一种水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的制作方法

1.本实用新型涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒。


背景技术：

2.水稻是全世界最重要的粮食作物之一，其产量的稳定和质量的保证对粮食安全具有及其重要的意义。水稻白叶枯病是水稻的三大病害之一，对水稻的安全生产造成较大的威胁。水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的一种水稻的重要检疫性种传病害。水稻白叶枯病作为一种水稻重要检疫性种传病害，危害仅次于水稻细菌性条斑病，在我国除新疆、西藏和西南稻区以外，各大产区均有发生，云南省就有105个县发生此病。该病对产量影响较大，产量减少达20％-30％，严重时可达50％-60％，甚至颗粒无收。一般籼稻伤害重于粳糯稻，晚稻伤害重于早稻。
3.为了防治水稻白叶枯病，或是培育抗白叶枯病的水稻新品种等，通常需要配制水稻白叶枯病菌菌悬液，应用于水稻植株相关部位的接种。但是目前配制菌悬液时，采用的白叶枯病菌菌粉普遍来源于实验室直接培养，菌粉活菌数不明确，即菌的存活率未知，菌粉配制成菌悬液后致病性不确定，即不清楚是否能引起水稻发病，可能会导致接种结果不准确从而影响实验质量。目前还没有水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒相关产品的报道，尚未形成系统规范、使用方便、并能长期保存的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒等相关产品。


技术实现要素：

4.为克服现有技术的不足及存在的问题，本实用新型提供了一种水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒，能通过其中的菌粉管，及使用时能够固定在盒体的悬浮液制备管，快速制备出已知活菌浓度的白叶枯病菌悬浮液，可在水稻分蘖盛期、稻株剑叶平展期采用剪叶法接种；该制备盒能长期保存，并能根据需要时随时随地快速配制水稻白叶枯病菌菌悬液，且配制成的菌悬液活菌数和致病性明确，结构简单，使用方便，从而提高水稻品种抗性选育的效率。
5.一方面，本实用新型提供了一种水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒，主要包括菌粉管、悬浮液制备管、搅拌棒和盒体，所述菌粉管内装有喷雾干燥的已知活菌数的水稻白叶枯病菌菌粉；菌粉管、悬浮液制备管和搅拌棒都装在盒体内；所述悬浮液制备管能竖直固定在盒体内。
6.研究小组经过大量实验证明，水稻白叶枯病菌菌悬液经喷雾干燥制备的水稻白叶枯病菌菌粉，能在4℃冰箱内稳定保存一年，菌粉的活菌数和致病性都几乎没有变化。
7.本实用新型提供的水稻白叶枯病菌粉的获取方法包括以下步骤：(1)将低温冻存的白叶枯菌种在胁本哲氏马铃薯半合成培养基上培养，产生大量的菌苔；(2)用无菌水洗下菌苔，配制成细菌悬浮液(简称菌悬液)；(3)将菌悬液进行喷雾干燥处理，收集菌粉并称重；(4)测定菌粉活菌数，将适合重量的菌粉分装于离心管中，低温保存。
8.将制备的水稻白叶枯病菌粉倒入水中，菌粉可融入水中形成菌悬液，菌悬液可直接应用于水稻植株相关部位的接种。
9.为防止配制菌悬液过程中，出现悬浮液制备管翻到的情况，研究小组在制备盒的盒体内设置了悬浮液制备管的固定结构，为顺利配制菌悬液提供方便。
10.进一步地，所述菌粉管带有盖子，菌粉管内的水稻白叶枯病菌菌粉的活菌数不低于1
×
10
10
cfu/g，致病性不低于9级。
11.在一些方式中，菌粉管带有盖子，盖上盖子时可以密封保存菌粉。
12.在一些方式中，根据重量法测定菌粉活菌数，活菌数达到1
×
10
10
cfu/g，并使染病的水稻品种金刚30的致病性达到9级的菌粉，用于制备菌悬液能完全满足水稻品种抗性选育的要求，可用于制备盒的制作。
13.如果致病性低于9级，如7级、5级、3级、1级等，则不能用作制备盒的制作。
14.菌粉于4℃冰箱内稳定保存一年，期间，发明人每间隔三个月测定一次菌粉的活菌数和致病性，研究证明，一年内菌粉的活菌数和致病性都几乎没有变化。
15.进一步地，所述悬浮液制备管带有盖子，菌悬液制备管的管底带有插头，能与盒体底部的插槽配合，使菌悬液制备管在使用时，能够竖直固定在盒体内。
16.进一步地，所述菌悬液制备管的数量不少于菌粉管的数量，所述管底插头的侧面带有半圆形凸起。
17.为方便提供菌悬液，每根菌粉管至少需要一根菌悬液制备管，将菌粉管中的菌粉倒入菌悬液制备管中，再加入纯净水，搅拌棒轻轻搅动，即可制得菌悬液。
18.为了提高插头的稳定性，研究小组还在插头上设置半圆形凸起，进一步保证菌悬液制备管在菌悬液过程中不会出现翻到现象。且半圆形凸起能提高牢固性，并且在拔出和安装过程中仅需施加部分力即可，不会出现卡死现象。
