一种重组大肠杆菌及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物工程领域，涉及一种重组大肠杆菌及其制备方法与应用，尤其是一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法。


背景技术：

2.丙二酸主要用于香料、胶粘剂和树脂添加剂等的生产，也可用于皮革制品或铝制品表面处理剂、泡沫塑料发泡剂和核反应器的化学清洗剂，如丙二酸是生产农药杀菌剂富士一号、除草剂枯杀达、植物生长调节剂吲熟酯的原料；医药行业使用丙二酸制备利尿药苯磺唑酮、抗炎药羟苯保泰松、镇静药溴甲辛托品等；丙二酸加热后生成二氧化碳和水，没有污染问题，所以可直接用作铝表面处理剂。此外，丙二酸及其酯类也可广泛用作医药中间体，丙二酸的两个羧基中的羟基全被乙氧基取代而生成的化合物丙二酸二乙酯是重要的有机合成原料，用于染料和药物合成，如制造巴比妥类药物，维生素b1和b6等。随着目前国内和国际化工行业的快速发展，加上丙二酸的用途的大力开发，丙二酸的产量和品质在日剧上升。
3.丙二酸现在应用于实际生产中的主要合成方法为化学合成法。主要有两种生产路线，一是丙二酸酯用硫酸在80-90℃水解，该法特点是工艺路线及生产周期短、三废少，但该水解过程属于可逆反应，且丙二酸受高温容易发生脱羧反应分解生成乙酸、水和二氧化碳，故产品收率低，但该方法易控制杂质的产生，所以产品的纯度较高；二是酯交换工艺，只要控制原料的纯度，就可以制备含量高、杂质少、水份低的高纯度丙二酸且得到的副产可以制备纯度较高的乙酸乙酯，此法的缺点是：需要用到乙酸、有刺鼻酸味、另有副产乙酸乙醋和乙醇的混合溶液产生，不好处理。
4.丙二酸的生物合成途径还没有得到很好的发展，已知的方法是通过丙二酰-coa水解酶活性从丙二酰-coa产生丙二酸的方法(wo 2013134424)。但是，丙二酰-coa途径的代谢物生产效率比天冬氨酸途径低，因此，利用天冬氨酸途径生产丙二酸是一种效率更高的方法。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明首先提供了能产丙二酸的重组大肠杆菌，能够以葡萄糖为原料，由草酰乙酸-天冬氨酸途径合成丙二酸，该重组大肠杆菌是分模块组成型过量表达大肠杆菌(escherichia coli)来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、天冬氨酸转氨酶aspc、天冬氨酸-α脱羧酶pand和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0132、大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶ynei和谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)来源的丙酮酸羧化酶pyc。本发明构建的丙二酸合成途径示意图如图1所示。
6.在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌为bl21(tpp)，其是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，所述分模块组成型过量表达是将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、所述天冬氨酸
转氨酶aspc、所述天冬氨酸-α脱羧酶pand、所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0132、所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei和所述丙酮酸羧化酶pyc都单独表达。
7.在一些实施方案中，所述大肠杆菌bl21(scr)，其是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，所述分模块组成型过量表达是将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和所述天冬氨酸转氨酶aspc融合表达，将所述天冬氨酸-α-脱羧酶pand和所述丙酮酸羧化酶pyc单独表达，将所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶融合表达pa0132。
8.在一些实施方案中，上述重组大肠杆菌中，所述分模块组成型过量表达使用的启动子是组成型启动子ml2719，其序列如seq id no:39所示。
9.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，以大肠杆菌bl21(de3)为宿主。
10.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、天冬氨酸转氨酶aspc和天冬氨酸-α-脱羧酶pand来自大肠杆菌bl21(de3)。
11.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei来自大肠杆菌k12。
