一种新鞘氨醇杆菌Novosphingobiumcapsulatum及其应用的制作方法

一种新鞘氨醇杆菌novosphingobium capsulatum及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种新鞘氨醇杆菌 novosphingobium capsulatum及其应用。


背景技术：

2.磷是植物生长所需的最为重要的营养元素之一。土壤无机磷有三种形态，水溶态、矿物态和吸附态，其中主要以矿物态的形态存在。矿物态磷在碱性土壤中主要是磷灰石，在酸性土壤中主要是磷酸铁铝。吸附态磷是指土壤中被土壤固相如矿物或有机物所吸持的磷酸盐，其含量一般很低。水溶态可以溶解于水，能被植物直接吸收利用的磷，在土壤中的含量非常低，主要产生自矿物态磷的溶解和吸附态磷的释放。土壤酸碱环境对土壤中磷的形态有着直接的影响，因此土壤中磷的有效性和土壤的供磷能力也与土壤酸碱环境息息相关。酸性土壤中的活性铁、铝含量较高，易与可溶性磷相结合转化为难溶性磷酸铁、磷酸铝等形态而被固定。施用磷肥时肥料中的磷也常与土壤溶液中的活性铁、铝作用而被固定，后又水解转化为磷酸盐如磷钾铝石和磷钾铁铝石，再进一步转化为闭蓄态磷酸盐，因此酸性土壤中磷的有效性和供磷能力通常较低。
3.土壤磷素的循环主要以微生物为中心，能将无效态磷转化为植物能吸收利用磷的微生物称为土壤磷素转化微生物，也称溶磷微生物，其中细菌称为溶磷菌或解磷菌,但是传统的解磷菌对难溶磷酸盐的溶解度较低。因此需要一种新鞘氨醇杆菌novosphingobium capsulatum及其应用。


技术实现要素：

4.本发明提供一种具有溶磷能力的新鞘氨醇杆菌novosphingobiumcapsulatum及其应用。
5.本发明所述的菌株为新鞘氨醇杆菌novosphingobiumcapsulatum p3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为 2021年5月31日，保藏编号cctcc no:m 2021646。所述菌株的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.除此之外，本发明还提供了上述鞘氨醇杆菌株的分离方法，包括以下步骤：
7.1)取土样于无菌环境下称取1g，置于装有9ml无菌水的三角瓶中(内有无菌玻璃珠)，28℃下160r
·
min振荡30min选择3个连续的稀释度(10
‑4,10
‑5,10
‑6)，用表面涂抹法接种于改良pko平板培养基。
8.2)2)每个平板接种土壤溶液0.1ml。接种后的平板于28℃的恒温箱中培养约4d。待菌落生长出来后，根据生长情况和溶磷菌的大小进一步筛选优势菌落。
9.3)挑取出现透明溶磷圈的菌株，连续划线培养3次，只有连续划线培养3次后仍能在pko平板上生长的菌株才被视为有效溶磷菌。
10.进一步的，所述改良pko培养基包括磷酸钙3g，蔗糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，酵母菌膏0.5g，琼脂
(10
‑4,10
‑5,10
‑6)，用表面涂抹法进行平板接种。接种培养基为改良 pko培养基(pikovskaya’s medium)，其中包括磷酸钙3g，蔗糖 10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，氯化钾 0.2g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，酵母菌膏0.5g，琼脂15g，水1000ml，ph 7.0～7.2。每个平板接种土壤溶液0.1ml。接种后的平板于28℃的恒温箱中培养约4d。待菌落生长出来后，根据生长情况和溶磷菌的大小进一步筛选优势菌落。挑取出现透明溶磷圈的菌株，连续划线培养3次，只有连续划线培养3次后仍能在pko 平板上生长的菌株才被视为有效溶磷菌。
25.实施例2溶磷菌菌株的鉴定
26.选取纯化培养的菌株，经16s rdna测序，将测序得到的序列在 ncbi中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果。经比对该序列与新鞘氨醇杆菌(novosphingobium capsulatum)的16srdna基因序列相似度高达99％。
27.实施例3溶磷菌溶解难溶磷酸盐的能力
28.在以磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、和磷矿粉为磷源的pko液体培养基中接入等量菌株制成的菌液(od600为0.5)，置于恒温摇床(160 r/min,28℃)培养7d，将培养液在4℃下离心(10000r/min)15 min，取上清液用钼锑抗比色法测定其有效磷含量，同时以不接种细菌悬液为对照，试验设置3次重复。所测有效磷含量如下表：
29.novosphingobium capsulatump3在四种磷源培养液中有效磷含量(μ g ml
‑1)
[0030][0031]
溶磷量计算公式为：
[0032]
计算公式：p＝(k
‑
k
ck
)
×
v/v1[0033]
其中：p为溶磷量(μg/ml)；k为待测细菌培养液测得效磷含量； k
ck
为不接种细菌悬液测得有效磷含量(μg/ml)；v为显色时溶液定容的体积(ml)；v1为显色时吸取上清液的体积(ml)。计算所得 novosphingobium capsulatum p3溶磷量为磷酸钙63.1μg ml
‑1、磷酸铁4.2μg ml
‑1、磷酸铝2.1μg ml
‑1、磷矿粉13.3μg ml
‑1。
[0034]
实施例4液体培养基有效磷含量动态变化
[0035]
如图1所示。使用实施例3中的方法，每间隔24h检测不同培养液中的有效磷含量，所得7d有效磷含量动态变化。
[0036]
实施例5液体培养基酸碱度动态变化
[0037]
如图2所示，每间隔24h检测不同培养液中的酸碱度，所得7d 酸碱度动态变化。
[0038]
实施例6菌液有机酸含量
[0039]
将在以磷酸钙为磷源的液体培养基中培养7d后，将培养液过0. 45μm无菌滤膜，用高效液相色谱仪测定溶液中草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸含量，如下表所示：
[0040]
在以磷酸钙为磷源的培养液中有机酸含量(mg l
‑1)
[0041][0042]
色谱条件：分析柱rp—ods—c18，柱温30℃，流动相为0.02mol /l kh2po4缓冲溶液—甲醇溶液(99∶1)，用1mol/l磷酸调节ph 至2.60，紫外检测波长210nm，进样量20μl，流速0.5ml/min。
[0043]
关于芽孢杆菌sphingobacterium multivorum的研究多集中于纤维素的分解以及石油烃类物质的分解等方面，目前尚未有溶磷方面相关的报导。
[0044]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。