19.进一步地，所述菌粉管的数量为一支以上，分别装有不同质量的水稻白叶枯病菌菌粉。
20.在一些方式中，可根据需要，在不同的菌粉管中装有不同质量的水稻白叶枯病菌菌粉，配制菌悬液时，将不同质量的水稻白叶枯病菌菌粉倒入菌悬液制备管中，从而制得不同浓度的菌悬液。
21.进一步地，所述菌粉管的数量为两支，分别为1号菌粉管和2号菌粉管，都为1.5ml规格，其中1号菌粉管装有0.05g水稻白叶枯病菌菌粉，2号菌粉管装有0.5g水稻白叶枯病菌菌粉。
22.在一些方式中，菌粉管为1.5ml规格的离心管。
23.进一步地，所述菌悬液制备管的数量为两支，分别为1号制备管和2号制备管，其中1号制备管的体积为5ml，刻度间隔为2.5ml，2号制备管的体积为50ml，刻度间隔为1ml。
24.在一些方式中，菌悬液制备管为规格分别为5ml和50ml的自立式离心管。
25.在一些方式中，菌粉活菌数为1
×
10
10
cfu/g，将0.05g菌粉加5ml水中，或将0.5g菌粉加50ml水中，即可配制成的活菌浓度为1
×
108cfu/ml的菌悬液。
26.进一步地，盒体为翻盖式塑料盒，包括盒盖和盒底，当盒盖与盒底结合时，盒体长100～150mm，宽60～100mm，高30～60mm，所述盒底的插槽内具有与半圆形凸起适配的半圆形凹槽。
27.进一步地，所述搅拌棒为聚丙烯材质，长度小于盒体长度。
28.进一步地，所述盒体的盒底高22mm，盒盖高22mm，当盒盖与盒底结合时，长120mm，宽85mm，高44mm；搅拌棒长110mm，直径5mm；菌粉管外壁标有制备菌悬液的活菌浓度和生产日期。
29.本实用新型提供的制备盒中的菌粉管外表面详细标注了与使用密切相关的信息，包括制备获得的菌悬液活菌浓度和生产日期等，可指导使用者根据具体实验需要进行针对性的选择、操作。菌粉管上面的标识具体解释如下：
30.菌悬液活菌浓度：1
×
108cfu/ml，为0.05g菌粉加5ml水或0.5g菌粉加50ml水后配制成的菌悬液活菌浓度，使用者可根据试验需要选择配制成理想剂量的菌悬液。
31.生产日期：菌粉在4℃冰箱内保质期为一年，保质期内菌粉制成菌悬液后致病性变化不大，使用者获得制备盒后需放置在4℃冰箱内保存并在保质期内使用。
32.采用本实用新型提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒制备水稻白叶枯病菌悬浮液的方法为：(1)将1号菌粉管中的0.05g菌粉全部倒入5ml自立式离心管中，加5ml纯净水，用搅拌棒轻轻搅匀，2min后，菌粉充分融入水中，5ml菌悬液制备完成；或者(2)如需用菌液量较大，将2号菌粉管中的0.5g菌粉全部倒入50ml自立式离心管中，加50ml纯净水，用搅拌棒轻轻搅匀，3min后，菌粉充分融入水中，50ml菌悬液制备完成。
33.水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒预期的使用人群主要是水稻育种者，目前很多育种团队每年需要进行白叶枯病抗性初筛的水稻材料有几千份乃至上万份，抗性鉴定接种用菌量很大。
34.本实用新型提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的有益效果为：
35.1、只需3～5min即可制备出已知活菌浓度的白叶枯病菌悬浮液，可在水稻分蘖盛期、稻株剑叶平展期采用剪叶法接种；
36.2、菌悬液制备方法简单、易操作，只需准备适量的纯净水即可；
37.3、能长期保存，可在任何时间和地点方便、快速的获得足量的活菌数和致病性明确的白叶枯病菌悬液；
38.4、可根据菌粉管外表面的信息，明确获得的菌悬液活菌浓度，可指导使用者根据具体实验需要进行针对性的选择、操作；
39.5、提高水稻品种抗性选育的效率。
附图说明
40.图1为实施例1的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的外观示意图；
41.图2为实施例1的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的内部结构图；
42.图3为实施例1的悬浮液制备管和盒体剖面结构示意图；
43.图4为实施例1的悬浮液制备管竖直固定在盒体的剖面结构示意图；
44.图5为实施例1的插头和插槽的局部放大剖面结构示意图。
具体实施方式
45.下面结合附图对本实用新型的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本实用新型的理解，而对其不起任何限定作用。
46.实施例1本实用新型提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒
47.图1-图5为本实施例提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒，其中图1为水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的外观示意图，图2为水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的内部结构图；图3为悬浮液制备管和盒体剖面结构示意图；图4为悬浮液制备管竖直固定在盒体的剖面结构示意图；图5为插头和插槽的局部放大剖面结构示意图。
48.如图1-5所示，本实施例提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒1主要包括菌粉管2、菌悬液制备管3、搅拌棒4和盒体5，菌粉管2内装有喷雾干燥的已知活菌数的水稻白叶枯病菌菌粉；菌粉管2、菌悬液制备管3和搅拌棒4都装在盒体5内；菌悬液制备管3能竖直固定在盒体5内。菌粉管2带有盖子6，菌粉管2内的水稻白叶枯病菌菌粉的活菌数不低于1
×
10
10
cfu/g，致病性不低于9级，盖上盖子6时可以密封保存菌粉，进一步保证其在保质期内的活性。活菌数达到1
×
10
10
cfu/g，并使染病的水稻品种金刚30的致病性达到9级的菌粉，用于制备菌悬液能完全满足水稻品种抗性选育的要求，可用于水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒1的制作。
49.优选的，菌悬液制备管3为带有盖子7，菌悬液制备管3的管底带有插头8，能与盒体5底部的插槽9配合，使菌悬液制备管3在使用时，能够竖直固定在盒体5内。插头8和插槽9的设置，可以防止配制菌悬液过程中，出现菌悬液制备管3翻到的情况，为顺利配制菌悬液提供方便。菌悬液制备管3即能够立式摆放，在菌悬液制备管3底面10设置了插头8，为配制菌悬液提供方便。
50.优选的，菌悬液制备管3的数量不少于菌粉管2的数量，菌悬液制备管3的管底的插头8的侧面带有半圆形凸起11。为方便提供菌悬液，每根菌粉管2至少需要一根菌悬液制备管3，将菌粉管2中的菌粉倒入菌悬液制备管3中，再加入纯净水，搅拌棒轻轻搅动，即可制得菌悬液。插头8上设置半圆形凸起11，进一步保证菌悬液制备管3在配制菌悬液过程中不会出现翻到现象，且半圆形凸起11能提高牢固性，并且在拔出和安装过程中仅需施加部分力即可，不会出现卡死现象，无需借助工具，徒手即可拆装。本实施例中，菌粉管2的数量为两支，分别为1号菌粉管12和2号菌粉管13，都为1.5ml规格的离心管，其中1号菌粉管12装有0.05g水稻白叶枯病菌菌粉，2号菌粉管13装有0.5g水稻白叶枯病菌菌粉。本实施例中，菌悬液制备管3的数量也是两支，分别为1号制备管14和2号制备管15，其中1号制备管14的体积为5ml，刻度间隔为2.5ml，2号制备管15的体积为50ml，刻度间隔为1ml。
51.优选的，盒体5为翻盖式塑料盒，包括盒盖16和盒底17，当盒盖16与盒底17结合时，盒体5长100～150mm，宽60～100mm，高30～60mm，盒底5的插槽9内具有与半圆形凸起11适配的半圆形凹槽18。
52.优选的，搅拌棒4为聚丙烯材质，长度小于盒体5长度。本实施例中，盒体5的盒底17高22mm，盒盖16高22mm，当盒盖17与盒底16结合时，长120mm，宽85mm，高44mm；搅拌棒4长110mm，直径5mm；菌粉管2外壁标有制备菌悬液的活菌浓度和生产日期。本实施例中菌粉管2上面的标识具体解释如下：菌悬液活菌浓度：1
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108cfu/ml，为0.05g菌粉加5ml水或0.5g菌粉加50ml水后配制成的菌悬液活菌浓度，使用者可根据试验需要选择配制成理想剂量的菌悬液；生产日期：菌粉在4℃冰箱内保质期为一年，保质期内菌粉制成菌悬液后致病性变化不大，使用者获得制备盒后需放置在4℃冰箱内保存并在保质期内使用。
53.采用本实施例提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒1制备水稻白叶枯病菌悬浮液
的方法为：(1)将1号菌粉管12中的0.05g菌粉全部倒入5ml的1号制备管14中，加5ml纯净水，用搅拌棒轻轻搅匀，2min后，菌粉充分融入水中，5ml菌悬液制备完成；或者(2)如需用菌液量较大，将2号菌粉管13中的0.5g菌粉全部倒入50ml的2号制备管15中，加50ml纯净水，用搅拌棒4轻轻搅匀，3min后，菌粉充分融入水中，50ml菌悬液制备完成。
54.实施例2水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的制备
55.本实施例提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的制备方法包括如下步骤：