12.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc的蛋白序列如seq id no:35中第1-883位所示；
13.所述天冬氨酸转氨酶aspc的蛋白序列如seq id no:35中第904-1299位所示；
14.所述天冬氨酸-α-脱羧酶pand的蛋白序列如seq id no:38所示；
15.所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶pa0132的蛋白序列如seq id no:36中第483-930位所示；
16.所述琥珀酸半醛脱氢酶ynei的蛋白序列如seq id no:36中第1-462位所示；和/或
17.所述丙酮酸羧化酶pyc的蛋白序列如seq id no:37所示。
18.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和所述天冬氨酸转氨酶融合表达的蛋白的连接肽序列如seq id no:26所示。
19.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述琥珀酸半醛脱氢酶和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶融合表达的蛋白的连接肽的序列如seq id no:26所示。
20.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和所述天冬氨酸转氨酶融合表达的蛋白序列如seq id no:35所示。
21.在一些实施方案中，上述任一所述的重组大肠杆菌中，所述琥珀酸半醛脱氢酶和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶融合表达的蛋白序列如seq id no:36所示。
22.本发明的第二个目的是提供一种构建上述任一所述的重组大肠杆菌的方法，包括将含有编码大肠杆菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因ppc、天冬氨酸转氨酶的基因aspc、天冬氨酸-α-脱羧酶的基因pand以及编码铜绿假单胞菌来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶的基因pa0132、编码大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶的基因ynei和编码谷氨酸棒状杆菌来源的丙酮酸羧化酶的基因pyc的一个或多个质粒转入大肠杆菌宿主中进行分模块组成型过量表达。
23.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述重组大肠杆菌为bl21(tpp)，其是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，所述分模块组成型过量表达包括将含有编码大肠杆菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因ppc、天冬氨酸转氨酶的基因aspc、天冬氨酸-α-脱羧酶
的基因pand以及编码铜绿假单胞菌来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶的基因pa0132、编码大肠杆菌来源的琥珀酸半醛脱氢酶的基因ynei和编码谷氨酸棒状杆菌来源的丙酮酸羧化酶的基因pyc的各质粒转入大肠杆菌宿主中进行分模块组成型过量表达使这些蛋白单独表达的步骤。
24.在一些实施方案中，所述大肠杆菌bl21(scr)，其是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，所述分模块组成型过量表达包括将融合表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc和所述天冬氨酸转氨酶基因aspc的质粒，单独表达所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因pand和所述丙酮酸羧化酶基因pyc的质粒以及融合表达所述琥珀酸半醛脱氢酶基因ynei和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0132的质粒转入大肠杆菌宿主中进行分模块组成型过量表达的步骤。
25.在一些实施方案中，上述方法中，所述分模块组成型过量表达时使用的启动子是组成型启动子ml2719，其序列如seq id no:39所示。
26.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，大肠杆菌宿主为大肠杆菌bl21(de3)。
27.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、天冬氨酸转氨酶基因aspc和天冬氨酸-α脱羧酶基因pand来自大肠杆菌bl21(de3)。
28.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述琥珀酸半醛脱氢酶基因ynei来自大肠杆菌k12。
