lncRNA分子在诊断肿瘤化疗耐药性试剂中的应用及检测试剂盒

lncrna分子在诊断肿瘤化疗耐药性试剂中的应用及检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种lncrna分子在诊断肿瘤化疗耐药性试剂中的应用及检测试剂盒。


背景技术：

2.尽管crc的诊疗方法不断进步，但由于crc早期发病隐匿，初诊时往往已经呈进展期或晚期。作为肿瘤发展的一部分，化疗耐药是阻碍治疗的重要限制因素。目前，中晚期结直肠癌患者需采取手术为主辅以化疗的综合治疗方案，并将含有奥沙利铂(oxaliplatin,ox)的folfox和capeox方案确立为一线化疗方案。而ox的耐药严重影响化疗效果。因此，ox在结直肠化疗中的耐药问题在临床上亟待解决。对于crc疾病进展快且容易产生耐药的困境，目前仍无有效的干预手段。因此，加强crc是否化疗耐药的早期诊断研究，建立新的crc化疗耐药的诊断标准，进而探索新的干预措施，提高crc 的治疗效果，增加患者的存活率和生活质量对疾病的治疗和预防具有重大的意义。
3.lncrna作为一类不编码蛋白质的rna分子不断受到研究者们的关注。与以往研究较为深入的小分子rna相比，其空间结构较为复杂，参与表达调控的机制更加多样。lncrna 作为人类基因组中重要调节因子，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。多种 lncrna在crc的发生发展中起到关键作用。如lncrna zfas1通过nop58募集上调小核仁rna介导的2'-o-甲基化，促进crc的增殖进展。linc00152通过上调fascin肌动蛋白结合蛋白1的表达，促进crc的增殖和转移。lncrna ccal可以通过与hur相互作用，降低肿瘤对化疗的敏感性，值对体外细胞具有一定程度的诊断价值，同时缺乏临床数据的支持。然而，目前临床上对于crc化疗耐药仍然缺乏具有诊断价值的检测指标。


技术实现要素：

4.本技术提供了一种lncrna分子在诊断肿瘤化疗耐药性试剂中的应用及检测试剂盒，以解决诊断结直肠癌化疗耐药性无法进行早期诊断的技术问题。
5.第一方面，本技术提供了一种lncrna分子在诊断肿瘤化疗耐药性试剂中的应用，所述lncrna分子的序列如核苷酸序列如seqid no.1所示；
6.其中，经肿瘤化疗药的受试者与未经肿瘤化疗药的对照受试者的所述lncrna分子含量的参考值范围相比，经肿瘤化疗药的受试者的所述lncrna分子含量升高。
7.可选的，所述肿瘤化疗耐药性的药物包括奥沙利铂。
8.可选的，在0-100μm奥沙利铂处理肿瘤细胞的情况下，所述lncrna分子表达量上调促进癌细胞的增殖。
9.可选的，所述处理时间为24-48h。
10.可选的，所述lncrna分子的表达水平通过微阵列分析、逆转录酶聚合酶链式反应和基因表达的任意一种方式进行分析检测。
11.可选的，所述lncrna分子含量与肿瘤化疗耐药性的关系为正相关。
12.可选的，所述肿瘤包括结直肠癌肿瘤。
13.第二方面，本技术提供了一种诊断肿瘤化疗耐药性试剂，包含检测lncrna分子的引物，所述lncrna分子的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述引物的序列如seqid no.2-3所示。
14.第三方面，本技术提供了一种lncrna分子在抑制癌症细胞药物中的应用，所述lncrna 分子的序列如核苷酸序列如seqid no.1所示；
15.其中，抑制所述lncrna分子的表达，抑制癌细胞增殖。
16.由图1可知，通过lncrna分子的过表达可以诱使癌细胞的增值，通过抑制剂敲低该新型 lncrna的表达，可以抑制癌细胞增殖，可以用于crc的治疗，
17.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
18.本技术实施例提供的lncrna分子在诊断肿瘤化疗耐药性试剂中的应用，且发现其与 crc细胞化疗耐药存在关联性，可以用于判断crc细胞对奥沙利铂化疗耐药性，可以用于制备诊断肿瘤化疗耐药性试剂。
附图说明
19.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为本技术实施例提供的linc00893对crc患者总生存时间的影响图；
22.图2为本技术实施例提供的初发早期、中晚期以及化疗后复发的crc患者肿瘤组织中检测linc00893的表达差异图；
23.图3为本技术实施例提供的三种正常肠上皮细胞(ncm356、hiec-6和fhc)，三种 crc细胞系(hct116、ht29和caco2)以及三种ox耐药细胞系(hct116r、ht29r和caco2r)中linc00893的表达水平图；
24.图4为本技术实施例提供的同药物诱导浓度下亲代crc细胞和ox耐药细胞间ic50 的差异倍数。
25.图5为本技术实施例提供的hct116细胞分别过表达和敲低linc00893后流式细胞检测细胞的基础凋亡率变化图；
