一种孜然精油及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及植物精油技术领域，具体涉及一种孜然精油及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是世界范围内一个日益严重的健康问题，根据2020年全球癌症统计报告，2020年中国新发癌症457万例，癌症死亡病例300万例，其中肝癌和结肠癌占有较高的比例。从植物中分离出的天然化合物是新型抗癌药物的丰富来源。植物精油作为天然产物的重要组成部分，其抗癌活性受到国内外学者广泛关注。
3.植物精油是树木分泌物的一种，是重要的林产品，具有很广泛的生物活性，因而在农业、食品、化工等领域有广泛的应用。根据中研普华产业研究院数据显示，2017-2021年中国植物精油行业市场规模在逐年扩大，2019年市场规模达到69.4亿元，同比增长21.54％；2020年市场规模达到80.25亿元，同比增长15.63％，因而，植物精油是林产化学与加工学科重要的研究对象。
4.近年来，植物精油的抗癌活性越来越受到研究者们的重视，但其与细胞是如何结合而发挥作用，特别是植物精油的化学成分如何与靶点作用发挥生物学效应的问题一直困扰诸多研究者。此外，天然植物提取物成分复杂，传统试验方法在筛选有效成分方面费时耗力，周期长成本高，利用各种生物信息学方法进行新药研发和靶点预测已经成为热点。因此采用分子对接技术研究植物精油抗癌活性，有助于提高活性成分的筛选效率，揭示植物精油抗癌活性的机制。
5.孜然(学名:cuminum cyminum l.)，又名:枯茗、孜然芹，在南疆则被称为小茴香。属伞形目，伞形科一年生或二年生草本，高20～40cm，全株(除果实外)光滑无毛。花瓣粉红或白色，长圆形，花期4月，果期5月。孜然还具有醒脑通脉、降火平肝等功效，能祛寒除湿，理气开胃，祛风止痛。对消化不良、胃寒疼痛、肾虚便频、月经不调均有疗效。用孜然调味菜肴还能防腐杀菌。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提出一种孜然精油及其制备方法和应用，分析了制得的孜然精油的组分，研究了体外抗癌细胞的活性，进一步地，通过分子对接技术研究了其主要成分之一枯茗醛与癌细胞关键酶蛋白分子对接方法，得出了该孜然精油有很好的抗癌活性，可以应用于预防及治疗、辅助治疗抗癌症药物的制备，具有广阔的应用前景。
7.本发明的技术方案是这样实现的：
8.本发明提供一种孜然精油的制备方法，采用超声辅助水蒸气蒸馏提取工艺进行提取，包括以下步骤：
9.s1.将孜然经筛选、清洗、阴干后，收集；
10.s2.称取干燥的孜然，加入去离子水，浸泡后，连接并固定蒸馏装置，同时开启超声波装置，调节加热温度，保持混合物微沸的状态，当第一滴液滴馏出时开始计时，蒸馏，结束
加热，自然冷却至室温，收集精油提取器中油状液，过滤，得到孜然精油。
11.作为本发明的进一步改进，所述孜然和去离子水的固液比为1：(5-10)g/ml。
12.作为本发明的进一步改进，所述浸泡时间为1-2h，所述蒸馏时间为3-4h。
13.作为本发明的进一步改进，所述超声波功率在1000-2000w。
14.本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的孜然精油。
15.作为本发明的进一步改进，包含以下原料：枯茗醛、二氢枯茗醛、γ-萜品烯、7,7-二甲基-2-亚甲基-双环[2.2.1]庚烷、邻伞花烃、2,3-二甲氧基苯甲酸甲酯。
[0016]
本发明进一步保护如上述孜然精油在制备预防及治疗、辅助治疗抗癌症药物中的应用。
[0017]
作为本发明的进一步改进，所述癌症为肝癌或者结肠癌。
[0018]
本发明具有如下有益效果：本发明发现了一种绿色制备孜然精油的方法，并分析了制得的孜然精油的组分，研究了体外抗癌细胞的活性，进一步地，通过分子对接技术研究了其主要成分之一枯茗醛与癌细胞关键酶蛋白分子对接方法，得出了该孜然精油有很好的抗癌活性，可以应用于预防及治疗、辅助治疗抗癌症药物的制备，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0019]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]
图1为孜然精油总离子流图；
[0021]
图2为枯茗醛与结肠癌、肝癌靶点韦恩图；
[0022]
图3为受体与配体3d结构图；
[0023]
图4为枯茗醛与4dit(左)、4wj9(右)相互作用图；
[0024]
图5为阴性对照组处理后结肠癌hct116细胞光镜图；
[0025]
图6为孜然精油处理后结肠癌hct116细胞光镜图；
[0026]
图7为阴性对照组肝癌hepg2细胞光镜图；
[0027]
图8为孜然精油处理后肝癌hepg2细胞光镜图。
具体实施方式
