一种海带多糖提取物的制备方法

1.本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种海带多糖提取物的制备方法。


背景技术：

2.海带(laminaria japomica)，别名昆布、江白菜，属于褐藻门、海带目、海带科、海带属，是一种药食同源的多年生的大型藻类，富含多种矿物元素以及生物活性成分。其中，有一种生物活性物质为海带多糖，其作为海带等褐藻所固有的细胞间多糖，存在于褐藻细胞壁基质中，是褐藻所特有的活性物质。多糖是所有生命有机体的重要组分，并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面具有重要作用。
3.目前，从海带浸提液中提取分离海洋生物活性多糖多采用热水浸提-乙醇沉淀的方法(乙醇终浓度为50％～90％)，一方面，热水浸提的提取时间长、耗能大且多糖提取率低，另一方面，乙醇在常温常压下为易挥发有机溶剂，使用大量乙醇，不仅对生产工作人员的身体以及环境造成伤害，同时使用大量乙醇也给生产企业带来较大的经济负担，并且大量储存和使用乙醇会给安全生产带来较大隐患，增加了海带多糖的生产代价。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有的乙醇沉淀法制备海带多糖生产成本高、环境污染大的技术问题，而提供一种新的海带多糖提取物的制备方法，该制备方法绿色、温和、高效且海带多糖得率高，是一种可适用于工业化生产的制备方法。
5.具体地，本发明的目的在于提供一种海带多糖提取物的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：
6.s1、预处理
7.将海带除沙洗净晾干后进行粉碎过筛，得到海带粉；
8.s2、碱洗
9.将步骤s1中所得海带粉与4～8倍海带粉重量的碱饱和溶液于常温下进行充分搅拌i，接着进行离心i，收集离心后的海带残渣i；将离心后的海带残渣i与5～10倍海带残渣i重量的去离子水于室温下进行充分搅拌ii，接着进行离心ii，收集离心后的海带残渣ii；
10.s3、微波氧化
11.将步骤s2中所得海带残渣ii与5～10倍海带残渣ii重量的去离子水、0.2％～2％海带残渣ii重量的双氧水充分搅拌得到反应液；对所述反应液施加微波功率，得到海带多糖初提液；
12.s4、发酵
13.将益生菌接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，得到海带多糖发酵粗产物；所述液体发酵培养基中含有3～6wt％步骤s3中所得海带多糖初提液；
14.s5、酶解
15.将步骤s4中所得海带多糖发酵粗产物进行蛋白酶水解，得到酶解后海带多糖粗产
物；
16.s6、纯化
17.将步骤s5中所得酶解后海带多糖粗产物进行透析、减压浓缩干燥得到2000～20000da的海带多糖提取物。
18.在一种优选的实施方式中，步骤s2中，碱饱和溶液为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
19.在一种优选的实施方式中，步骤s2中，搅拌i的条件包括搅拌时间为20～40min，离心i的条件包括离心转速为5000～20000rpm，离心时间为10～20min。
20.在一种优选的实施方式中，步骤s2中，搅拌ii的条件包括搅拌时间为20～40min，离心ii的条件包括离心转速为5000～20000rpm，离心时间为10～20min。
21.在一种优选的实施方式中，步骤s3中，所述微波功率施加方式为连续微波和/或脉冲微波，施加时间为20min～60min。
22.在一种优选的实施方式中，步骤s4中，所述发酵培养的条件包括为益生菌的接种量为3％～8％，发酵温度为30～40℃，发酵过程中，转速为100～300rpm，不通气培养10～20h，ph降至4.0～4.5，发酵结束。
23.在一种优选的实施方式中，步骤s4中，所述益生菌为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、乳酸菌和酵母菌中的至少一种。
24.在一种优选的实施方式中，步骤s5中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶中的至少一种。
25.在一种优选的实施方式中，步骤s5中，所述酶解的条件包括酶解时间为0.5～2h，酶解温度为30～40℃。
26.在一种优选的实施方式中，步骤s6中，所述透析的条件包括超滤和渗滤并回收渗透物，再将渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，透析次数为5～8次，透析时间为2～3h/次。
27.本发明的关键在于将微波氧化-发酵偶联法用于提取海带中的海带多糖，双氧水是一种绿色环保的氧化剂，将其配以微波使用不仅可以有效破坏稳定的糖苷键、破坏细胞壁结构以提高细胞壁纤维素的水解效率，而且反应条件温和、反应速率快，同时与生物发酵法协同使用，可以显著提高海带多糖的得率和纯度，具有良好的大规模工业化生产优势。
