一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法

一种芹菜番茄红素
ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法
技术领域
1.本发明属于番茄红素鉴定技术领域，具体涉及一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法。


背景技术：

2.基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。具体地说是从生物体的组织、器官或细胞制取目的基因或者人工合成目的基因，将目的基因与载体的dna拼接，使重组体分子导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程可以称为基因克隆。
3.基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、连、转、选。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。
4.芹菜是我国重要的叶菜类蔬菜，在种植过程中会遭遇各种非生物胁迫，因此利用分子手段增强芹菜的抗逆性对于提高芹菜的产量及品质具有重要意义，而目前缺少一种对优质芹菜进行育种的方法，因此需要使用分子手段对优质芹菜进行质量选优。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，以解决上述背景技术中提出的芹菜是我国重要的叶菜类蔬菜，在种植过程中会遭遇各种非生物胁迫，因此利用分子手段增强芹菜的抗逆性对于提高芹菜的产量及品质具有重要意义，而目前缺少一种对优质芹菜进行育种的方法的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，包括以下步骤：
7.步骤一：选取三种伞形科蔬菜：芹菜、香菜和胡萝卜以及拟南芥的基因组数据进行lcy基因家族鉴定和分析；
8.步骤二：分析lcy基因家族的染色体定位、共线性关系、保守基序和启动子区的顺势作用元件，使用mcscanx软件对三个伞形科基因组进行共线性分析，提取含有lcy基因的同源基因对，使用tbtools软件进行可视化展示，并对lcy基因家族进行内含子、外显子结构分析，使用meme网站对lcy基因家族进行保守基序的鉴定，将基序最大搜寻数量设置为20，其他的参数默认，使用tbtools提取lcy基因上游1500bp区域，利用plantcare软件鉴定lcy基因启动子区域顺式作用原件；
9.步骤三：对芹菜、香菜、胡萝下和拟南芥的lcy基因进行了多序列比对和系统发育分析，首先，利用clustalw2进行多序列比对，然后使用iqtree软件的模型搜索功能确定最佳模型，利用evolview网站对进化树进行可视化展示；
10.步骤四：对三种蔬菜的选择压力进行计算分析，计算非用义替换ka和同义替换ks；
11.步骤五：以津南实芹为实验材料，对津南实芹进行培养，培养至60d时，选取长势一致的健康植株，分组进行不同逆境条件处理，高、低温处理通过将生长室温度分别调整为38
℃和4℃进行，处理后分别于1、2、4、8和24h后取植株叶片，利用液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用；
12.步骤六：芹菜rna提取试剂盒提取芹菜总rna，然后按照反转录试剂盒操作说明进行cdna的反转录；
13.步骤七：采用bio-radiq5荧光定量pcr系统，在96孔板中进行荧光定量pcr反应，选用芹菜actin作内参基因，采用2-δδct
方法计算基因的相对表达量。
14.优选的，所述步骤一中，将lcy基因的隐马尔可夫模型作为输入文件进行检索，鉴定拟南芥、芹菜、香菜和胡萝卜中的lcy氨基酸序列，并使用tbtools从基因组中提取鉴定到的基因，将获得的序列放入ncbi数据库进行blast检测，并命名。
15.优选的，所述步骤三中，对三种蔬菜的分析是为了研究lcy基因在三个伞形科蔬菜作物的进化关系。
16.优选的，所述步骤三中，确定最佳模型时，利用iqtree软件使用最大似然法构建进化树，重复次数设置为1000，其它参数不变。
17.优选的，所述步骤四中，通过ka和ks的比值可以同来衡量选择压力三种蔬菜的选择压力。
18.优选的，所述步骤四中，先用paraat2.0软件对三个伞形科植物lcy基因的编码序列和核苷酸序列进行比对，然后利用kaks_calculator2.0软件计算ka、ks和ka/ks值，模型设置为ng模型，当ka/ks＞1时，表示该基因对受到了正向选择，当ka/ks＜1时，表示该基因对受到了负选择，当ka/ks＝1时，表示该基因对受到了中性选择。
19.优选的，所述步骤五中，选取长势一致的健康植株时，以蒸馏水喷灌作为对照组。
20.优选的，所述步骤五中，高、低温处理的同时以200g/l的peg6000溶液和200mmol/l的nacl溶液浇灌芹菜植株模拟干旱和盐胁迫。
21.优选的，所述步骤七中，选用的芹菜荧光定量pcr总体系为20μl。
22.优选的，所述步骤七中，每个pcr反应体系中包含7.2μlddh2o、10μlsybrgreenimix、0.4μl的正、反向引物和2.0μlcdna模板。
23.与现有技术相比，本发明提供了一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，具备以下有益效果：
