别是在使用纳米孔检测时。如实例中所示，本公开的穿入阻断剂引物化合物提供更长的读长和更低的有害穿入百分比，从而允许更准确的基于纳米孔的核酸检测和测序。
[0257]
在一些实施例中，可与本公开的穿入阻断剂引物化合物、组合物和方法一起使用的聚合酶为pol6 dna聚合酶，或pol6的变体，例如具有突变d44a的核酸外切酶缺陷型pol6变体，或具有增加的延伸速率的具有突变y242a和/或e585k的pol6变体。可与本公开的各种实施例一起使用的、具有提供聚合酶特性的突变体的一系列pol6 dna聚合酶变体在美国专利公开号2016/0222363a1、2016/0333327 a1、2017/0267983a1、2018/0094249a1、2018/0245147a1中有所描述，该美国专利公开中的每一者在此通过引用并入本文。
[0258]
可用于本公开穿入阻断剂引物化合物、组合物和方法的附加示例性聚合酶包括核酸聚合酶，诸如dna聚合酶(例如，ec 2.7.7.7类的酶)、rna聚合酶(例如，ec 2.7.7.6类或ec 2.7.7.48类的酶)、逆转录酶(例如，ec 2.7.7.49类的酶)和dna连接酶(例如，ec 6.5.1.1类
的酶)。在一些实施例中，可与穿入阻断剂引物化合物一起使用的聚合酶为9
°
n聚合酶、大肠杆菌dna聚合酶i、噬菌体t4 dna聚合酶、测序酶、taq dna聚合酶、9
°
n聚合酶(外型-)a485l/y409v或phi29 dna聚合酶(φ29 dna聚合酶)。在一些实施例中，延伸穿入阻断剂引物的扩链酶包含来自嗜热脂肪芽孢杆菌的dna聚合酶。在一些实施例中，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的dna聚合酶的大片段。在一个实施例中，聚合酶为dna聚合酶bst 2.0(可从new england biolabs，inc.，massachusetts，usa商购)。
[0259]
5.带标签的核苷酸组
[0260]
通常，用于使用纳米孔连接的聚合酶和本公开的穿入阻断剂引物来确定核酸序列的基于纳米孔的方法还需要使用四个带标签的核苷酸的组，每个带标签的核苷酸均能够作为聚合酶的底物并且还包含不同的纳米孔可检测的标签。可用于这些方法中的带标签的核苷酸通常包含结构式(iv)化合物
[0261][0262]
其中，“碱基”为选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基；r选自h和oh；n为1至4；“接头”为包含2个至100个原子的共价键合链的接头基团；并且“标签”为聚合物部分。例如，式(iv)的带标签的核苷酸化合物可以包含选自表7的标签。
[0263]
表7
[0264]
标签-(spc2)
14-(n3cedt)
10-(spc2)
6-c3-(spc2)
14-(n3cedt)
10-(spc2)
11-c3-(spc2)
15-(n3cedt)
7-(spc2)
8-c3-(spc2)
17-(n3cedt)
10-(spc2)
3-c3-(spc2)
19-(n3cedt)
7-(spc2)
4-c3-(spc2)
22-(n3cedt)
7-(spc2)
1-c3-(spc2)
27-(n3cedt)
7-(spc2)
1-c3-(spc2)
17-(n3medt)
10-(spc2)
3-c3-(spc2)
17-(dt)
10-(spc2)
3-c3-(spc2)
23-(tmp)
6-(spc2)
1-c3-(spc2)
20-(tmp)
6-(spc2)
4-c3-(spc2)
14-(n3cedt-tmp)
6-(spc2)
4-c3-(spc2)
17-(etheno-da)
7-(spc2)
6-c3-(spc2)
22-(etheno-da)
7-(spc2)
1-c3-(spc2)
17-(imp)
7-(spc2)
6-c3-(spc2)
17-(dcb)
7-(spc2)
6-c3-(spc2)
22-(dcb)
7-(spc2)
1-c3-(spc2)
22-(dcb)
7-(spc2)
4-c3-(spc2)
17-(da)
7-(spc2)
6-c3-(spc2)
22-(da)
7-(spc2)
1-c3-(spc2)
21-(5medc-phet)
5-(spc2)
4-c3-(spc2)
17-(spc2-dt)
5-(spc2)
3-c3-(spc2)
17-(tmp-dt)
5-(spc2)
3-c3-(spc2)
