水稻OsLecRK-S.7基因及其编码蛋白和在抗白叶枯病上的应用

水稻oslecrk-s.7基因及其编码蛋白和在抗白叶枯病上的应用
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，具体涉及水稻oslecrk-s.7基因及其编码蛋白和在抗白叶枯病上的应用。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa)作为我国主要的粮食作物，其产量和品质经常受到多种病原菌的威胁。水稻的病害种类很多，包括真菌病害(如稻瘟病)以及细菌病害(如白叶枯病)等。其中由革兰氏阴性菌稻黄单孢菌(xanthomonas oryzaepv.oryzae,xoo)引起的白叶枯病是水稻中最严重的细菌病害之一，每年给我国的水稻产量带来巨大损失。水稻感染白叶枯病后，通常减产达10％-30％，严重时可达50％以上，甚至绝收。传统使用化学药剂对白叶枯病的防治效果较差，花费成本高，且过多使用化学农药也会对环境造成极大的污染和破坏。育种实践证明通过利用白叶枯病抗性基因培育抗性水稻是当今农业生产上最有效、最经济、最环保的防治白叶枯病的方法，具有广泛的应用前景。因此，挖掘并应用水稻广谱抗病基因资源是解决病害威胁最经济有效的途径，也是实现绿色生态农业的重要保障。
3.水稻抗病基因主要可以分为主效抗病基因和抗病相关基因两大类。经过20 多年的研究，水稻中已经鉴定到多个参与调控对白叶枯病菌防卫反应的主效抗病基因(也被称为r基因)和抗病相关基因。如克隆和鉴定的xa21、xa1、xa5、 xa3/xa26、xa27、xa4、xa13、xa25、xa10、xa41(t)、xa23、xa4、xa2、xa14、 xa45(t)和xa7等，属于主效抗白叶枯病基因；如oswrky45、osedr1、osmapk6、 osmapkk4、ospad4和oslecrk-s.7等，属于抗白叶枯病相关基因。目前，生产中，常常利用r基因来培育抗白叶枯病的水稻品种。但r基因所介导的白叶枯病抗性常常抗谱窄，且抗性易丧失等缺点；抗白叶枯病相关基因可以很好的克服r基因的这些缺陷。因此挖掘更多的抗白叶枯病相关基因对于改良水稻对白叶枯病菌的抗性具有重要意义。


技术实现要素：

4.本技术目的在于克服现有技术存在的缺陷，通过对oslecrk-s.7基因的生物学功能的研究，发现oslecrk-s.7基因在水稻抗白叶枯病上具有重要调控作用，通过调节该基因表达水平影响水稻对白叶枯病的抗病性，对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病的改良上具有重要的意义。
5.第一方面，本发明提供水稻oslecrk-s.7蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在提高水稻对白叶枯病的抗病性中的应用。
6.第二方面，本发明提供水稻oslecrk-s.7蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在提高水稻对白叶枯病的抗病性的遗传育种中的应用。
7.第三方面，本发明提供水稻oslecrk-s.7蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在提高水稻对白叶枯病的抗病性的种质资源改良中的应用。
8.优选的，本发明中，所述水稻oslecrk-s.7蛋白的氨基酸序列可为以下任意一种：
9.(1)如seq id no.3所示的氨基酸序列；
10.(2)如seq id no.3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
11.(3)与如seq id no.3所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。
12.如seq id no.3所示的氨基酸序列为水稻oslecrk-s.7蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据如seq id no.3所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如seq id no.3所示的氨基酸序列具有相同功能的 oslecrk-s.7蛋白突变体。
13.优选的，本发明中，所述oslecrk-s.7蛋白的编码基因具有如下任一种核苷酸序列：
14.(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；
15.(2)如seq id no.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；
16.(3)在严格条件下可以与如seq id no.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
17.优选的，所述水稻oslecrk-s.7蛋白编码基因的编码区的核苷酸序列如seqid no.2所示。
18.优选的，上述对白叶枯病的抗病性的提高表现为水稻白枯病的病斑长度缩短。
19.优选的，上述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞、重组菌或转基因植物细胞。