具体实施方式
28.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
29.需要说明的是，本发明所涉及到的原材料均可以在市面上购买，其中，海带购自福建省厦门市集美区嘉庚农贸市场。
30.本发明提供了一种海带多糖提取物的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：
31.s1、预处理
32.将海带除沙洗净晾干后进行粉碎过筛，得到海带粉；优选地，采用粉碎机对海带进行粉碎，并采用筛选机对所得海带粉进行筛选，为了提高提取效率，筛选出的海带粉粒径大小可以为20～60目，具体地，粒径大小可以为20目、30目、40目、50目、60目以及它们之间的任意值。
33.s2、碱洗
34.将步骤s1中所得海带粉与4～8倍海带粉重量的碱饱和溶液于常温下进行充分搅拌i，接着进行离心i，收集离心后的海带残渣i；将离心后的海带残渣i与5～10倍海带残渣i重量的去离子水于室温下进行充分搅拌ii，接着进行离心ii，收集离心后的海带残渣ii；
35.需要说明的是，在本发明中，为了便于描述，将碱洗处理过程中的两次搅拌称为“搅拌i”和“搅拌ii”、两次离心称为“离心i”和“离心ii”以及两次所得产物称为“海带残渣i”和“海带残渣ii”的目的仅是为了区别不同对象，而不能理解为指示或暗示其的相对重要性。
36.步骤s2中，碱饱和溶液为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。优选为碳酸氢钠和/或碳酸轻钾。步骤s2中，搅拌i的条件包括搅拌时间可以为20～40min，例如20min、30min、40min。离心i的条件包括离心转速可以为5000～20000rpm，例如5000rpm、10000rpm、15000rpm、20000rpm。离心时间为10～20min，例如10min、15min、20min。步骤s2中，搅拌ii的条件包括搅拌时间为20～40min，例如20min、30min、40min。离心ii的条件包括离心转速为5000～20000rpm，例如5000rpm、10000rpm、15000rpm、20000rpm。离心时间为10～20min，例如10min、15min、20min。通过碱液的快速洗涤，可以将海带中的脂质杂质以及部分灰分如碘化钾和/或碘化钠洗脱掉。
37.s3、微波氧化
38.将步骤s2中所得海带残渣ii与5～10倍海带残渣ii重量的去离子水、0.2％～2％海带残渣ii重量的双氧水充分搅拌得到反应液；对所述反应液施加微波功率，得到海带多糖初提液；
39.步骤s3中，所述微波功率施加方式为连续微波和/或脉冲微波，施加时间为20min～60min，例如20min、30min、40min、50min、60min。本发明中所采用的双氧水是一种绿色环保的氧化剂，将其配以微波使用不仅可以有效破坏稳定的糖苷键，破坏细胞壁结构以提高细胞壁纤维素的水解效率，而且反应条件温和、反应速率快，可以在较短的时间内(60min)就能够实现细胞壁的破裂并且释放出海带多糖。
40.s4、发酵
41.将益生菌接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，得到海带多糖发酵粗产物；所述液体发酵培养基中含有3～6wt％步骤s3中所得海带多糖初提液；
42.步骤s4中，所述液体发酵培养基的配方为：每1l水中含有：50g步骤s3中所得海带多糖初提液、5g三水合乙酸钠、2g三水合磷酸氢二钾、l g吐温80、0.2g七水合硫酸镁以及0.05g一水合硫酸锰，ph值为7。
43.步骤s4中，所述发酵培养的条件包括为益生菌的接种量可以为3％～8％，例如3％、4％、5％、6％、7％、8％。发酵温度可以为30～40℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。发酵过程中，转速可以为100～300rpm，例如100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm。发酵过程中，不通气培养10～20h，例如10h、12h、14h、16h、18h、20h。当ph将至4.0～4.5，例如4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5，发酵结束。
44.步骤s4中，所述益生菌可以为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、乳酸菌和酵母菌中的至少一种。经过微生物的进一步发酵，可以显著提高海带多糖的得率和纯度，可以进行大规模的工业化生产。
45.s5、酶解
46.将步骤s4中所得海带多糖发酵粗产物进行蛋白酶水解，得到酶解后海带多糖粗产物；
