用于中药材雀脑成分快速检测的引物、试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及用于中药材雀脑成分快速检测的引物、试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.雀脑为文鸟科动物麻雀(passer montanus saturatus stejneger)的新鲜脑组织经加工炮制而成，始载于《名医别录》，并且《本草纲目》、《食疗本草》、《动物本草》、《滇南本草》、《现代养生保健中药辞典》、《中国动物志》、《中国动物药志》、《中药大辞典》、《肉禽蛋奶养生》、《中华本草》等均有记载。雀脑味甘，性平，归肾经，具有补肾兴阳，润肤生肌的作用，主治肾虚阳痿，耳聋，聤耳，冻疮等，对手足皲裂、冻疮等症可外涂患处；肾虚则应内服之。应用制剂为龟龄集胶囊和右归丸。
3.雀脑为冷备药材，其检测方法少有研究，《山西省中药材标准》规定雀脑含量测定为总氮，因雀脑富含蛋白质、氨基酸。目前文献报道雀脑质量控制包括整体质量控制和有效成分质量控制，整体质量控制包括性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、水分和灰分的检查、总氮、氨基酸等项目。雀脑的性状鉴别特征是颜色、气味基本与肉粉相同；显微鉴别特征为树突碎片与神经纤维，只是任何非低等生物脑组织的一般特征；含量测定及薄层检测氨基酸类和鉴别丙氨酸成分，也不具有专属性，氨基酸是生物体的最基本成分，丙氨酸是一种普遍存在的氨基酸，生物组织包括发酵液和毛发水解物都有氨基酸和丙氨酸；水分和灰分是药材的一般检查项目；总氮在自然界广泛存在，尤其在有机体中都有，甚至空气中也有氮存在。有效成分质量控制采用柱前衍生化hplc法测定丙氨酸，如前所述，丙氨酸是一种生物体中普遍存在的氨基酸。所以无论是整体质量控制指标还是目前的单一有效成分控制指标都不能够真正鉴别或控制雀脑的质量，添加部分生物体与其它非低等生物体的脑组织都符合以上标准，所以目前雀脑的鉴别检测方法专属性不强。依据文献计算，氨基酸分析法最低能检出2.0μg样品，hplc衍生化法检测丙氨酸最低能检出0.5μg样品，薄层色谱法最低能检出80μg样品。
4.近年来随着分子生物学的深入研究与快速发展，实际检验中药材真伪鉴定方法已经由传统的单一理化实验水平转移到分子生物学的方法如普通pcr技术、实时荧光pcr技术、pcr-rflp等技术。聚合酶链式反应通过特定引物有选择性的进行体外模拟细胞内部扩增dna或rna片段的方法，该dna复制方法可以实现将极少量基因组中的特定基因片段在短几小时内呈现指数扩增，显著提高检测的灵敏度已成为目前研究水平上最灵敏的检测技术，具有精确度高和特异性强的优势，在中药材真伪检测及基因突变的检测等诸多领域发挥重要作用。然而，目前还没有发现适用于中药材雀脑成分的pcr检测的引物，且普通pcr检测技术存在局限性，需要电泳检测才能观察检测结果，而实时荧光pcr检测设备价格是普通pcr检测设备的5至10倍，这些因素限制了其在设施缺乏的现场检测和基层地区应用。
5.因此，建立快速、敏感、特异的检测方法对于保障人民群众用药安全是必不可少的。亟需建立一种快速、有效、专属的雀脑成分检测方法，对于规范该药材的采收加工、市场
premix 25μl、浓度10μmol/l的上、下游引物各0.25μl、模板1μl、补水至50μl；
24.所述pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；63℃退火30s，30个循环，72℃延伸5min。
25.如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，pcr扩增产物也可采用电泳方法条进行结果判定时，将扩增产物进行电泳成像，如有336bp大小的条带时，说明样品中含有雀脑成分；如果无扩增条带，说明样品中不含有雀脑成分。
26.如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，核酸检测试纸条为检测线包被有山羊抗fitc的抗体/山羊抗生物素的抗体，质控线包被有羊抗鼠抗体，胶体金标记有小鼠抗地高辛抗体的胶体金试纸条，将扩增产物用检测稀释液稀释后，滴入核酸检测试纸条的加样处进行检测，其中，所述检测稀释液的配方为含有0.3mol/l nacl和30mmol/l的柠檬酸缓冲液，ph 7.0。