26.图6为本技术实施例提供的亲代hct116细胞经裸鼠皮下成瘤大小图；
27.图7为本技术实施例提供的化疗后复发和未复发的肠癌组织对比和fish染色发现复发组肠上皮细胞cplc表达荧光强度明显升高；
28.图8为本技术实施例提供的小鼠活体成像显示相比于成瘤裸鼠的对照图。
具体实施方式
29.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
30.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。例如，室温可以是指10～ 35℃区间内的温度。
31.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
32.下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
33.实验材料：细胞系：三种正常肠上皮细胞(ncm356、hiec-6和fhc)，三种crc细胞系(hct116、ht29和caco2)购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
34.临床组织样本：10例化疗后未复发和10例化疗后复发的crc初发时的组织标本。石蜡包埋crc样本用于原位杂交(fish)分析。该研究是根据赫尔辛基宣言进行的，该方案经中南大学湘雅医院伦理委员会批准(项目识别代码：202109016)。
35.实施例1耐药肿瘤细胞的构建
36.1)取对数生长期的细胞，接种于96孔板内，待细胞贴壁后，换上带有不同梯度浓度的奥沙利铂的培养基(如0.1，0.25，0.5，1，2，5，10，25，50，100μm)。
37.2)于不同的时间点检测细胞增殖情况。
38.3)计算细胞的ic50。
39.4)培养24-48小时，期间注意观察细胞的存活情况，出现大量细胞凋亡时，换液，加入正常培养基继续培养至细胞恢复至60％，改用更低浓度药物。
40.5)每3-5天换液，继续用含有低浓度药物的培养基培养直至细胞适应了这个浓度 (不再出现凋亡)，可提高药物浓度(其实阶段要缓慢提高)。
41.6)重复上述步骤，即让细胞不断适应新的更高的浓度，直至细胞能耐受的浓度符合预期(比较理想的情况是，细胞能耐受的浓度是亲本株的10倍以上)，即为耐药细胞株，可进行下一步实验和冻存。
42.经实验得到一种长链非编码rna新型转录本，即lncrna分子，作为评价crc化疗耐药性的标记物，其基因号：ensg00000241769，位于人染色体xq28，lncrna分子全长为2367bp，其核酸序列如下：
43.gcugcgggaaauugcuggagaagggggagccaagcuggaguaaggcuggcggucucccgca uugacuucauaaccaaguucugggucccugccucuggagugccugaugagacaaaacggcuc cucguccugcauccccgcugcuacuuccagaauucaggccucguggucuggagccugcacug uuccaugagccuccugagcaaccuggaguccucugucuuucuucccucagugagaugcgccu acuucucccuggagaagcucgaggaagcaggaaugcuggagaugagcugcuccucacucuca cuccugggugugcugggcaguggggugcaaugugcacguaggugcacacucucccugggcg gcagcgagaagcagaggucugaucuguggucggaugaggagaggaagugcaaguaaagcag cugcagcgagaccucgucugcucaggggcuuguucuuacaucuuuugcagggcuguuuuga agucaguauucacuuaagcacuccaaauuacccagcacacccugccugcauggcgcugcgcu gcaccuucacucuggucacgggucuggcagucggcucaccaauucguccugcuucccuggga cucgccggcuuuuagcacugcaauucacucagcaaacugggacuguuggu
cacccuaccugg cagccagugauaaggugagggccacuccugggagggaggacaccuguggggaaaauucuug uguuauuuauuucuccuucgggauagggugccugcagcgcuucaugggagggggugggcug augcugcgggcucagaaguuucaagggcaucuggggagaccagauauucagagaccuucuc cuagaugugccuguuccauguaucagggacacagguuuucccaacagggcuggugucauug gcaugacagaccugccuuggcugagcguucacccgucuucggaguucagccaccuuagcaag