24.本发明通过将芹菜中番茄红素环化酶基因家族(lcy基因家族)进行鉴定，从分子层面为探究芹菜中叶黄素芹菜番茄红素环化酶基因家族鉴定及番茄红素ε-环化酶基因功能分析和β-胡萝卜素提供参考，为进一步研究lcy基因在芹菜非生物胁迫下的作用奠定基础，为后续抗逆优质芹菜育种提供了帮助。
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明提供一种技术方案：一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，包括以下步骤：
27.步骤一：选取三种伞形科蔬菜：芹菜、香菜和胡萝卜以及拟南芥的基因组数据进行lcy基因家族鉴定和分析；
28.步骤二：分析lcy基因家族的染色体定位、共线性关系、保守基序和启动子区的顺势作用元件，使用mcscanx软件对三个伞形科基因组进行共线性分析，提取含有lcy基因的同源基因对，使用tbtools软件进行可视化展示，并对lcy基因家族进行内含子、外显子结构分析，使用meme网站对lcy基因家族进行保守基序的鉴定，将基序最大搜寻数量设置为20，其他的参数默认，使用tbtools提取lcy基因上游1500bp区域，利用plantcare软件鉴定lcy基因启动子区域顺式作用原件；
29.步骤三：对芹菜、香菜、胡萝下和拟南芥的lcy基因进行了多序列比对和系统发育分析，首先，利用clustalw2进行多序列比对，然后使用iqtree软件的模型搜索功能确定最佳模型，利用evolview网站对进化树进行可视化展示；
30.步骤四：对三种蔬菜的选择压力进行计算分析，计算非用义替换ka和同义替换ks；
31.步骤五：以津南实芹为实验材料，对津南实芹进行培养，培养至60d时，选取长势一致的健康植株，分组进行不同逆境条件处理，高、低温处理通过将生长室温度分别调整为38℃和4℃进行，处理后分别于1、2、4、8和24h后取植株叶片，利用液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用；
32.步骤六：芹菜rna提取试剂盒提取芹菜总rna，然后按照反转录试剂盒操作说明进行cdna的反转录；
33.步骤七：采用bio-radiq5荧光定量pcr系统，在96孔板中进行荧光定量pcr反应，选用芹菜actin作内参基因，采用2-δδct
方法计算基因的相对表达量。
34.本发明中，优选的，所述步骤一中，将lcy基因的隐马尔可夫模型作为输入文件进行检索，鉴定拟南芥、芹菜、香菜和胡萝卜中的lcy氨基酸序列，并使用tbtools从基因组中提取鉴定到的基因，将获得的序列放入ncbi数据库进行blast检测，并命名。
35.本发明中，优选的，所述步骤三中，对三种蔬菜的分析是为了研究lcy基因在三个伞形科蔬菜作物的进化关系。
36.本发明中，优选的，所述步骤三中，确定最佳模型时，利用iqtree软件使用最大似然法构建进化树，重复次数设置为1000，其它参数不变。
37.本发明中，优选的，所述步骤四中，通过ka和ks的比值可以同来衡量选择压力三种蔬菜的选择压力。
38.本发明中，优选的，所述步骤四中，先用paraat2.0软件对三个伞形科植物lcy基因的编码序列和核苷酸序列进行比对，然后利用kaks_calculator2.0软件计算ka、ks和ka/ks值，模型设置为ng模型，当ka/ks＞1时，表示该基因对受到了正向选择，当ka/ks＜1时，表示该基因对受到了负选择，当ka/ks＝1时，表示该基因对受到了中性选择。
39.本发明中，优选的，所述步骤五中，选取长势一致的健康植株时，以蒸馏水喷灌作为对照组。
40.本发明中，优选的，所述步骤五中，高、低温处理的同时以200g/l的peg6000溶液和200mmol/l的nacl溶液浇灌芹菜植株模拟干旱和盐胁迫。
41.本发明中，优选的，所述步骤七中，选用的芹菜荧光定量pcr总体系为20μl。
42.本发明中，优选的，所述步骤七中，每个pcr反应体系中包含7.2μlddh2o、10μ
β-2)与拟南芥中的at3g10230.1(atlcy-β-1)基因同源性最高，相似度为59％。ag8g00262.1(aglcy-ε)与at5g57030.1(atlcy-ε)同源性最高，相似度为73％。ag10g02300.1(aglcy-β-1)与拟南芥中的at3g10230.1(atlcy-β-1)基因同源性最高，相似度为77％。cs03g00846.1(cslcy-β-1)和cs09g00811.1(cslcy-β-2)和拟南芥中的atlcy-β-1基因同源性最高，cs05g00306.1(cslcy-ε)和atlcy-ε基因同源性最高；dcar_020544(dclcy-β-1)和dcar_022896(dclcy-β-2)和拟南芥中的atlcy-β-1基因同源性最高，dcar_028276(dclcy-ε)和atlcy-ε基因同源性最高，通过将芹菜中番茄红素环化酶基因家族(lcy基因家族)进行鉴定，从分子层面为探究芹菜中叶黄素芹菜番茄红素环化酶基因家族鉴定及番茄红素ε-环化酶基因功能分析和β-胡萝卜素提供参考，为进一步研究lcy基因在芹菜非生物胁迫下的作用奠定基础，为后续抗逆优质芹菜育种提供了帮助。
46.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。