27.如上所述的快速检测方法，优选地，加样后5-8分钟判读，得到相应的检测结果，其他时间判读无效；读取结果时，
28.当检测线t线和质控线c线均显色时，说明样品中含有雀脑成分；
29.当检测线t线不显色、质控线c线显色时，说明样品中不含有雀脑成分；当质控线c线不显色时，说明操作不或试纸已经失效，当应重新检测。
30.(三)有益效果
31.本发明的有益效果是：
32.本发明的方法以雀脑的特异性引物加标记物后，对雀脑样品的dna进行扩增，扩增产物与检测试纸条能够特异性结合，经实验验证，与常见的16种动物脑无非特异性结合，专属性很强，最低能检出0.008μg样品，实际灵敏度高于现有其它检测技术，所用的检测时间只需要65-70分钟就可以全部完成试验，获得结果，效率大大高于现有技术的整体质量控制方法至少需要3天时间，液相方法需要5小时的时效。
33.本发明提供的pcr扩增技术并联合核酸检测试纸条检测雀脑成分的一种更为高效的分子检测方法，引物的设计选择最适扩增片段位置及长度能够有效避免非特异性扩增的形成，并优化得到最佳展开缓冲液使核酸试纸条达到最理想的显色效果。该检测方法不会污染实验室和周围环境，且不需要昂贵的仪器设备或专业操作技能，从而可以在实验条件不完善的情况下应对大规模样品的检测，具体优点体现在以下几个方面：
34.1、本发明提供的检测雀脑成分扩增产物的核酸检测试纸条，特异性强，灵敏度高，操作简便，稳定性强；
35.2、扩增过程在封闭的反应体系中进行有效的避免扩增产物的污染；
36.3、反应速度快，完成样品的全部检测步骤只需1小时左右；
37.4、检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及专业技术人员操作；
38.5、适应于中药材雀脑成分的现场快速检测的初步判断。
39.本发明的核酸检测试纸条的建立，能够实现核酸检测结果的可视化观察。本发明通过核酸检测试纸检测中药材雀脑成分，且单一样品从前处理到完成检测，仅需1小时即可得出检验结果，并且与其他常见动物源性成分无非特异性反应，本发明的检测试纸条操作简便、特异性强、灵敏度高、所需设备成本低、效率高，尤其适用于现场检测以及基层监管单位的市场快速检测。
taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3'，(由上海生工生物有限公司合成)，扩增的条件为94℃变性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，反应40个循环；72℃延伸10min。对样品(实施例5中记载的采集的7个批次的样品)获得的扩增产物的测序结果和检索ncbi的数据库后获得麻雀、鹌鹑、鸡、鹧鸪、鸽、鹅、鸭、鹦鹉、火鸡等其他常见近源物种细胞色素氧化酶1基因的序列(co1序列)，将这7份测序样品及ncbi检索到的序列进行同源性比较确保序列在引物处没有变异位点，获得的靶基因序列如seq id no.5所示，
57.对该靶基因序列首先用oligov7.0.1和ncbi的primer-blast设计引物，得出的引物序列经snapgene软件比对，物种间出差异最大的引物序列设计出能够用于雀脑真伪鉴别的pcr检测引物包括有普通pcr检测和实时荧光pcr检测的引物如下。
58.seq id no.5：
59.taaacttcagggtgaccaaaaaatcaaccctgtacctaatcttcggcgcatgagccgggatagtaggtaccgctctaagcctacttatccgagcagaacttggacaaccaggggctctcctaggagatgaccaagtttacaacgtagtagttacagctcacgctttcgtgataatcttcttcatagttatgccaattatgatcggaggattcggaaactgactagtccccctaataattggagcaccagatatagcattcccacgaataaacaacataagcttctgactactgcctccatccttcctcctgctactagcatcctccaccgtagaagcaggagcaggcacaggatgaacagtataccccccactggccggcaacctagcccacgccggagcctcagtagatctagcaatcttctccctacacttagcaggtatctcatcaatcttaggggcaatcaactttattacaacagcaatcaacataaaaccccccgccctatcacaatatcaaacacccctatttgtctgatccgtactaatcaccgcagtactactgctcctgtcgctacccgtcctcgctgcaggaatcacaatgctactcaccgaccgcaacctcaacaccacattctttgaccccgcaggcggaggagatccagtcctataccaacatctcttcccaatatctttatgatttgttgacc。
60.普通pcr检测：
61.第1组引物的序列
62.正向引物(seq id no.6)：5
’‑
acagctcacgctttcgtgata-3’63.反向引物(seq id no.7)：5
’‑
gggtagcgacaggagcagta-3’64.第2组引物的序列
65.正向引物(seq id no.1)：5
’‑
gcttctgactactgcctccatc-3’66.反向引物(seq id no.2)：5
’‑
ggtcggtgagtagcattgtg-3’67.实时荧光pcr检测
68.第3组引物的序列
69.正向引物(seq id no.8)：5
’‑
caccagatatagcattcccacgaa-3’70.反向引物(seq id no.9)：5
’‑
atactgttcatcctgtgcctgc-3’71.第4组引物的序列
72.正向引物(seq id no.10)：5-agcaccagatatagcattcccac-3’73.反向引物(seq id no.11)：5
’‑
ctgctcctgcttctacggtg-3’74.实时荧光pcr探针(seq id no.12)：fam5
’‑
tctgactactgcctccatccttcc-3’tamra
75.(2)进行pcr反应检测步骤：雀脑的pcr扩增反应体系：pcr prime star hs premix(购自宝生物工程(大连)有限公司)25μl、浓度10μmol/l的上、下游引物各0.25μl、模板1μl、补水至50μl。
76.实时荧光pcr扩增体系：abi taqman fast universal pcr master mix(2x)12.5μ
l、浓度10μmol/l的上、下游引物、探针各0.25μl、模板1μl、补水至25μl。
77.其中，pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；63℃退火30s，30个循环，72℃延伸5min。
78.实时荧光扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火30，40个循环。
79.用1
×
tae溶液制备1.5％的琼脂糖凝胶并加入gel red至终浓度为0.5μg/ml。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。每孔加入3μlpcr扩增产物，在第一个点样孔内加入1.5μldna marker。5v/cm恒压，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶2/3以后，凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。
80.普通pcr电泳结果如图1所示，图中1位第一组引物扩增的结果，2为第二组扩增的结果，k为空白对照，m为dnamark。在凝胶电泳图谱中，第1组引物的扩增产物在400-500bp之间有明显的扩增产物条带，实际参考片段长度为426bp，实验结果与实际参考片段一致，但有微弱的非特异性扩增条带；第2组引物扩增产物在300-400bp之间有明显的扩增产物条带，实际参考片段长度为336bp，实验结果与实际参考片段长度一致，而引物2无非特异性扩增条带，因此选择第2组引物为pcr扩增的最适引物。