56.(1)选用浙江省水稻白叶枯病菌优势致病型iv型菌的菌种；
57.(2)取100μl低温(-70℃)冻存的菌种保存液在胁本哲氏马铃薯半合成培养基上涂板(直径为9cm)培养，28℃培养72h，产生大量的菌苔；
58.(3)用无菌水洗下全部菌苔，配制成菌悬液；
59.(4)将菌悬液进行喷雾干燥处理，收集菌粉并称重；
60.(5)根据重量法测定菌粉活菌数，活菌数达到1
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10
cfu/g的菌粉可用于制备盒的制作；
61.(6)菌粉净重包装为0.05g和0.5g两种，将菌粉分装于1.5ml离心管中，相同批次的菌粉统一放置，于4℃冰箱内保存；
62.(7)每间隔三个月测定一次菌粉的致病性，感病品种金刚30的病级需在9级，如病级为7级或以下(5级、3级、1级)，菌粉不能用作制备盒的制作；
63.(8)制备盒的制作：将菌粉净重分别为0.05g和0.5g的两个1.5ml离心管、5ml和50ml菌悬液制备管和搅拌棒放在翻盖式塑料盒中，菌悬液制备管可通过插头立式固定在盒底带有插槽的特定位置。
64.实施例3水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒的使用
65.1、水稻处于分蘖盛期时，需要接种500丛稻苗，制备白叶枯病菌悬浮液用于叶片剪叶接种。打开水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒，取出2号菌粉管、2号制备管和搅拌棒。将2号制备管底部的插头插入在盒底插槽内，然后将2号菌粉管中的0.5g菌粉全部倒入2号制备管中，加50ml纯净水，用搅拌棒轻轻搅匀，3min后，菌粉充分融入水中，50ml菌悬液制备完成，菌悬液活菌浓度约为1
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108cfu/ml。用直头剪刀蘸取菌悬液剪去稻株上部全展叶顶部2厘米左右，每丛稻苗接种5片叶，每接种一丛后蘸取一次菌悬液。配置好的菌悬液尽量在2h内使用。
66.2、水稻处于稻株剑叶平展期时，需要接种50丛稻苗，制备白叶枯病菌悬浮液用于叶片剪叶接种。打开制备盒，取出1号菌粉管、1号制备管和搅拌棒。将1号菌粉管中的0.05g菌粉全部倒入1号制备管中，加5ml纯净水，用搅拌棒轻轻搅匀，2min后，菌粉充分融入水中，5ml菌悬液制备完成，菌悬液活菌浓度约为1
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108cfu/ml。用直头手术剪蘸取菌悬液剪去稻株上部全展叶顶部2厘米左右，每丛稻苗接种5片叶，每接种一丛后蘸取一次菌悬液。配置好的菌悬液尽量在2h内使用。
67.3、水稻处于分蘖盛期时，需要接种100丛稻苗，制备白叶枯病菌悬浮液用于叶片剪叶接种。打开制备盒，取出2号菌粉管、1号制备管和搅拌棒。将菌粉管2中的0.5g菌粉全部倒入自立式离心管1中，加5ml纯净水，用搅拌棒轻轻搅匀，3min后，菌粉充分融入水中，5ml菌悬液制备完成，菌悬液活菌浓度约为1
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109cfu/ml。用直头手术剪蘸取菌悬液剪去稻株上部全展叶顶部2厘米左右，每丛稻苗接种5片叶，每接种一丛后蘸取一次菌悬液。配置好的菌
悬液尽量在2h内使用。
68.实施例4水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒制备的菌悬液活菌数和致病性的验证
69.本实施例采用实施例1提供的水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒，分别于4℃冰箱内保存0、3个月、6个月、9个月、12个月，利用重量法测定菌粉管中菌粉的活菌数，并配制成菌悬液，感染水稻品种金刚30，观察病级指数，检测结果如表1所示：
70.表1菌悬液活菌数和致病性的验证
[0071][0072][0073]
由表1可知，本实施例采用水稻白叶枯病菌悬浮液制备盒制备的菌悬液，在经过一年的4℃冰箱保存后，仍然可以较准确地制备出所需活菌数和致病性的水稻白叶枯病菌菌悬液，完全能够实现接种量的准确控制。
[0074]
虽然本实用新型披露如上，但本实用新型并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本实用新型的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本实用新型的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。