29.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的序列如seq id no:9所示；
30.所述天冬氨酸转氨酶基因aspc的序列如seq id no:10所示；
31.所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因pand的序列如seq id no:18所示；
32.所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶的基因pa0132的序列如seq id no:2所示；
33.所述琥珀酸半醛脱氢酶的基因ynei的序列如seq id no:1所示；和/或
34.所述丙酮酸羧化酶的基因pyc的序列如seq id no:17所示。
35.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述重组大肠杆菌为bl21(scr)；
36.所述融合表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc和所述天冬氨酸转氨酶基因aspc的质粒为pcdf-ppc-linker-aspc；
37.所述单独表达所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因pand和所述丙酮酸羧化酶基因pyc的质粒为ptrc99a-pyc-pand；和/或
38.所述融合表达所述琥珀酸半醛脱氢酶基因ynei和所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0132的质粒为prsf-ynei-linker-pa0132。
39.在一些实施方案中，上述方法中，所述pcdf-ppc-linker-aspc是将linker片段和pcdf-ppc-aspc质粒片段同源重组构建的；所述linker片段是seq id no:25所示linker基因为模板，以linker-pcdf-f(seq id no:27)、linker-pcdf-r(seq id no:28)进行pcr扩增，得到linker片段；pcdf-ppc-aspc质粒片段是以pcdf-ppc-aspc质粒为模板，用引物pcdf-linker-f(seq id no:29)、pcdf-linker-r(seq id no:30)进行pcr扩增，得到的线性化pcdf-ppc-aspc质粒片段；
40.所述prsf-ynei-linker-pa0132是将linker片段和prsf-ynei-pa0132质粒片段的同源序列发生重组的方法构建的；所述linker片段是seq id no:25所示linker基因为模
板，以linker-prsf-f(seq id no:31)、linker-prsf-r(seq id no:32)进行pcr扩增，得到linker片段；所述prsf-ynei-pa0132质粒片段是以prsf-ynei-pa0132质粒为模板，用引物prsf-linker-f(seq id no:33)、prsf-linker-r(seq id no:34)进行pcr扩增，得到线性化prsf-ynei-pa0132质粒片段；
41.所述ptrc99a-pyc-pand是将pyc、pand片段和ptrc99a质粒片段的同源序列发生重组的方法构建的。
42.在一些实施方案中，上述方法中，所述pcdf-ppc-aspc质粒是将ppc、aspc片段和pcdfduet-1质粒片段的同源序列发生重组构建的，所述ppc片段是以seq id no:9所示ppc基因为模板，用引物ppc-f(seq id no:11)和ppc-r(seq id no:12)进行pcr扩增，得到ppc片段；所述aspc片段是以seq id no:10所示aspc基因为模板，用引物aspc-f(seq id no:13)和aspc-r(seq id no:14)进行pcr扩增，得到aspc片段；所述pcdfduet-1质粒片段是以pcdfduet-1质粒为模板，用引物pcdf-f(seq id no:15)和pcdf-r(seq id no:16)进行pcr扩增，得到线性化pcdfduet-1质粒片段；
43.所述prsf-ynei-pa0132质粒是将ynei、pa0132片段和prsfduet-1质粒片段的同源序列发生重组构建的，其中所述ynei片段是以seq id no:1所示ynei基因为模板，用引物ynei-f(seq id no:3)和ynei-r(seq id no:4)进行pcr扩增，得到ynei片段；所述pa0132片段是以seq id no:2所示pa0132基因为模板，用引物pa0132-f(seq id no:5)和pa0132-r(seq id no:6)进行pcr扩增，得到pa0132片段；所述prsfduet-1质粒片段以prsfduet-1质粒为模板，用引物prsf-f(seq id no:7)和prsf-r(seq id no:8)进行pcr扩增，得到线性化prsfduet-1质粒片段；
