L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用

l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用。


背景技术：

2.β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，在制药工业中是一种重要的前体，例如用于骨质疏松症抑制剂帕米膦酸钠和消炎药巴沙拉嗪；也是运动员改善身体机能的重要营养补充。β-丙氨酸还是生产聚β-丙氨酸（尼龙-3）的基本单位，可用于化妆品生产、水净化和建筑材料。
3.l-天冬氨酸-α-脱羧酶(l-aspartate-α-decarboxylase，ec4.1.1.11，adc)能够催化l-天冬氨酸cα位的羧基进行脱羧生成β-丙氨酸和co2，是一种非常有竞争力的β-丙氨酸生产方法。
4.l-天冬氨酸-α-脱羧酶根据其来源主要分为两类：一类来源于原核生物，另一类来源于真核生物。原核生物来源的adc需要进行自剪切修饰，才能获得催化功能，存在基于机理的不可逆失活，且催化活性较真核生物来源adc的弱，真核生物来源的adc不存在机理失活，工业应用潜力大。目前已报道的真核生物来源的adc有来源于昆虫赤拟谷盗、埃及伊蚊和桃蚜（专利申请号cn201911088195.9），其中桃蚜来源的adc（mpadc）表现出较强的底物亲和性及酶活性，具有较大的工业化应用潜力，但其在异源表达过程中不易正确折叠而形成包涵体，放大发酵培养时，存在培养条件苛刻，可溶表达少等困难，限制了mpadc的应用。进一步提高mpadc的催化活性及增加可溶性表达，对扩大其应用价值具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了改良mpadc的性能，提高其工业应用潜力，本发明的目的在于提供l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用，通过对桃蚜来源的l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因进行突变，去除蛋白n末端部分无规卷曲肽段，得到了两种催化活性和可溶表达均显著提高的突变体。
6.本发明通过以下技术方案实现上述目的：将野生型l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因（seq id no.1，来源于申请号为cn201911088195.9的专利）采用常规方式克隆到表达载体pet28a上，获得能够表达野生型mpadc（氨基酸序列为seq id no.2）的表达载体；通过基因工程技术分别去掉野生型mpadc氨基端前4位或前39位氨基酸残基，得到两种截短的mpadc突变体，分别命名为mpadc
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4（氨基酸序列为seq id no.4）和mpadc
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39（氨基酸序列为seq id no.6）。
7.编码上述两种l-天冬氨酸-α-脱羧酶及突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示。
8.本发明提供了含上述基因的载体。
9.本发明还提供了含上述基因或上述载体的宿主细胞。
10.将上述含野生型和两种截断型突变体基因的表达载体转入大肠杆菌bl21（de3）中，得到三株基因工程菌。
11.将三株基因工程菌分别进行发酵培养，于发酵罐37℃培养至od
600
为15，并用iptg于20℃诱导20-22h，诱导蛋白表达，sds-page检测蛋白的表达情况，用image-j软件评估三种蛋白可溶性表达量，表明mpadc
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4和mpadc
‑△
39两种突变体的蛋白可溶性表达分别是野生型蛋白表达的162%和156%。
12.纯化蛋白，得纯的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，活性检测表明，mpadc
‑△
4和mpadc
‑△
39两种突变体的催化活性分别是野生型活性的164%和262%。
13.本发明还提供了所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及所述基因工程菌在制备含有β-丙氨酸的产品中的应用，所述方法以上述工程菌株进行全细胞催化，反应体系包含湿菌体50g/l，0.5 mm磷酸吡哆醛（plp），通过补加底物l-天冬氨酸的方式控制反应ph在6.0-6.5范围内，反应温度37 ℃，以l-天冬氨酸为底物催化产生β-丙氨酸。
14.本发明的有益效果在于：1）相比野生型的l-天冬氨酸-α-脱羧酶，突变体的可溶性蛋白表达分别增加了62%和56%，催化活性分别提高了64%和162%。
15.2）构建表达l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因工程菌，用于制备β-丙氨酸，反应13.5小时后，β-丙氨酸的产物浓度为 232.36g/l，底物残余浓度为 23.83g/l，底物转化率 94.68%，时空产率为 17.21 g
·
l ‑1·hꢀ‑1。
附图说明
16.图1：mpadc、mpadc
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4和mpadc