15-(n3cedt-5medc-phet)
5-(spc2)
5-c3-(spc2)
19-(n3cedt)
8-(spc2)
3-c3-tt-(spc2)
28-c3-tt-(spc2)
12-(dsp)
10-(spc2)
6-c3-t
2-(spc3)
28-c3-t
2-(dsp)
26-t
2-c3
[0265]
在用于基于纳米孔的dna链测序的方法的标准实施例中，该方法需要一组至少四个标准脱氧核苷酸da、dc、dg和dt，其中每个不同的核苷酸连接到不同的标签，该标签能够在核苷酸由近端扩链酶并入时被检测到，此外，其中每个标签的纳米孔可检测的信号(例如，标签电流)与其他三个标签中的每一个标签的纳米孔可检测的信号可区分，从而允许识别由酶并入的特定核苷酸。通常，当一个组中的不同带标签的核苷酸中的每个带标签的核苷酸通过扩链酶并入新的互补链中时，通过标签产生的独特的可检测的标签电流信号来区分每个带标签的核苷酸。因此，需要一组四个带标签的脱氧核苷酸da、dc、dg和dt，当使用宽孔纳米孔装置来进行检测时，该带标签的脱氧核苷酸提供充分分离和分辨的标签电流信号。
[0266]
在本公开的方法的一些实施例中，该方法需要使用包含四个带标签的核苷酸的组(例如，da、dc、dg和dt)的组合物，每个带标签的核苷酸均具有不同的标签，其中每个不同的标签导致在进入纳米孔装置的纳米孔时，产生不同的可检测的标签电流水平。例如，在一些实施例中，该组改变离子流的带标签的核苷酸可以包含在美国专利公开号2013/0244340 a1、2013/0264207 a1、2014/0134616 a1、2015/0119259 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1以及公开的国际申请wo 2019/166457 a1中公开的寡核苷酸标签，这些美国专利公开和国际申请中的每一者在此通过引用并入本文。下表8中提供了在本公开的基于纳米孔的方法中可用于确定核酸序列的七个示例性带标签的核苷酸组。
[0267]
表8
a1、2015/0119259 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1以及公开的国际申请wo 2019/166457 a1，这些美国专利公开和国际申请中的每一者在此通过引用并入本文。)
[0271]
实例
[0272]
本公开的各种特征和实施例在以下代表性示例中示出，该代表性示例旨在是说明性的，而不是限制性的。本领域技术人员将容易理解，特定示例仅用于说明本发明，如在其后的权利要求书中更全面地描述的。本技术中所述的每个实施例和特征应理解为可与其中包含的每个实施例互换和并组合。
[0273]
示例1：纳米孔穿入阻断剂引物的测定
[0274]
该示例示出了使用pol6聚合酶连接的宽孔突变体纳米孔装置进行的式(i)和(ii)的纳米孔穿入阻断剂引物化合物的测定。该测定证明了在纳米孔测序测量期间减少有害模板穿入和增加中值读长的穿入阻断剂引物效应。
[0275]
材料和方法
[0276]
测定中使用的穿入阻断剂引物如下表9所示。引物为使用标准的自动化寡核苷酸合成和市售的亚磷酰胺试剂制备的寡核苷酸。例如，使用精胺亚磷酰胺试剂来制备包含精胺作为封闭部分的穿入阻断剂引物，该精胺亚磷酰胺试剂经由磷酸二酯键将精胺并入寡核苷酸链中。
[0277]
根据图2的一般反应方案来制备具有经由碱基修饰的核碱基连接到的封闭部分的穿入阻断剂引物。寡核苷酸经由标准的自动化寡核苷酸合成在序列中的期望点处使用c8-炔烃修饰的dt亚磷酰胺试剂来进行制备。所得寡核苷酸包含炔烃修饰的dt核苷，然后使用标准cuaac叠氮基-炔烃点击化学来对该核苷进行进一步修饰。
[0278]
简而言之，如图2所示，寡核苷酸5
′‑
dmt-(生物素)-(sp18)-ttttuuuttt-(t＊)-aacggaggaggagga-3
′
使用自动化寡核苷酸合成来进行合成，然后通过氨处理来从合成树脂上脱保护和切割。(如本文其他地方所述，“t＊”表示在使用亚磷酰胺试剂c8-炔烃-dt-ce亚磷酰胺引入寡核苷酸的位置处用c8-炔烃键修饰的dt核苷。)在真空下去除氨之后，将0.6μmol的粗dmt保护的寡核苷酸悬浮在120μl水中。添加60μl的5m nacl，并将悬浮液涡旋。另外，将150μl的0.1m cubr的dmso/tbuoh(3∶1)溶液添加到220μl的0.1m thpta水溶液中。将300μl的cubr/thpta溶液添加到寡核苷酸的悬浮液，然后添加90μl的k8肽，叠氮丁酰-4npa-εlys-(lys)