20.第四方面，本发明提供一种抗白叶枯病水稻的选育方法，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，提高水稻中oslecrk-s.7蛋白的表达量；所述水稻oslecrk-s.7蛋白的氨基酸序列如seqid no.3所示。
21.优选的，所述转基因为将包含所述oslecrk-s.7蛋白的编码基因的互补表达载体导入水稻，获得转基因水稻株系。
22.作为本发明的一种优选方案，所述抗白叶枯病水稻的选育方法包括如下步骤：
23.s1、将oslecrk-s.7基因克隆到pubi载体，构建pubi-oslecrk-s.7；
24.s2、用农杆菌转化法侵染水稻，筛选鉴定得到超量表达oslecrk-s.7基因的转基因水稻植株。
25.第五方面，本发明提供一种调控水稻对白叶枯病抗性的方法，包括
26.提高水稻中水稻oslecrk-s.7蛋白编码基因的表达量；
27.所述水稻oslecrk-s.7蛋白编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示
28.与现有技术相比，本技术的有益效果在于：本发明利用反转录pcr技术从水稻中克隆到了一个凝集素类受体激酶基因oslecrk-s.7，并证实oslecrk-s.7参与了水稻对白叶枯病菌的防御反应，是一种重要的参与水稻抗病性的正调控基因。本发明有助于更好地了解oslecrk-s.7的作用机制，oslecrk-s.7的克隆为进一步了解水稻病原菌互作，抗病信号传导通路奠定基础，在育种中有较大的应用价值。
附图说明
29.图1：oslecrk-s.7全长基因组结构示意图。1-116为5'非翻译区(5'utr)， 117-2204为翻译区，2205-3953为3'非翻译区(3'utr)。
30.图2：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因oslecrk-s.7基因以及验证 oslecrk-s.7基因功能的技术流程图。
31.图3：pubi-oslecrk-s.7重组表达载体的构建流程图。pubi-oslecrk-s.7载体由原始载体pubi插入oslecrk-s.7基因后获得。
32.图4：oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系中oslecrk-s.7基因表达量检测。附图标记说明：oe-1至oe-13表示获得的oslecrk-s.7基因超量表达不同转基因株系，wt表示野生型对照。ubq作为内参基因。
33.图5：oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系接种白叶枯菌表型分析。
34.其中，a：oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系接种白叶枯病菌pxo99后的叶片染病表型；(标尺：3cm)
35.b：oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系接种白叶枯病菌pxo99后的叶片病斑长度统计。
36.oe-lecrk-s.7-2和oe-lecrk-s.7-7表示获得的oslecrk-s.7基因超量表达不同转基因株系，wt表示野生型对照。
具体实施方式
37.对序列表的说明：
38.序列表seq id no:1是oslecrk-s.7的全长基因组序列，序列长度为3953 bp。
39.序列表seq id no:2是oslecrk-s.7的cds序列，序列长度为2088bp。
40.序列表seq id no:3是oslecrk-s.7基因编码的蛋白质序列，序列长度为 695个氨基酸。
41.其中，图2描述了鉴定和分离克隆oslecrk-s.7基因以及验证oslecrk-s.7 基因功能的流程。
42.需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。
43.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；kod fx neo高保真酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司(toyobo)；载体构建过程中的核酸内切酶、rtaq酶、重组连接酶in-fusion和实时荧光定量pcr试剂盒均购自宝生物工程(北京)有限公司(takara)；大肠杆菌感受态trans1-t1购自北京全式金生物技术有限公司(transgen biotech)；用于基因克隆和qrt-pcr的反转录试剂盒分别购自宝生物工程(北京)有限公司 (takara)和北京全式金生物技术有限公司(transgen biotech)；农杆菌感受态agl0由本实验室自行制备；实验中所用的载体pubi由本实验室早期保留。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购的常规产品
44.实施例1、oslecrk-s.7基因的克隆
45.根据北京全式金生物技术有限公司transzol使用说明书提取水稻野生型武运粳7
(wyg7)植株叶片rna，按照takara公司primescript
tm
rt reagent kitwith gdna eraser(perfect real time)反转录试剂盒说明书操作将其反转录为cdna，以cdna为模板克隆oslecrk-s.7基因。
46.扩增oslecrk-s.7基因所需引物：