uccuggguuuguucuucagauuuugcugcucgcccauugccuggaucgggggcuacuuugu aaaccaccaggaagacuccaguguuucugcuuaauuuuuagauguuuguuaauugcucuug gccucucauuaauccccugugggucauccaggaaauauacucaccacugucuguucucugag uuuucauuuccaggcauccgcccugccuggaucuccucaccugccaggaacuuccucuccac aagccggccaucccagcaaaaguucuaacaccaaagaugacugccaggggcaugaagggga ugugcuuccagggcauuugcuggcagggcgucucgugaucucuugguauuggugugagcac agccuggcaggagagggcagaucuccaugcaaaguaugucagaaagcagauggaagccagg cccccuccugaaagaggcuccuugaagauaauucuaacaucuuugucaucaguguugacauc ucuugauuguauccugucauuccauuugagaucuuccugguucuggcuggcauccucugac aucacuccagcagaagaaagggaaggaacacgcugcauuacugcguggucacaagguccccg ucugaucugccuucacuccaccuuucagagucuuauguuuguuuuguguauauuaucaagg gguuuuaggucacuuagucggaagaauagggaaaaguaugucuacuccagcuuaauggaag uggaauucuccugagaaccuuuuuuugauacaaaauauguacuugugcauauuuuguauca aaauauauaauguacaugucccuuuuguacauguauauaaauuguauauaaauauuuaggg uuauaaaaauaaccaaagacaccaaaaacugccacagguggauuugagaagauguggaaau gccucacugcuaagacaugcucauucuugacaggcugggaacccugaaugcuguagugucac cacugcccuguccuguaccuaccuaucuuuucacucauuuccuccaagcucagguuuucagu uugggguaugugccaccuaacagugagcuguggaacugcagcacaaucaucaaauucaaaa aaggcaaggacaucuugcucaguuuuuaagauacgccauagauggaguaaaccauaaccuu ugauuccagauccuuaacccugauuaaaaacaacacaacccuucauguugauuuaaaacau cccuugcaaaagaugguuugaauauuccaaguuggaaauacccagucuuuuaaaguuacag cacccuuuuugauacaaaaaaugugcaugacagaaauuguacagugaguaguguuauaaaa auaaccaaacacaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
44.实施例2提取lncrna分子
45.rna fish试剂盒产自ribobio(广州)。实验按照试剂盒说明书进行。将对数生长期的细胞被放置在带有无菌载玻片的6孔板中。待细胞融合度达到60％后，加入4％多聚甲醛固定10min。将特异性探针与杂交溶液混合后加入细胞中，37℃杂交。然后用dapi染色，pbs 洗涤，最后用激光共聚焦显微镜观察细胞。lncrna分子即linc00893的探针序列如下： 5
’‑
cy3-aggacguaggggcgacgaugaaggucu-3’。
46.接着，使用takara rna提取试剂盒(takara，日本)分离rna。用分光光度计测定提取rna的纯度和浓度，反转录合成cdna。我们使用abi 7500实时定量pcr仪(abi,usa) 进行pcr检测，以gapdh为内参。95℃预变性2分钟，95℃预变性8秒，58℃预变性35秒，72℃预变性40秒。这被认为是一个周期，整个过程总共需要40个周期。目的基因表达相对值以2-δδct表示。本实验中使用的linc00893引物序列如如seqid no.3-4所示： forward 5
’‑
cggtctcccgcattgacttc-3’；reverse 5
’ꢀ‑
ggaggctcatggaacagtgc-3’。
47.用annexin-v fitc/pi(invitrogen,ca,usa)双染色法检测肿瘤细胞凋亡情况。将细胞以 2
×
105cells/ml的浓度接种于6孔板中。实验处理后，细胞在细胞培养箱中培养48小时。收集细胞，调整细胞浓度至4
×
105cells/ml。pbs洗涤2次后，用500μl pbs溶液重悬细胞。每孔加入5μl annexin-fitc和5μl pi，室温混合孵育30分钟。最后，流式细胞术检测细