8-nh2的10mm水溶液(0.9μmol)。用15μl的1m nahco3水溶液将反应的ph调整到约7.5，并且在25℃下振摇2天。然后用0.4ml氨和1ml的100mg/ml nacl来稀释反应溶液。然后使用150-mg的glen-pak柱来纯化悬浮液。通过用4％tfa处理10分钟来去除5
′‑
生物素上的dmt基团，然后使用在50％乙腈水溶液(“acn”)中的0.5％氨来洗脱所得的寡核苷酸缀合物。质谱分析示出了约＞95％的期望的寡核苷酸缀合物(mw～10358)。将其在真空下浓缩并且冻干。为了进一步纯化，然后将冻干的浓缩物溶解在700μl的1m三乙基乙酸铵中并且注射在半制备c18柱(250mm x 10mm)上，b并且用5％至25％溶剂b以3ml/分钟在40分钟内进行洗脱(溶剂a＝100mm三乙基乙酸铵ph 7.8，溶剂b＝乙腈)。将最纯的级分合并、在真空下浓缩并且冻干。然后将其溶解在1ml水中并且重新冻干。获得了50nmol的纯缀合物。
[0279]
pol6纳米孔缀合物包埋在膜中，在可单独寻址的集成电路芯片阵列上形成该膜。该纳米孔装置暴露于dna模板、本公开的穿入阻断剂引物和选自表8中列出那些带标签的核苷底物的一组带标签的核苷底物。在这两个实验中，聚合酶复合物形式具有纳米孔连接的
聚合酶、引物、模板和与dna模板互补的带标签的核苷酸，该带标签的核苷酸被捕获并且与pol6聚合酶活性位点结合，标签聚合物部分位于在附近缀合的α-hl宽孔突变体纳米孔。在施加的ac电势下，与o.c.电流(即，在纳米孔中没有标签的电流)相比，孔中标签的存在改变了穿过纳米孔的离子流，从而产生在纳米孔装置电极处测量的独特的标签水平电流。在互补的dna延伸链的pol6合成期间，随着不同标签部分进入纳米孔而测量的独特的标签电流水平可用于检测并识别dna模板。由于模板穿入而导致的测序早期截短被确定为在延长时间段内显示深流阻塞的细胞数量，软件确定其与标签结合事件不相关并且处于与测序标签的电流水平不同的另一个水平。
[0280]
纳米孔检测系统：使用包含cmos微芯片的纳米孔阵列微芯片来执行纳米孔离子流动测量，该微芯片在浅孔内具有大约8,000,000个氮化钛电极的阵列(由roche sequencing solutions，santa clara，ca，usa制造的芯片)。用于制造和使用此类纳米孔阵列微芯片的方法也可以在美国专利申请公开号2013/0244340 a1、us 2013/0264207 a1、us2014/0134616 a1、2015/0368710 a1和2018/0057870 a1以及公开的国际申请wo 2019/166457 a1中发现，这些美国专利申请公开和国际申请中的每一者在此通过引用并入本文。阵列中的每个孔均用表面改性使用标准cmos工艺来进行制造，该表面改性允许与生物试剂和导电盐保持持续接触。每个孔均可以支持其中包埋有纳米孔-聚合酶缀合物的磷脂双层膜。在每个孔处的电极可通过计算机接口单独寻址。使用计算机控制的注射泵来将所有所使用的试剂引入阵列微芯片上方的简单流动池中。该芯片支持模数转换，并以每秒超过1000个点的速率地独立报告来自所有电极的电气测量值。纳米孔标签电流测量可以在阵列中的8m可寻址的含有纳米孔的膜中的每个膜处至少每毫秒(msec)一次异步地进行测量，并且记录在连接的计算机上。
[0281]
芯片上脂质双层的形成：芯片中的每个首先填充有由510mm乙酸钾、18mm乙酸镁、15mm乙酸锂、50mm hepes(ph 7.8)、0.5mm edta、0.09％prolin 300和1％海藻糖构成的和运行缓冲液和应用于测量缓冲液的存在的电流。芯片上的磷脂双层膜使用1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dphpc，avanti polar lipids)来进行制备。将脂质粉末溶解在浓度为10mg/ml的硅油ar20：十六烷的4∶1混合物中，然后以大剂量的形式流过芯片上的孔。然后通过穿过阵列孔的顺式侧泵送运行缓冲液来启动减薄过程，从而将多层脂质膜减少为单个双层。
[0282]
在膜中插入α-hl-pol6缀合物：在阵列芯片的孔上形成脂质双层之后，在20℃下将全部在400mm乙酸钾、18mm乙酸镁、15mm乙酸锂、5mm tcep、50mm hepes、0.5mm edta、8％海藻糖、0.001％吐温20、0.09％proclin 300，ph 7.8的稀释缓冲溶液中的1nm的6∶1宽孔突变体α-hl-pol6缀合物(具有预结合的dna模板)添加到芯片的顺式侧。混合物中的纳米孔-聚合酶缀合物或者被电穿孔，或者自发插入到脂质双层中。非聚合酶修饰的α-hl亚基(即6∶1七聚体的6个亚基)包括h144a突变。