‑△
39三种工程菌表达的蛋白质sds-page图。
17.图2：用image-j评估mpadc、mpadc
‑△
4和mpadc
‑△
39可溶性表达量结果。
18.图3：mpadc、mpadc
‑△
4和mpadc
‑△
39三种酶的纯化结果。
19.图4：mpadc全细胞催化反应液的hplc出峰图谱。
20.图5：mpadc、mpadc
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4和mpadc
‑△
39的三种酶的相对酶活。
21.图6：mpadc
‑△
39工程菌全细胞催化合成β-丙氨酸的结果。
具体实施方式
22.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明所用试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
23.材料和方法实施例中所用lb 液体培养基、tb液体培养基（g/l）皆为常规方法配制。
24.实施例中引物合成及测序皆委托杭州擎科生物技术有限公司完成。
25.实施例中的分子生物学实验包括质粒构建，感受态细胞制备、转化等，主要参照《基因工程原理》（第二版）吴乃虎编著、《分子克隆实验指南》（第三版）j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著进行。质粒提取、pcr扩增实验、胶回收及重组实验根据所用试剂盒供应商提供的说明书进行。
26.实施例1：mpadc、mpadc
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4和mpadc
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39表达载体的构建将野生型l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因（seq id no.1，来源于申请号为cn201911088195.9的专利）采用常规方式克隆到载体质粒pet28a上，获得能够表达野生型
mpadc（氨基酸序列为seq id no.2）的重组基因载体，命名为pet-28a-mpadc。
27.以pet-28a-mpadc序列为模板，通过snapgene4.3.6 设计引物，扩增引物如表1。以f-cut4和r-cut引物对扩增pet-28a-mpadc
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4重组质粒，以f-cut39和r-cut引物对扩增获得pet-28a-mpadc
‑△‑
39重组质粒。
28.表1构建突变体所用引物pcr产物用琼脂糖凝胶核酸电泳鉴定，随后用dpni消化模板，根据纯化试剂盒说明书纯化后，两种pcr纯化产物使用擎科公司的trelief
™ꢀ
sosoo cloning kit ver.1试剂盒进行重组反应，再将重组反应产物全部化转到e. coli dh5α感受态细胞内，挑取单菌落测序验证，最终获得引入含有pet-28a-mpadc
‑△
4和pet-28a-mpadc
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39重组质粒的克隆菌株。
29.实施例2：mpadc、mpadc
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4和mpadc
‑△
39表达菌株的构建。
30.提取实施例1中获得的克隆菌株中的三种质粒，转化至含有pgro7(分子伴侣质粒)的e. coli bl21（de3）表达载体中，挑取单菌落接种于含有卡那霉素50 μg/ml、氯霉素25 μg/ml的5ml lb培养基试管中，37℃、220rpm震荡培养10 h，获得表达基因工程菌。
31.实施例3：mpadc、mpadc
‑△
4和mpadc
‑△
39的外源诱导表达。
32.取500μl实施例2所述三个菌株，转接至含有卡那霉素50 μg/ml、氯霉素25μg/ml的50ml tb 摇瓶中，培养约2 h（od
600
为2.5左右），加入终浓度为 0.2 mmol/liptg，20℃、180rpm诱导培养20 h 左右，6000 rpm，5min，离心收集菌体，超声破碎，sds-page检测蛋白表达，结果如图1所示，图中1：mpadc上清；2：mpadc沉淀；3：mpadc
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4上清；4：mpadc
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4沉淀；5：mpadc
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39上清；6：mpadc
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39沉淀；m：蛋白marker ，可见相比野生型的mpadc，两种突变体在上清中的可溶表达都得到了增加。
33.进一步用image-j软件评估原始菌株和突变菌株的蛋白可溶性表达量，如说明书附图2所示，突变菌株mpadc
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4、mpadc