[0028]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]
实施例1
[0030]
一种孜然精油的制备方法，采用超声辅助水蒸气蒸馏提取工艺进行提取，包括以下步骤：
[0031]
s1.将孜然经筛选、清洗、阴干后，收集；
[0032]
s2.称取10g干燥的孜然，加入50ml去离子水，浸泡1h后，连接并固定蒸馏装置，同
时开启超声波装置，超声波功率为1000w，调节加热温度，保持混合物微沸的状态，当第一滴液滴馏出时开始计时，蒸馏3h，结束加热，自然冷却至室温，收集精油提取器中油状液，过滤，得到孜然精油。
[0033]
实施例2
[0034]
一种孜然精油的制备方法，采用超声辅助水蒸气蒸馏提取工艺进行提取，包括以下步骤：
[0035]
s1.将孜然经筛选、清洗、阴干后，收集；
[0036]
s2.称取10g干燥的孜然，加入100ml去离子水，浸泡2h后，连接并固定蒸馏装置，同时开启超声波装置，超声波功率为2000w，调节加热温度，保持混合物微沸的状态，当第一滴液滴馏出时开始计时，蒸馏4h，结束加热，自然冷却至室温，收集精油提取器中油状液，过滤，得到孜然精油。
[0037]
实施例3
[0038]
一种孜然精油的制备方法，采用超声辅助水蒸气蒸馏提取工艺进行提取，包括以下步骤：
[0039]
s1.将孜然经筛选、清洗、阴干后，收集；
[0040]
s2.称取10g干燥的孜然，加入70ml去离子水，浸泡1.5h后，连接并固定蒸馏装置，同时开启超声波装置，超声波功率为1500w，调节加热温度，保持混合物微沸的状态，当第一滴液滴馏出时开始计时，蒸馏3.5h，结束加热，自然冷却至室温，收集精油提取器中油状液，过滤，得到孜然精油。
[0041]
测试例1
[0042]
将实施例3制得的孜然精油进行gc-ms分析
[0043]
gc色谱条件：进样口温度为250℃；进样量为1μl；柱流量为1.0ml/min；分流比为100:1；程序升温：初始温度为60℃，保持1min，以5℃/min升至180℃后，保持1min，再以10℃/min升至260℃，保持1min。采用峰面积归一化法计算成分的相对含量。
[0044]
ms质谱条件：电离方式为ei电离源，电离能为70ev，离子源温度230℃，四级杆温度为150℃。质量扫描模式全扫描，扫描范围为m/z：33～600u。仪器自带数据库鉴定成分进行成分比对。
[0045]
gc-ms总离子流图见图1。检测结果见表1，在孜然精油中共检测出16个色谱峰，鉴定出15个化合物。孜然精油主要成分种类为单萜烃(37.53％)及含氧单萜烃(62.14％)。主要化学成分及相对百分含量为：枯茗醛(26.75％)，二氢枯茗醛(26.03％)，γ-萜品烯(17.92％)，7,7-二甲基-2-亚甲基-双环[2.2.1]庚烷(10.99％)、邻伞花烃(5.76％)、2,3-二甲氧基苯甲酸甲酯(3.11％)。
[0046]
表1 孜然精油主要化学成分
[0047][0048]
测试例2 枯茗醛与癌细胞关键酶蛋白分子对接
[0049]
枯茗醛是孜然精油中含量最高且公认存在的成分。
[0050]
(1)从https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/网站查找枯茗醛(cuminaldehyde)结
构信息，获得smiles式为：cc(c)c1＝cc＝c(c＝c1)c＝o。
[0051]
(2)在http://www.swisstargetprediction.ch/网站中插入枯茗醛结构信息cc(c)c1＝cc＝c(c＝c1)c＝o，点“＝”后得到结构信息，选择“homo sapiens”，获得枯茗醛预测靶点，共有100个，见附录c-1。优先选择“probability”系数大的靶点，系数为零的可不考虑。
[0052]
(3)分别在https://www.genecards.org/网站输入关键词：“colon cancer”、输出结肠癌靶点，共有21464个；输入关键词：“hepatocellular carcinoma”，获得肝癌的靶点，共有7392个。
[0053]
(4)采用绘制韦恩图，找出枯茗醛与结肠癌、肝癌的共有靶点70个，见图2。其中两个靶点“probability”值最大，为0.04，分别是gsk3β(糖原合成激酶)和aldh1a1(乙醛脱氢酶1a1)，见表2。
[0054]
(5)在https://www.uniprot.org/数据库中获取gsk3β和aldh1a1对应的“uniprot id”(gsk3β对应p49841；aldh1a1对应p00352)。
[0055]
表2 枯茗醛与结肠癌、肝癌靶点表
[0056][0057]
(6)根据“uniprot id”在pdb蛋白质结构数据库找到对应蛋白分子编码(p49841对应gsk3β；p00352对应4wj9)的3d结构作为受体结构。使用autodock tools 1.5.6软件自带的rdkit程序对枯茗醛分子进行模型构建，并运用其能量最小化模块，分别优化得到能量最低的构象，作为配体结构(见图3。