81.实时荧光pcr结果如图2所示，蓝色扩增曲线为第4组引物序列，红色扩增曲线为第3组引物序列，两引物序列扩增均采用同一taqman探针，两组引物均有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，ct值均＜35，第4组的引物序列扩增效率高于第3组的引物序列，因此选择第4引物序列为实时荧光pcr法最适引物。
82.其中，将第2组引物的扩增产物纯化后进行测序，测序结果如扩增的序列如seq id no.13所示：gcttctgactactgcctccatccttcctcctgctactagcatcctccaccgtagaagcaggagcaggcacaggatgaacagtataccccccactggccggcaacctagcccacgccggagcctcagtagatctagcaatcttctccctacacttagcaggtatctcatcaatcttaggggcaatcaactttattacaacagcaatcaacataaaaccccccgccctatcacaatatcaaacacccctatttgtctgatccgtactaatcaccgcagtactactgctcctgtcgctacccgtcctcgctgcaggaatcacaatgctactcaccgacc，结果准确。
83.将第4组引物的扩增产物纯化后进行克隆测序，测序结果如扩增的序列如seq id no.14所示：agcaccagatatagcattcccacgaataaacaacataagcttctgactactgcctccatccttcctcctgctactagcatcctccaccgtagaagcaggagcag。
84.(3)普通pcr引物退火温度选择
85.用第2组引物进行pcr扩增验证最佳退火温度，分别选用退火温度68℃、67.1℃、65.5℃、63.1℃、60.1℃、58℃、56.2℃、55℃进行pcr扩增雀脑成分pcr扩增反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s；55-68℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。
86.不同退火温度下扩增产物电泳后扩增条带的结果如图3所示，其中m：dna分子量标记dl1000：相应的退火温度1：68℃2：67.1℃3：65.5℃4：63.1℃5：60.1℃6：58℃7：56.2℃8：55℃。根据扩增条带质量，最终选择63℃为退火温度。
87.实施例2扩增产物对不同动物脑组织的特异性验证
88.(1)样品前处理取
89.取16种动物脑样品(相应16种动物脑部组织1：麻雀2：鸽3：鹅4、猪5：驴6：狐狸7：三文鱼8：乌梢蛇9：鹌鹑10：鸡11：兔12：羊13：鸭14：牛15：马16：貂k)20mg，分别研成粉状或糊状，用于提取dna。可用dna提取试剂盒进行提取，也可采用如下方法：(2)普通pcr扩增反应
体系采用：pcr prime star hs premix(购自宝生物工程(大连)有限公司)25μl，实施例1中第2组序列上、下游引物序列如seq id no.1和2(浓度10μmol/l)各0.25μl、模板1μl、补水至50μl。pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；63℃退火30s，30个循环，72℃延伸5min。
90.实时荧光扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火30，40个循环。
91.(3)将上述pcr扩增产物用普通pcr电泳法验证扩增产物特异性，结果如4所示，图中m：dna分子量标记dl1000；相应16种动物脑部组织1：麻雀2：鸽3：鹅4、猪5：驴6：狐狸7：三文鱼8：乌梢蛇9：鹌鹑10：鸡11：兔12：羊13：鸭14：牛15：马16：貂k：、空白对照(ddh2o)。结果显示：引物只对雀脑成分有特异性结合，雀脑成分的结果呈阳性，其他脑组织的dna成分结果均呈阴性。表明扩增所用的引物具有高度的特异性。