[0283]
如以下结果中所公开的，上表6中公开的宽孔突变体用于形成6∶1七聚体。
[0284]
dna模板为puc250环状序列，该环状序列包含如下所示的594bp索引1和索引2核苷酸序列。
[0285]
puc250索引1(seq id no：64)
[0286]
cagtcagtagagagagattggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaatt
aatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaatctctctcaaaaacggaggaggaggacagtcagtagagagagattgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccaatctctctcaaaaacggaggaggagga
[0287]
puc250索引2(seq id no：65)
[0288]
cagtcagtagagagagattgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccaatctctctcaaaaacggaggaggaggacagtcagtagagagagattggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaatctctctcaaaaacggaggaggagga
[0289]
纳米孔离子流动测量：复合物插入膜内之后，将顺式侧的溶液更换为渗透压浓度缓冲液：400mm乙酸钾、18mm乙酸镁、15mm乙酸锂、5mm tcep、50mm hepes、0.5mm edta、0.09％proclin 300，ph 7.8。添加包含一组4种不同核苷酸底物的测序溶液(每个测序标签3μm)。该组4种不同核苷酸底物中的每一种均加入500μm。反式侧的缓冲溶液是：400mm乙酸钾、18mm乙酸镁、15mm乙酸锂、5mm tcep、50mm hepes、0.5mm edta、8％海藻糖、0.001％吐温20、0.09％proclin 300，ph 7.8。这些缓冲溶液作为电解质溶液用于纳米孔离子流动测量。使用pt/ag/agcl电极设置，并且在976hz或1429hz下施加180mv、210mv、220mv或280mv峰至峰(pk-to-pk)波形的ac电流。ac电流对于纳米孔检测具有某些优势，因为它允许将标签重复地引导至纳米孔中并随后从该纳米孔中排出，从而提供更多的机会来测量由于经过该纳米孔的离子流动导致的信号。而且，正ac电流循环和负ac电流循环过程中的离子流动彼此抵消，以减少顺式侧离子损耗的净速率以及这一损耗导致的可能对信号有害的效应。
[0290]
简而言之，使用宽孔突变体α-hl纳米孔的阵列来进行穿入阻断剂引物的纳米孔测定，每个纳米孔均与pol6聚合酶变体(例如具有增加的延伸速率的核酸外切酶缺陷型pol6变体)缀合，如美国专利公开号2016/0222363a1、2016/0333327a1、2017/0267983a1、2018/0094249a1和2018/0245147a1所述，该美国专利公开中的每一者在此通过引用并入本文。
[0291]
随着带标签的核苷酸被以dna模板引物化的α-hl-pol6纳米孔-聚合酶缀合物捕获，观察到了代表每个不同聚合物部分标签导致的不同的已改变离子流动事件的标签电流水平信号。随时间推移记录这些事件的情节并分析。通常，持续超过10ms的事件指示，富有成效的标签捕获和与模板链互补的正确碱基的聚合酶并入同时发生。
[0292]
在如本文所述的纳米孔测序条件下，在纳米孔测定中评估了穿入阻断剂引物的读长和穿入百分比特性。在完成测序和分析时，收集基于高质量读段的中值读长，并且将过早结束的高质量读段占总高质量读段的百分比确定为高质量读段的测序中早期终止占所有高质量读段中的一部分。
[0293]
下表9中示出了显示对照引物和多种穿入阻断剂引物的读长和穿入百分比的纳米孔测定结果。相对于对照引物，读段阻断剂引物倾向于表现出显著增加的读长和降低的穿入百分比值。
[0294]
表：9
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