44.所述pyc片段是以seq id no:17所示pyc基因为模板，用引物pyc-f(seq id no:19)和pyc-r(seq id no:20)进行pcr扩增，得到pyc片段；所述pand片段是以seq id no:18所示pyc基因为模板，用引物pand-f(seq id no:21)和pand-r(seq id no:22)进行pcr扩增，得到pand片段；所述ptrc99a质粒片段以ptrc99a质粒为模板，用引物ptrc99a-f(seq id no:23)和ptrc99a-r(seq id no:24)进行pcr扩增，得到线性化ptrc99a质粒片段。
45.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述重组大肠杆菌为bl21(tpp)，其是将pcdf-ppc-aspc、prsf-ynei-pa0132和ptrc99a-pyc-pand转入bl21(de3)获得。
46.bl21(scr)重组菌表达融合蛋白ppc-linker-aspc(序列如seq id no:35所示)和ynei-linker-pa0132(序列如seq id no:36所示)以及蛋白pyc(序列如seq id no:37所示)和pand(序列如seq id no:38所示)，其中seq id no:35中第1-883位氨基酸为ppc蛋白，884-903位氨基酸为连接子，第904-1299位氨基酸为aspc蛋白，seq id no:36中第1-462位氨基酸为ynei蛋白，463-482位氨基酸为连接子，第483-930位氨基酸为pa0132蛋白。相比之下bl21(tpp)重组菌分别单独表达ppc、aspc、ynei、pa0132、pyc和pand这六种蛋白。
47.本发明的第三个目的是提供一种应用所述重组大肠杆菌摇瓶发酵生产丙二酸的方法，包括将上述任一所述的重组大肠杆菌接种于含4-8g/l葡萄糖的sob培养基中，在溶解氧(do)浓度为15％-35％的环境下，30-37℃、300-800r/min发酵至少12h，例如可以为120h。
48.在一些实施方案中，上述方法中，sob培养基中，蛋白胨20g/l,酵母提取物5g/l,mgso4·
7h2o 2.47g/l,nacl 0.5g/l,kcl 0.186g/l；培养基中添加的抗生素氨苄青霉素(amp)、卡纳霉素(kan)和链霉素(str)的终浓度为1mm。
49.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，0-3h的转速为200-300r/min，3h后设置为溶氧与转速联动，以保证溶氧在25％-35％，搅拌转速范围为300-800r/min；0h-12h的发酵温度为37℃；12h-24h的发酵温度为34℃；24h-32h的发酵温度为32℃；32h至发酵结束的发酵温度为30℃；每当葡萄糖浓度降为0g/l时，补加终浓度为8g/l的葡萄糖。
50.在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述重组大肠杆菌还经过种子液培养；所述种子液培养是将所述重组大肠杆菌在lb培养基中培养，获得种子液，再接种至发酵培养基中发酵，初始od
600
为0.4-0.6。例如，种子液的制备方法可以为挑取单菌落接种于盛有25ml的lb液体培养基的150ml锥形瓶中，37℃、230rpm摇瓶过夜或培养12h，次日取1ml菌液转接于50ml lb液体培养基中，37℃、230rpm培养至od
600
达到4-6，转接于50ml sob培养基中。
51.本发明的第四个目的是提供上述任一所述的重组大肠杆菌或上述任一所述的发酵方法在制备丙二酸及其衍生产品方面的应用。
52.在一些实施方案中，上述应用中，所述衍生产品包括但不限于丙二酸二乙酯。
53.在一种实施方式中，上述应用中，所述衍生产品包括但不限于巴比妥类药物，维生素b1或维生素b6。
54.本发明的优点在于：
55.与化学法相比，大肠杆菌全生物法合成丙二酸，主要以葡萄糖为底物，大大降低了丙二酸的生产成本，并且操作更加简单、快捷；与前期已报道的生物法合成丙二酸相比，本发明中所提到的合成途径反应数更少，因此碳源的损失更少；
56.本发明过表达的六个基因中有三个均是bl21(de3)来源，酶的稳定性和活力更优；
57.成熟的发酵工艺使得利用大肠杆菌全生物法合成丙二酸成为可能，并且此方法操作简单、成本低，可用于工业化生产；
58.本技术所构建的菌株为组成型表达菌株，所用的启动子为ml2719，是诱导型t7启动子的1.4倍；发酵过程不需要iptg诱导，节约了生产成本。
附图说明
59.图1为本发明构建的丙二酸合成途径示意图。
60.图2为prsf-ynei-pa0132质粒图谱。
61.图3为pcdf-ppc-aspc质粒图谱。
62.图4为ptrc99a-pyc-pand质粒图谱。
63.图5为pcdf-ppc-linker-aspc质粒图谱。
64.图6为prsf-ynei-linker-pa0132质粒图谱。
65.图7为重组菌bl21(tpp)摇瓶发酵液相检测结果。
66.图8为重组菌bl21(scr)摇瓶发酵液相检测结果。
67.图9为梯度降温发酵策略下重组菌bl21(scr)的5l发酵罐发酵液相检测结果。
具体实施方式