92.将上述样品进行实时荧光pcr扩增，结果如5所示，相应16种动物脑部组织1、麻雀(sparrow)，2、鸽(pigeon)，3、鹅(goose)，4、猪(porcine)，5、驴(donkey)，6、狐狸(fox)，7、三文鱼(salmon)，8、乌梢蛇(zaocys dhumnades)，9、鹌鹑(corurnix)，10、鸡(chicken)，11、兔(rabbit)，12、羊(ovine)，13、鸭(duck)，14、牛(bovine)，15、马(horse)，16、貂(marten)k：、空白对照(ddh2o)。结果显示：引物在35个循环内未产生非特异性扩增，实时荧光pcr在35个循环后易产生交叉反应，当ct＞35时会产生非特异性扩增影响结果判定，因此普通pcr检测结果更准确，从试剂成本、还是仪器设备成本远低于实时荧光pcr，检测技术更便于推广。
93.实施例3
94.为了能快速提取样品中的dna，用研发出快速提取dna的试剂，快速提取dna的试剂包括裂解液和清洗液，其中，裂解液的配方为含有1.0mol/l盐酸胍、1％triton x-100，1.5％pvp，150mmol/l nacl、0.5％的聚山梨酯-20、5mmol/l edta，1.5％的聚乙二醇，溶剂为pbs溶液(ph7.4)。清洗液配方为含有0.15％聚山梨酯-20的pbs(ph为7.4)。
95.采用滤纸条来吸附dna，滤纸条可用44mm
×
2mm的长方形滤纸条，也可采用一端浸有石蜡的滤纸条，其具体如下：用剪刀将滤纸裁剪成44mm
×
2mm的长方形滤纸条，将其一端浸入加热融化的石蜡中，待晾干后便形成了40mm
×
2mm的疏水手柄区域，以便转移滤纸条，前端未浸渍石蜡的部分则为核酸结合区，用于后续的核酸吸附。
96.将待测样品，置于2ml离心管中，加入500μl裂解液裂解样品7s，将滤纸条的一端作为核酸结合区浸入裂解液中3s以吸附核酸，之后将滤纸条吸附dna的那端转移至1750μl清洗液中3s以清洗表面吸附的杂质。最后将滤纸条转移至配制好的te缓冲液中1min，以洗脱表面吸附的核酸，使核酸进入te溶液中。
97.本实施例采用核酸检测试纸(fitc-地高辛)购自上海佑隆生物科技有限公司。
98.所用的引物的序列如seq id no.1(正向引物)和seq id no.2(反向引物)所示，并且在正向引物5’端以fitc标记，反向引物5’端以地高辛标记。
99.检测方法包括如下步骤：
100.(1)提取样品dna
101.称取经炮制样品研成粉状或鲜雀脑样品研成粉状或糊状0.05～0.15g，置于2ml离心管中，加入500μl裂解液裂解样品7s，将滤纸条浸入裂解液中3s以吸附核酸，之后将滤纸条转移至1750μl清洗液中3s以清洗表面吸附的杂质。最后将滤纸条转移至配制好的扩增反
应体系中3s，以洗脱表面吸附的核酸，扩增体系即配制完成。
102.(2)雀脑的扩增反应体系：pcr prime star hs premix(购自宝生物工程(大连)有限公司)25μl，带有fitc、地高辛标记的上、下游引物(浓度10μmol/l)各0.25μl、模板1μl、补水至50μl。雀脑成分pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；63℃退火30s，30个循环，72℃延伸5min。
103.(3)将上述pcr扩增产物滴入核酸检测试纸条的样品区。
104.(4)过5-8分钟后判读，得到相应的检测结果，其他时间判读无效。
105.(5)读取结果时，试纸水平置于观察者正面。
106.(6)结果判断标准如图6所示，
107.阴性(－)：出现c线，t线不显色；
108.阳性( )：出现c线，t线显色肉眼可见；
109.无效：未出现c线，可能操作不当或试纸已失效。
110.扩增产物稀释倍数考察：分别将雀脑成分扩增产物5倍、10倍、15倍、20倍用检测稀释液稀释，其中，检测稀释液的组成为：30mmol/l的ph7.0柠檬酸缓冲液和0.3mol/l nacl。加入检测试纸条中进行检测，实验的结果如图7所示，最终确定稀释倍数为15倍时，既能节约扩增产物使用量，又能够满足实验需求获得准确检测结果。
111.实施例4雀脑成分核酸检测试纸条特异性实验