胞的凋亡。
48.实施例3
49.为了获得linc00893在细胞内过表达和敲低的效果，实验中所用的质粒和慢病毒用于过表达的质粒及相应对照空载质粒购自上海吉凯基因，并经测序验证其质量。根据我们验证的新型lncrna的序列，过表达质粒所用载体名称：gv146元件顺序：
50.cmvmcs-ires-egfp-sv40-neomycin。用于敲低的慢病毒及对照慢病毒都购自上海吉凯基因，并经测序验证其质量。根据3条sirna的敲低效率，选择敲低效率最高的sirna-1，根据其核心靶序列设计shrna慢病毒系统。shrna慢病毒所用载体名称：gv248，元件顺序：hu6-mcs-ubiquitin-egfp-irespuromycin。
51.实施例5
52.检测肿瘤细胞中linc00893的表达来判断肿瘤对奥沙利铂化疗的耐药情况
53.实验步骤包括：
54.1.提取不同来源的crc肿瘤细胞中的rna。
55.2.qpcr检测linc00893表达的差异。
56.3.fish检测linc00893的表达及分布。
57.4.检测不同来源的细胞对奥沙利铂的ic50。
58.实验结果：linc00893在细胞的表达水平与其对奥沙利铂的耐药性成正相关，即 linc00893表达水平越高，其对奥沙利铂耐药性越强(图2-3)。
59.实施例6linc00893高表达的肿瘤组织不易被奥沙利铂杀灭
60.实验步骤包括：
61.1.构建linc00893稳定过表达的肿瘤细胞机器对照组。
62.2.建立小鼠移植瘤模型，并对模型予以奥沙利铂化疗处理。
63.3.比较不同时间点肿瘤的大小。
64.实验结果：linc00893高表达的肿瘤组织不易被奥沙利铂杀灭(图8)。提示linc00893 可以作为实验动物水平评价肿瘤对奥沙利铂的耐药性的指标。
65.附图1-4的详细说明：
66.如图1所示，为实施例3提供的图tcga数据库分析linc00893对crc患者总生存时间的影响图，图中显示了高表达lncrna分子的患者存活率低于低表达lncrna分子的患者存活率。
67.如图2所示，为实施例提供的初发早期、中晚期以及化疗后复发的crc患者肿瘤组织中检测linc00893的表达差异图，其中，化疗后复发的crc患者肿瘤组织中检测linc00893的表达高于初发早期、中晚期的crc患者肿瘤组织，说明了linc00893的表达量与crc细胞化疗耐药存在关联性，可以用于判断crc细胞对奥沙利铂化疗耐药性。
68.如图3所示，qpcr检测三种正常肠上皮细胞(ncm356、hiec-6和fhc)，三种crc细胞系(hct116、ht29和caco2)以及三种ox耐药细胞系(hct116r、ht29r和caco2r) 中linc00893的表达水平图，从图中可知，耐药细胞系中linc00893的表达水平高，说明了在体外细胞中，linc00893的表达水平能够反应crc细胞对奥沙利铂的耐药性。
69.如图4所示，在0-100um的不同奥沙利铂药物诱导浓度下，亲代crc细胞和ox耐药细胞间ic50的差异倍数，说明了随着诱导药物的浓度升高，crc细胞对于ox的耐药性也随之升
高，二者之间呈正相关性。
70.如图5所示，将hct116细胞分别过表达和敲低linc00893后，流式细胞检测细胞的基础凋亡率变化图，说明了linc00893能够抑制crc细胞的凋亡；nc代表了linc00893未过表达的对照组crc细胞；linc00893代表了linc00893过表达的crc细胞；si-nc代表了 linc00893未敲低的对照组crc细胞，si-linc00893代表了linc00893敲低的crc细胞。
71.如图6所示，利用亲代hct116细胞经裸鼠皮下成瘤后，将小鼠经尾静脉注射慢病毒载体敲低linc00893水平，比较小鼠成瘤的大小，lv/sh-scramble组代表了linc00893未敲低的对照组，lv/shlinc00893代表了linc00893敲低的实验组lv/shlinc00893组成瘤小，说明了敲低linc00893的表达能够抑制肿瘤的进展。
72.图7是经过化疗后复发(左下)和未复发(左上)的肠癌组织对比，说明了linc00893 高表达的肿瘤更容易产生化疗后的复发，fish染色发现复发组肠上皮细胞linc00893表达荧光强度明显升高，说明了linc00893的高表达相比于低表达更易产生化疗耐药；
73.图8是小鼠活体成像显示相比于成瘤裸鼠的对照图，左图为linc00893未过表达奥沙利铂治疗组，说明奥沙利铂在linc00893未过表达组中对肿瘤的进展具有抑制作用，右图代表了linc00893过表达奥沙利铂治疗，右图中奥沙利铂治疗后肿瘤组织更大更明显，说明了linc00893过表达组的成瘤鼠表现出更明显的奥沙利铂抗性。
74.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
75.以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。