68.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
69.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
70.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
71.prsfduet-1质粒为优宝生物产品，产品目录号为vt1238。
72.pcdfduet-1质粒为优宝生物产品，产品目录号为vt1239。
73.ptrc99a质粒为优宝生物产品，产品目录号为vt1294。
74.实施例1：重组质粒的构建及bl21(tpp)重组菌的获得
75.1、重组质粒prsf-ynei-pa0132的构建
76.琥珀酸半醛脱氢酶基因(ynei)(序列如seq id no:1所示)和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0132)(序列如seq id no:2所示)由苏州金唯智生物科技有限公司合成；
77.以琥珀酸半醛脱氢酶基因(ynei)为模板，用引物ynei-f(5
’‑
cacacaggaaacagaccatgaccattactccggcaactc-3’，seq id no:3)和ynei-r(5
’‑
ttctttaccagactcgagtcagatccggtctttccacac-3’，seq id no:4)进行pcr扩增，得到ynei片段；
78.以β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0132)为模板，用引物pa0132-f(5
’‑
cacacaggaaacagaccatgaatcagcccctgaatgtc-3’，seq id no:5)和pa0132-r(5
’‑
gccggatgattaattgtcaaaagctttcaggcaattccgttcagag-3’，seq id no:6)进行pcr扩增，得到pa0132片段；
79.以prsfduet-1质粒为模板，用引物prsf-f(5
’‑
ctcgagtctggtaaagaaaccgc-3’，seq id no:7)和prsf-r(5
’‑
atttcctaatgcaggagtcgcat-3’，seq id no:8)进行pcr扩增，得到线性化prsfduet-1质粒片段；
80.再用同源重组酶将ynei片段、pa0132片段和线性化prsfduet-1质粒片段同源重组得到重组质粒prsf-ynei-pa0132，将其转入e.coli jm109感受态细胞中，菌落pcr挑取阳性转化子并提质粒酶切验证，验证正确的质粒送测序，测序结果与预期序列一致，质粒图谱如图2所示。
81.2、重组质粒pcdf-ppc-aspc的构建
82.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)(序列如seq id no:9所示)和天冬氨酸转氨酶基因(aspc)(序列如seq id no:10所示)由苏州金唯智生物科技有限公司合成；
83.以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)为模板，用引物ppc-f(5
’‑
aacagaccccatgggcatgaacgaacaatattccgcatt-3’，seq id no:11)和ppc-r(5
’‑
gccggatgattaattgtcaagaattcttagccggtattacgcatacctg-3’，seq id no:12)进行pcr扩增，得到ppc片段；
84.以天冬氨酸转氨酶基因(aspc)为模板，用引物aspc-f(5
’‑
cacacaggaaacagaccatgtttgagaacattaccgccg-3’，seq id no:13)和aspc-r(5
’‑
gccgcaagcttgtcgacttacagcactgccacaatcgc-3’，seq id no:14)进行pcr扩增，得到aspc片段；
85.以pcdfduet-1质粒为模板，用引物pcdf-f(5
’‑
gtcgacaagcttgcggcc-3’，seq id no:15)和pcdf-r(5
’‑
atttcctaatgcaggagtcgcat-3’，seq id no:16)进行pcr扩增，得到线性化pcdfduet-1质粒片段；
86.再用同源重组酶将ppc片段、aspc片段和线性化pcdfduet-1质粒片段同源重组得到重组质粒pcdf-ppc-aspc，将其转入e.coli jm109感受态细胞中，菌落pcr挑取阳性转化子并提质粒酶切验证，验证正确的质粒送测序，测序结果与预期序列一致，质粒图谱如图3所示。
87.3、重组质粒ptrc99a-pyc-pand的构建
88.丙酮酸羧化酶基因(pyc)(序列如seq id no:17所示)和天冬氨酸-α脱羧酶基因(pand)(序列如seq id no:18所示)由苏州金唯智生物科技有限公司合成；
89.以丙酮酸羧化酶基因(pyc)为模板，用引物pyc-f(5
’‑
cacacaggaaacagaccgtgtcgactcacacatcttcaacg-3’，seq id no:19)和pyc-r(5