47.引物1：5'-cacgtggaccactagtatgcctccacgctgtaggcgcct-3'(seq id no:4)；
48.引物2：5'-gtcgactggaggatcctcagcgacaactgaagaatgcag-3'(seq id no:5)。
49.其中，引物1中下划线序列为spei的酶切位点，引物2中下划线序列为bamhi 的酶切位点。引物1和2酶切位点左侧的10个碱基为骨架载体重组片段，用于连接载体时进行同源重组连接。
50.扩增oslecrk-s.7基因pcr体系：
[0051][0052]
pcr扩增条件是：94℃预变性3min；98℃变性30s，61℃退火30s，68℃延伸2min，30个循环；68℃延伸5min。扩增产物长度为2120bp，为带有骨架载体重组片段、限制性内切酶位点及oslecrk-s.7基因。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。
[0053]
实施例2、表达载体pubi-oslecrk-s.7的构建
[0054]
如图3所示，将实施例1中pcr胶回收的oslecrk-s.7基因片段在同源重组酶in-fusion的作用下连入用spei和bamhi双酶切的胶回收载体pubi中，挑取菌落进行pcr检测，选取pcr结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pubi-oslecrk-s.7。其中，菌落pcr检测所需引物为pubi载体上引物(seq id no:6和7)，位于插入的oslecrk-s.7 基因两侧。
[0055]
菌落pcr的检测引物如下所示：
[0056]
引物3：5'-tttagccctgccttcatacg-3'(seq id no:6)；
[0057]
引物4：5'-aagaccggcaacaggattc-3'(seq id no:7)。
[0058]
pcr检测体系为：
[0059][0060]
pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸7min。
[0061]
实施例3、oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系的获得及其鉴定
[0062]
申请人将含有强启动子pubi驱动oslecrk-s.7基因全长cds的 pubi-oslecrk-s.7载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻粳稻品种武运粳7中，获得了多个独立的转基因水稻株系，利用qrt-pcr技术检测不同株系中oslecrk-s.7基因的表达水平。
[0063]
取不同转基因株系，根据北京全式金生物技术有限公司transzol使用说明书抽提rna。根据北京全式金生物技术有限公司all-in-onefirst-strand cdna synthesis supermix for qpcr(one-step gdna removal) 反转录试剂盒说明书反转录cdna。采用takara公司tb green
tm
premix ex taq tm
ii(tli rnaseh plus)荧光定量pcr试剂盒，并根据试剂盒使用说明书，在 abi 7500real time pcr system(美国applied biosystems公司)仪器上进行实时定量pcr反应。用水稻泛素化蛋白基因ubq作为内参基因。
[0064]
oslecrk-s.7基因qrt-pcr检测引物为：
[0065]
引物5：5'-aggccatgcttaattgccct-3'(seq id no:8)；
[0066]
引物6：5'-attcccgttgggcatgaact-3'(seq id no:9)。
[0067]
ubq内参基因qrt-pcr检测引物为：
[0068]
引物7：5'-caaccagctgaggcccaagaa-3'(seq id no:10)；
[0069]
引物8：5'-ccagggagataacaacggaagc-3'(seq id no:11)。
[0070]
qrt-pcr结果显示，转基因不同株系中oslecrk-s.7基因的表达水平显著高于野生型对照中的表达水平，结果见图4。
[0071]
实施例4、oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系抗病表型检测分析
[0072]
对oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系及野生型对照进行白叶枯病菌接种试验。结果显示，本发明的oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系在接种白叶枯病菌致病小种pxo99，与野生型(非转基因的水稻品种武运粳7号，下同)相比， oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系2和株系7阳性植株发病长度均显著性短于野生型对照(图5)。该结果表明，oslecrk-s.7基因超量表达水稻株系可以增强水稻对白叶枯病菌致病小种pxo99的抗性。
[0073]
以上结果表明，oslecrk-s.7基因正向调控水稻对白叶枯病的抗性。
[0074]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。