112.样品前处理：分别取16种动物脑样品(相应16种动物脑部组织1：麻雀2：鸽3：鹅4、猪5：驴6：狐狸7：三文鱼8：乌梢蛇9：鹌鹑10：鸡11：兔12：羊13：鸭14：牛15：马16：貂)20mg，研成粉状或糊状上述样品，置于2ml离心管中，加入500μl裂解液裂解样品7s，将滤纸条浸入裂解液中3s以吸附核酸，之后将滤纸条转移至1750μl清洗液中3s以清洗表面吸附的杂质。最后将滤纸条转移至配制好的扩增反应体系中3s，以洗脱表面吸附的核酸，扩增体系即配制完成。
113.(2)扩增反应体系，用实施例3中的引物，其中体系包括：pcr prime star hs premix(购自宝生物工程(大连)有限公司)25μl、上、下游引物(浓度10μmol/l)各0.25μl、模板1μl、补水至50μl。pcr扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；63℃退火30s，30个循环，72℃延伸5min。
114.(3)将上述pcr扩增产物50μl用检测稀释液稀释15倍，放入核酸检测试纸条，所述检测稀释液的组成为：30mmol/l、ph7.0柠檬酸缓冲液，0.3mol/l nacl。
115.(4)5-8分钟判读，得到相应的检测结果，其它时间判读无效。
116.结果见图8所示，图中从左到右为1、麻雀，2、鸽，3、鹅，4、猪，5、驴，6、狐狸，7、三文鱼，8、乌梢蛇，9、鹌鹑，10、鸡，11、兔，12、羊，13、鸭，14、牛，15、马，16、貂，17、空白对照(ddh2o)，结果表明，上述动物除麻雀外成分结果均成阴性，表明核酸检测试纸条法具备高特异性。
117.实施例5
118.目前市场上常见的雀脑炮制方式有两种，一种为四季均可捕杀。捕杀时，取出头部的血鲜用或杀死后，取出脑髓鲜用，暂定义为鲜雀脑；另一种为冬季捕捉后取出脑髓，用硫磺进行加工，硫磺炮制雀脑样品。分别采集了3批次的鲜雀脑样品，4批次的硫磺炮制雀脑样品，样品采集自亳州中药材市场和由山西广誉远国药有限公司提供。
119.检测方法采用实施例4中的方法进行检测。
120.结果如图9所示，图中qn-1、2、3分别代表采集的3批次的鲜雀脑，pqn-1、2、3、4分别代表硫采集的4批磺炮制后的雀脑样品。结果说明对于采集3批鲜雀脑，4批硫磺处理后的雀脑样品，均能检测出雀脑成分。
121.对于7批次采集的样品用核酸检测试纸条进行检测，均能检测出雀脑成分，说明该方法有很好的重复性。
122.实施例6
123.将10ng的雀脑提取的dna模板按10倍递减稀释，稀释至10-5
，稀释后的浓度分别为10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng，将每个梯度做5个平行实验，按照实施例2中pcr扩增方法进行检测，以水作为空白对照，测pcr方法的绝对灵敏度。
124.同时进行实施例3中方法及试剂进行核酸检测试纸条绝对灵敏度的检测。
125.将dna含量为10ng稀释度为10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng，样品进行雀脑成分pcr检测，凝胶电泳结果如图10所示，图中1-5点样孔为10ng，6-10点样孔为1ng，11-15点样孔为0.1ng，16-20点样孔为0.01ng，21-25点样孔为0.001ng，26-30点样孔为0.0001ng，k为空白对照，结果表明dna模板为10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng的扩增后电泳在336bp在电泳图谱相应的位置上有一条特异性扩增条带，0.0001ng和空白对照无条带。说明本发明中普通pcr法在0.001ng/反应电泳条带仍能够检出，普通pcr法绝对灵敏度能够达到0.001ng/反应。
126.而采用实施例3中购买的核酸检测试纸进行检测时，只能检测出10ng、1ng、0.1ng为阳性结果，说明市购的试纸检测的绝对灵敏度为0.1ng/反应。
127.实施例7
128.由实施例6可知，市售的核酸检测试纸灵敏度低，为了获得较高的灵敏度，进行了核酸检测试纸条的制备，具体如下：
129.1纳米金颗粒的制备