’‑
gccggatgattaattgtcaagaattccttaggaaacgacgacgatcaagtc-3’，seq id no:20)进行pcr扩增，得到pyc片段；
90.以天冬氨酸-α脱羧酶基因(pand)为模板，用引物pand-f(5
’‑
gaaacagaccctcgagcaagaggtatatattaatgttgcgtactatcc-3’，seq id no:21)和pand-r(5
’‑
gccaaaacagccaagcttctagatcgagcgactggttaaaag-3’，seq id no:22)进行pcr扩增，得到pand片段；
91.以ptrc99a质粒为模板，用引物ptrc99a-f(5
’‑
aagcttggctgttttggcg-3’，seq id no:23)和ptrc99a-r(5
’‑
cagctcatttcagaatatttgcca-3’，seq id no:24)进行pcr扩增，得到线性化ptrc99a质粒片段；
92.再用同源重组酶将pyc片段、pand片段和线性化ptrc99a质粒片段同源重组得到重组质粒ptrc99a-pyc-pand，将其转入e.coli jm109感受态细胞中，菌落pcr挑取阳性转化子并提质粒酶切验证，验证正确的质粒送测序，测序结果与预期序列一致，质粒图谱如图4所示。
93.4、将prsf-ynei-pa0132、pcdf-ppc-aspc和ptrc99a-pyc-pand质粒电转入bl21(de3)获得bl21(tpp)重组菌。
94.实施例2：重组质粒的构建及bl21(scr)重组菌的获得
95.1、linker基因(序列如seq id no:25所示)由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其编码的氨基酸序列为(ssssg)4(seq id no:26)，并按照大肠杆菌的偏好性进行了密码子优化。
96.2、重组质粒pcdf-ppc-linker-aspc的构建
97.以linker基因为模板，用引物linker-pcdf-f(5
’‑
taataccggcgaattctcttcaagctctggtagctcgtc-3’，seq id no:27)、linker-pcdf-r(5
’‑
cggcggtaatgttctcaaacattccggagctcgaactgcc-3’，seq id no:28)进行pcr扩增，得到linker片段；
98.以pcdf-ppc-aspc质粒为模板，用引物pcdf-linker-f(5
’‑
atgtttgagaacattaccgccg-3’，seq id no:29)、pcdf-linker-r(5
’‑
gaattcgccggtattacgca-3’，seq id no:30)进行pcr扩增，得到线性化pcdf-ppc-aspc质粒片段；
99.再用同源重组酶将linker片段和线性化pcdf-ppc-aspc质粒片段同源重组得到重组质粒pcdf-ppc-linker-aspc，将其转入e.coli jm109感受态细胞中，菌落pcr挑取阳性转化子并提质粒酶切验证，验证正确的质粒送测序，测序结果与预期序列一致，质粒图谱如图5所示。
100.3、重组质粒prsf-ynei-linker-pa0132的构建
101.以linker基因为模板，用引物linker-prsf-f(5
’‑
acggaattgccaagctttcttcaagctctggtagctcgtc-3’，seq id no:31)、linker-prsf-r(5
’‑
ccggagtaatggtcattccggagctcgaactgcc-3’，seq id no:32)进行pcr扩增，得到linker片段；
102.以prsf-ynei-pa0132质粒为模板，用引物prsf-linker-f(5
’‑
atgaccattactccggcaactc-3’，seq id no:33)、prsf-linker-r(5
’‑
aagcttggcaattccgttca-3’，seq id no:34)进行pcr扩增，得到线性化prsf-ynei-pa0132质粒片段；
103.再用同源重组酶将linker片段和线性化prsf-ynei-pa0132质粒片段同源重组得到重组质粒prsf-ynei-linker-pa0132，将其转入e.coli jm109感受态细胞中，菌落pcr挑取阳性转化子并提质粒酶切验证，验证正确的质粒送测序，测序结果与预期序列一致，质粒图谱如图6所示。
104.4、将pcdf-ppc-linker-aspc、prsf-ynei-linker-pa0132和ptrc99a-pyc-pand质粒电转入bl21(de3)获得bl21(scr)重组菌。
105.bl21(scr)重组菌表达融合蛋白ppc-linker-aspc(序列如seq id no:35所示)和ynei-linker-pa0132(序列如seq id no:36所示)以及蛋白pyc(序列如seq id no:37所示)和pand(序列如seq id no:38所示)，其中seq id no:35中第1-883位氨基酸为ppc蛋白，884-903位氨基酸为连接子，第904-1299位氨基酸为aspc蛋白，seq id no:36中第1-462位氨基酸为ynei蛋白，463-482位氨基酸为连接子，第483-930位氨基酸为pa0132蛋白。相比之下，实施例1制备的bl21(tpp)重组菌分别表达ppc、aspc、ynei、pa0132、pyc和pand这六种蛋白。