47.步骤s5中，所述蛋白酶可以为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶中的至少一种，优选为中性蛋白酶。步骤s5中，所述酶解的条件包括酶解时间为0.5～2h，例如0.5h、1.0h、1.5h、2h。酶解温度为30～40℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。经过蛋白酶的水解反应，可以将海带中的粗蛋白杂质完全去除，只得到海带多糖提取物。
48.s6、纯化
49.将步骤s5中所得酶解后海带多糖粗产物进行透析、减压浓缩干燥得到2000～20000da的海带多糖提取物；
50.步骤s6中，所述透析的条件包括超滤和渗滤并回收渗透物，再将渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，透析次数为5～8次，例如5次、6次、7次、8次。透析时间为2～3h/次，例如2h/次、2.1h/次、2.2h/次、2.3h/次、2.4h/次、2.5h/次、2.6h/次、2.7h/次、2.8h/次、2.9h/次、3h/次。本发明中采用蒸馏水对酶解后海带多糖粗产物进行透析，也即先通过20000da膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～20000道尔顿的海带多糖。此后，将透析处理后所得到的海带多糖提取物溶液采用旋转蒸发仪进行减压浓缩处理，待除去80％水分后，分装入离心管，放进冰柜进行冷冻，结冰冻实之后，将其放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得到分子量分布为2000～20000da的海带多糖提取物。
51.以下根据各实施例对本发明的技术方案更进一步进行描述和说明。
52.实施例1
53.s1、预处理
54.将海带用自来水除沙洗净晾干后进行粉碎过60目筛，得到海带粉。
55.s2、碱洗
56.将步骤s1中所得海带粉(1000g)与4倍海带粉重量的碳酸氢钾饱和溶液于常温下进行充分搅拌20min，以20000rpm转速进行离心10min，收集碱洗后的海带残渣；将碱洗后的海带残渣与8倍碱洗后海带残渣重量的去离子水于室温下进行充分搅拌20min，以20000rpm转速进行离心10min，收集水洗后的海带残渣待用。
57.s3、微波氧化
58.将步骤s2中所得水洗后的海带残渣与10倍水洗后的海带残渣的去离子水、0.2％水洗后的海带残渣重量的双氧水充分搅拌得到反应液；将上述反应液置入微波反应腔中，在5kw连续微波功率下辐照至有液体回流，反应30min，得到海带多糖初提液。
59.s4、发酵
60.将正常培养的酵母菌以3％接种量接于装有10l的ph为7.0的液体发酵培养基的发酵罐中，于37℃下进行发酵培养，发酵过程中，转速为300rpm，不通气培养10h，ph降至4.2左右，发酵结束，得到海带多糖发酵粗产物。所述液体发酵培养基的配方为：每1l水中含有：50g步骤s3中所得海带多糖初提液、5g三水合乙酸钠、2g三水合磷酸氢二钾、l g吐温80、0.2g七水合硫酸镁以及0.05g一水合硫酸锰，ph值为7。
61.s5、酶解
62.在上述培养体系中加入50g中性蛋白酶，在37℃下进行水解1h，得到酶解后海带多糖粗产物。
63.s6、纯化
64.将步骤s5中所得酶解后海带多糖粗产物先通过20000da膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～20000道尔顿的海带多糖。此后，将透析处理后所得到的海带多糖提取物溶液采用旋转蒸发仪进行减压浓缩处理，待除去80％水分后，分装入离心管，放进冰柜进行冷冻，结冰冻实之后，将其放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得到海带多糖提取物，其产量与纯度见表1。
65.实施例2
66.与实施例1相同，其区别在于步骤s4中采用枯草芽孢杆菌进行微生物发酵，其余步骤保持不变，所得海带多糖提取物的产量与纯度见表1。
67.对比例1
68.与实施例1相同，其区别在于步骤s3中不加入双氧水，直接用于微波反应，其余步骤保持不变，所得海带多糖提取物的产量与纯度见表1。
69.对比例2
70.与实施例1相同，其区别在于步骤s3不采用微波方式，采用在100℃下进行加热处理10h，直接用于微波反应，其余步骤保持不变，所得海带多糖提取物的产量与纯度见表1。
71.对比例3
72.与实施例1相同，其区别在于不进行微生物发酵培养，其余步骤保持不变，所得海带多糖提取物的产量与纯度见表1。
73.表1
74.测试项目实施例1实施例2对比例1对比例2对比例3产量/g356342169182156纯度/％92.293.368.659.745.6
75.从表1试验结果可知，本发明采用双氧水配以微波对海带进行微波氧化，同时与生物发酵法协同使用，可以显著提高海带多糖的得率和纯度，是一种经济高效的分离方式，具有良好的大规模工业化生产优势。
76.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。