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39的目的蛋白可溶性表达量分别是原始菌株表达量的162%和156%。
34.实施例4：mpadc、mpadc
‑△
4和mpadc
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39的纯化（1）破碎细胞：将收集的三种菌体，先用破胞液重悬清洗一次，再按照1 g菌体加5 ml破胞液的比例重悬，在涡旋仪上混悬至无块状后，调节超高压低温细胞破碎仪压力为1500 mpa，破碎6-8次至菌体完全破碎、液体呈半透明状，4 ℃、10000 rpm离心20 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，置于冰上备用。
35.（2）上样及洗脱：利用蠕动泵将样品泵入预先用破胞液平衡好的镍柱上（histrap
tm
ff 1 ml），缓慢上样5倍柱体积，然后先用5倍柱体积的破胞液洗脱除去没有和镍柱结合的蛋白，随后依次用25mm的咪唑缓冲液除杂蛋白，200 mm的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，将含有目的蛋白的洗脱收集液用10 kda孔径的超滤离心管浓缩目的蛋白（4000g、4 ℃），直至洗脱液体积浓缩至2.5 ml为止。
36.（3）浓缩液的脱盐：用脱盐凝胶柱除去蛋白浓缩液中含有的咪唑等盐离子，将得到的脱盐蛋白，每100 μl分装成一管，置于-80 ℃保存备用。
37.（4）sds-page检测目的蛋白的纯度，结果如图3所示，图中m：蛋白marker ； 1：mpadc纯酶；2：mpadc
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4纯酶；3：mpadc
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39纯酶。结果表明，三种蛋白都达到了较高的纯度。
38.实施例5：mpadc、mpadc
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4和mpadc
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39三种酶的催化活性测定本发明通过测试单位时间内、等量酶产生的β-丙氨酸量来评估l-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性，定义野生型酶的活性为100%。反应体系1ml：底物2mm，plp 0.5mm，酶10.7μg/ml， pbs维持反应体系 ph6.5，在37℃的条件下，反应5 min，100℃灭活。12000g离心2min，取上清。
39.用hplc法测l-天冬氨酸和β-丙氨酸浓度，具体检测方法为opa柱前衍生反向hplc测氨基酸的方法：（1）样品预处理：反应液100 ℃灭活5min，12000 rpm离心2 min，取上清检测。
40.（2）衍生操作：吸取0.1 m ph=9.5硼酸溶液300 μl，加入200 μl样品和200 μl衍生剂震荡混合，避光衍生2 min，经0.45 μm的滤膜过滤，进样10 μl。
41.（3）色谱方法：采用色谱柱为月旭lp-c18(250 mm
×
4.6 mm, 5 μm)，柱温35 ℃，流动相为甲醇：50 mm醋酸钠 (ph 3.5)=55:45洗脱，检测波长为334 nm，流速为0.8 ml/min，进样 10 μl，保留时间约为8 min，柱压约13 mpa，l-天冬氨酸和β-丙氨酸的保留时间如附图4所示。
42.纯酶的相对活性测试结果如附图5所示：定义野生型mpadc的相对活性为100%，则mpadc
‑△
4的相对活性约164%，mpadc
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39的相对活性约262%，均得到了大幅提升。
43.实施例6：mpadc
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39工程菌全细胞催化产生β-丙氨酸为了评估最优选突变体mpadc
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39在β-丙氨酸生产中的应用潜力，本发明做1l体系的催化反应，体系中初始底物l-天冬氨酸为55 g/l，重组大肠杆菌湿菌体50g/l（od约30），plp 0.5 mm，用氢氧化钠调ph至6.5，反应过程中ph上升，可通过补加底物l-天冬氨酸的方式控制反应ph在6.0-6.5之间；在磁力搅拌器（ika
®
c-mag hs 7）控制温度37 ℃、转速800 rpm，反应ph上升速度变慢后加20% h2so4控制ph至不再上升，停止反应。
44.反应过程中，每间隔1 h取样用hplc测β-丙氨酸的产量。结果如图6所示：经13.5小时反应后，ph基本不再变化，意味着反应终止，此时最终产物β-丙氨酸浓度为 232.36g/l，底物残余浓度为 23.83g/l，底物转化率 94.68%，时空产率为 17.21 g
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45.本发明的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，蛋白可溶性表达提高，催化活性增加，工业应用潜力大。
46.以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。