106.启动各蛋白表达的是组成型启动子ml2719，其序列如seq id no:39所示。
107.实施例3：重组大肠杆菌的摇瓶发酵
108.1、种子液制备：将lb固体平板活化得到的重组菌株bl21(tpp)和bl21(scr)分别接种于25ml的液体lb培养基中，37℃、230r/min培养12h后接种二级种子液。取1ml接种于25ml的液体lb培养基中，37℃、230r/min培养12h。
109.2、发酵：2％的接种量接种于装液量为50ml/250ml的sob培养基中，37℃、230r/min恒温培养。sob培养基：蛋白胨20g/l,酵母提取物5g/l,mgso4·
7h2o 2.47g/l,nacl 0.5g/l,kcl 0.186g/l，培养基中添加终浓度均为1mm的抗生素氨苄青霉素(amp)、卡纳霉素(kan)和链霉素(str)。
110.结果分析：发酵过程中每12h取一次样，每次取1ml，13000r/min离心10min，取上清液通过0.22μl的滤膜，用于hplc检测(高效液相色谱法，美国bio-rad伯乐aminex hpx-87h有机酸柱，检测参数如下：采用5mm h2so4作为流动相，0.6ml/min流速进样，柱温30℃，进样量20μl，示差检测器温度30℃。
111.重组菌bl21(tpp)丙二酸积累量的液相检测结果如图7所示，该菌在48h积累了0.61g/l的丙二酸；重组菌bl21(scr)丙二酸积累量的液相检测结果如图8所示，该菌在48h积累了0.83g/l的丙二酸，比未融合菌株bl21(tpp)提高了36％，该结果说明对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和天冬氨酸转氨酶进行融合表达，并对琥珀酸半醛脱氢酶和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶进行融合表达能够减少中间代谢物的损失，因而促进丙二酸的合成。
112.实施例4：重组大肠杆菌bl21(scr)的5l发酵罐发酵
113.1、种子液制备：将lb固体平板活化得到的重组菌株bl21(scr)接种于25ml的液体lb培养基中，37℃、230r/min培养12h后接种二级种子液。取1ml分别接种于六瓶50ml的液体lb培养基中，37℃、230r/min培养12h，od
600
达到4.42。
114.2、发酵条件：按体积计，接种量10％(初始od
600
为0.46)，初始葡萄糖浓度4g/l，0-3h的转速为300r/min，3h后设置为溶氧与转速联动，以保证溶氧在25％左右，搅拌转速范围
为300-800r/min。0h-12h的发酵温度为37℃；12h-24h的发酵温度为34℃；24h-32h的发酵温度为32℃；32h至发酵结束的发酵温度为30℃。每当葡萄糖浓度降为0g/l时，补加终浓度为8g/l的葡萄糖并取样。
115.发酵培养基为sob培养基：蛋白胨20g/l,酵母提取物5g/l,mgso4·
7h2o 2.47g/l,nacl 0.5g/l,kcl 0.186g/l，培养基中添加终浓度均为1mm的抗生素氨苄青霉素(amp)、卡纳霉素(kan)和链霉素(str)。
116.结果分析：方法与实施例3中相同，发酵结果如图9所示。结果表明，重组菌bl21(scr)在54h积累了5.61g/l的丙二酸。
117.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
118.seq id no:1：
[0119][0120][0121]
seq id no:2：
[0122][0123][0124]
seq id no:9：
[0125]
[0126][0127]
seq id no:10：
[0128][0129][0130]
seq id no:17：
[0131]
[0132][0133]
seq id no:18：
[0134][0135]
seq id no:25
[0136]
tcttcaagctc tggtagctcg tcgtctgggt cttcaagttc cggcagttcg agctccgga
[0137]
seq id no:35
[0138]
mneqysalrsnvsmlgkvlgetikdalgehilervetirklskssragndanrqellttlqnlsndellpvarafsqflnlantaeqyhsispkgeaasnpeviartlrklknqpelsedtikkaveslslelvltahpteitrrtlihkmvevnaclkqldnkdiadyehnqlmrrlrqliaqswhtdeirklrpspvdeakwgfavvenslwqgvpnylrelneqleenlgyklpvefvpvrftswmggdrdgnpnvtaditrhvlllsrwkatdlflkdiqvlvselsmveatpellalvgeegaaepyrylmknlrsrlmatqawlearlkgeelpkpeglltqneelweplyacyqslqacgmgiiangdlldtlrrvkcfgvplvridirqestrhtealgeltrylgigdyeswseadkqaflirelnskrpllprnwqpsaetrev