130.采用柠檬酸三钠法制备25nm的纳米金颗粒。将100ml 0.01％氯金酸溶液(haucl4)加热至沸腾，然后分别加入0.5、1、1.5、2、2.5、3和4ml1％柠檬酸三钠溶液。煮沸约5min后，溶液颜色由黄色变为酒红色。然后，将溶液冷却并过滤。最后，将纳米金溶液储存在4℃条件下。结果可见，纳米金溶液的颜色主要取决于纳米金颗粒制备过程中柠檬酸三钠的用量。随着柠檬酸三钠添加量的增加，纳米金溶液的颜色由淡紫色变为红色，但在添加量为2.5ml和4ml时，红色没有明显变化。因此，2.5ml的柠檬酸三钠可作为最佳加入体积量。最后选择加入2.5ml的柠檬酸三钠的制备获得的胶体金溶液，进行后续实验。
131.2纳米金抗体偶联物的制备
132.将制备好的胶体金以0.1mol/l k2co3调节ph值至6.6～7.0后，将纯化的小鼠抗地高辛抗体(roche，德国)用磷酸盐缓冲液稀释至0.5mg/ml，然后缓慢加入到3ml纳米金溶液中进行标记，标记浓度为10μg/ml。反应20min后，加入8μl 10％bsa封闭液，温和搅拌10min，使共轭物稳定。将所得溶液进行9000rpm离心30min后，用1.5ml偶联稀释缓冲液(1％bsa和0.02m磷酸盐缓冲液)进行重悬，将获得的纳米金抗体偶联物溶液均匀加在玻璃纤维膜上作为结合垫，37℃干燥2h。
133.3检测线和质控线的包被用0.01m磷酸缓冲液(ph 7.4)将山羊抗生物素抗体和山
羊抗小鼠igg抗体(sigma，美国)分别嵌入硝酸纤维素(nc)膜的检测线(t)和质控线(c)，抗体使用浓度均为1.5mg/ml和2mg/ml。处理后的nc膜在室温下干燥10min。硝酸纤维素(nc)膜贴在底衬卡上。
134.4核酸检测试纸条的组装
135.将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在底衬卡上，切成宽度为0.4cm的条，将切好的试纸条装壳，然后与干燥剂封装在铝箔袋内。其中，nc膜上的质控线靠近吸收垫的一侧设置，检测线靠近样品垫的一侧设置，用斩切机将试纸切割成4mm的检测条，然后与干燥剂封装在铝箔袋内。样品垫和结合垫材料均为玻璃纤维膜，吸收垫为吸水纸。
136.经大量实验研究发现，将样品垫浸入质量体积百分比为3％的bsa溶液后在50℃烘干的处理，可有效避免非特性条带的出现。
137.5测试方法与判定标准
138.将引物序列在合成时进行标记，正向引物seq id no.1的5
′
端标记的是生物素，反向引物如seq id no.2的5
′
端标记的是地高辛。
139.将dna含量为10ng稀释度为100～10-5
样品进行雀脑成分pcr检测，
140.进行pcr扩增时，用上述的引物(seq id no.1、seq id no.2)采用实施例2中的扩增体系和条件进行。
141.将上述pcr扩增产物50μl用检测稀释液稀释15倍，放入核酸检测试纸条，所述检测稀释液的组成为：30mmol/l、ph7.0柠檬酸缓冲液，0.3mol/l nacl。
142.检测结果如图10所示，图中1：10ng，2：1ng，3：0.1ng，4：0.01ng，5：0.001ng，6：0.0001ng，7为空白。图中可看出，1-5为阳性，6、7为阴性。结果说明自制试纸条检测方法的绝对灵敏度为0.001ng。
143.实施例8对人工制备混合样品的检测敏感性试验
144.将雀脑添加到不同基质中，按以下方法制备混合样品：用万分之一精密度分析天平，准确称取雀脑粉末，添加到猪脑冻干粉末中，分别制备重量含量比(雀脑成分)为10％、1％、0.1％、0.01％的混合样品；
145.对上述各组混合样品，每种含量比分别取3个样品，取等同量基质样品同步均独立提取核酸，并采用本发明实施例3提供的dna提取方法，用实施例7制备的试纸条分别进行检测。检测结果如下表：
146.混合检测样品测试结果
147.添加雀脑成分含量检测结果10％检出1％检出0.1％检出0.01％未检出
148.结果说明实际样品混合实际灵敏度能够达到0.1％，通过换算可得出最低能检出0.008μg样品，样品的实际检测灵敏度高于现有技术中的方法。
149.从样品掺入实际情况看，掺入千分之一能够检出，满足实际检测需要，说明本发明中自制的核酸检测试纸检测灵敏度极高，可以满足微量雀脑成分实际检测需求。
150.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任
何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。