ldtcqviaeapqgsiaayvismaktpsdvlavhlllkeagigfampvaplfetlddlnnandvmtqllnidwyrgliqgkqmvmigysdsakdagvmaaswaqyqaqdaliktcekagieltlfhgrggsigrggapahaallsqppgslkgglrvteqgemirfkyglpeitvsslslytgaileanllpppepkeswrrimdelsviscdlyrgyvrenkdfvpyfrsatpeqelgklplgsrpakrrptggveslraipwifawtqnrlmlpawlgagtalqkvvedgkqseleamcrdwpffstrlgmlemvfakadlwlaeyydqrlvdkalwplgkelrnlqeedikvvlaiandshlmadlpwiaesiqlrniytdplnvlqaellhrsrqaekegqepdprveqalmvtiagiaagmrntgssssgssssgssssgssssgmfenitaapadpilgladlfraderpgkinlgigvykdetgktpvltsvkkaeqyllenettknylgidgipefgrctqellfgkgsalindkrartaqtpggtgalrvaadflakntsvkrvwvsnpswpnhksvfnsaglevreyayydaenhtldfdalinslneaqagdvvlfhgcchnptgidptleqwqtlaqlsvekgwlplfdfayqgfargleedaeglrafaamhkelivassysknfglynervgactlvaadsetvdrafsqmkaairanysnppahgasvvatilsndalraiweqeltdmrqriqrmrqlfvntlqekganrdfsfiikqngmfsfsgltkeqvlrlreefgvyavasgrvnvagmtpdnmaplceaivavl
[0139]
seq id no:36
[0140]
mtitpathaisinpatgeqlsvlpwagaddienalqlaaagfrdwretnidyraeklrdigkalrarseemaqmitremgkpinqaraevaksanlcdwyaehgpamlkaeptlvenqqavieyrplgtilaimpwnfplwqvmrgavpiilagngyllkhapnvmgcaqliaqvfkdagipqgvygwlnadndgvsqmikdsriaavtvtgsvragaaigaqagaalkkcvlelggsdpfivlndadlelavkaavagryqntgqvcaaakrfiieegiasafterfvaaaaalkmgdprdeenalgpmarfdlrdelhhqvektlaqgarlllggekmagagnyypptvlanvtpemtafreemfgpvaaitiakdaehalelandsefglsatifttdetqarqmaarlecggvfingycasdarvafggvkksgfgrelshfglhefcniqtvwkdrissssgssssgssssgssssgmnqplnvappvsselnlrahwmpfsanrnfqkdpriivaaegswltddkgrkvydslsglwtcgaghsrkeiqeavarqlgtldyspgfqyghplsfqlaekiagllpgelnhvfftgsgsecadtsikmaraywrlkgqpqktkligrargyhgvnvagtslggiggnrkmfgqlmdvdhlphtlqpgmaftrgmaqtggvelanellklielhdasniaavivepmsgsagvlvppvgylqrlreicdqhnillifdevitafgrlgtysgaeyfgvtpdlmnvakqvtngavpmgaviasseiydtfmnqalpehavefshgytysahpvacaaglaaldilardnlvqqsaelaphfekglhglqgaknvidirncglagaiqiaprdgdptvrpfeagmklwqqgfyvrfggdtlqfgptfnarpeeldrlfdavgealngia
[0141]
seq id no:37
[0142]
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[0143]
seq id no:38
[0144]
mlrtilgskihratvtqadldyvgsvtidadlvhaagliegekvaivditngarletyvivgdagtgnicingaaahlinpgdlviimsylqatdaeakayepkivhvdadnrivalgndlaealpgsglltsrsi
[0145]
seq id no:39
[0146]