[0058]
(7)分子结构预处理：4dit和4wj9作为本次对接的受体，枯茗醛作为本次对接的配体。使用autodock tools 1.5.6软件预处理，将4dit和4wj9中的所有水分子和配体删除，添加极性氢原子并计算gasteiger电荷。将枯茗醛添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转。
[0059]
(8)分子对接细节：采用autodock vina 1.1.2进行分子对接，并对接结果进行分析处理。配体设置为柔性，受体设置为刚性。4dit活性中心gridbox位置设置为center_x＝12.089，center_y＝2.573，center_z＝-12.558；大小设置为size_x＝60，size_y＝60，size_z＝60；spaces＝1。4wj9的活性中心gridbox位置设置为center_x＝45.056，center_y＝-1.414，center_z＝19.163；大小设置为size_x＝60，size_y＝60，size_z＝60；spaces＝1。搜寻精度exhaustiveness设为32，num_modes＝5，其他参数默认。
[0060]
结果如图4，枯茗醛分子在4dit中处于疏水口袋位置，被氨基酸残基lys85，val70，ile62，leu132，tyr134，leu188包围，形成较强的疏水结合；枯茗醛末端醛基能与asp200中氨基结合形成氢键，键长是枯茗醛与4wj9中的phe469，lsy470，gly468氨基酸残基形成疏水结合，末端醛基能同时与gly475，arg476末端的氨基结合形成氢键，键长分别是3.14、根据autodock vina 1.1.2软件计算，枯茗醛与4dit、4wj9的分子结合能分别为-6.10，-17.58kcal/mol。(1kcal＝4.185kj。)
[0061]
测试例3体外抗肿瘤活性
[0062]
样品溶液的配制：分别称取实施例3制得的孜然精油适量溶解于0.5g/ml的peg2000溶液，配制成10mg/ml的精油溶液，再分别稀释为25、50、100、200μg/ml不同浓度的精油供试液。顺铂和紫杉醇则分别溶解于0.5g/ml dmso中(顺铂和紫杉醇难溶于peg2000溶液)，并分别稀释为12.5、25、50、100μg/ml，作为阳性对照液。
[0063]
缓冲盐溶液(pbs)的配制：准确称量nacl 2.0g、kcl 0.05g、na2hpo4·
12h2o 0.9g、kh2po
4 0.05 g，于灭菌超纯水中溶解，然后定容至250ml，高压灭菌锅灭菌后保存备用。
[0064]
癌细胞复苏：将结肠癌hct116细胞与肝癌hepg2细胞冻存管从液氮储存罐中取出，分别置于37℃水浴锅中，持续轻微摇动冻存管，使其快速解冻，待解冻完成后，在超净工作台中用移液器将细胞打匀，并加入至装有1640培养基2ml的离心管内，在转速为800rpm离心5min，弃掉上层清液，向离心管中加入新鲜1640培养基使细胞悬浮，吸装到培养皿中，补加培养基至8ml。将其转入培养箱中在37℃、5％co2和饱和湿度条件下进行培养，每24h更换一次培养基，观察贴壁情况，当细胞长满80-90％培养皿时即可进行细胞培养。
[0065]
癌细胞培养：将生长状态良好的贴壁细胞用pbs缓冲液清洗两次，滴加1ml的0.05％胰蛋白酶进行消化，摇动培养皿，让胰蛋白酶与细胞充分的接触，用移液器吸掉一部分胰蛋白酶，再将其转入37℃恒温培养箱中消化2min后拿出，然后加入4ml的1640培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，待细胞吹打均匀后，按照需要吸取适量体积细胞液至新的培养皿中，每个培养皿中补加新鲜的培养基至8ml，将其转入培养箱中在37℃、5％co2和饱和湿度条件下进行培养，每24h更换新培养基，观察细胞培养情况。
[0066]
取对数生长期的结肠癌hct-116细胞或肝癌hepg2细胞，滴加适量的0.05％胰蛋白酶进行充分消化，用1640培养基调整细胞浓度为5
×
103个/ml的细胞悬浮液。在96孔板中，每孔加入100μl细胞悬浮液进行接种，将96孔板转移至恒温培养箱中在37℃、5％co2和饱和湿度条件下进行培养，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度精油供试溶液100μl，每个浓度设3个平行组。另外以添加了100μl的顺铂、紫杉醇阳性对照液的细胞悬浮液作为阳性对照组，添加了peg2000溶液100μl的细胞悬浮液作为阴性对照组，各实验组配制情况见表3。将96孔板放置于细胞培养箱中孵育18h后，在倒置荧光显微镜下进行观察。
[0067]
表3实验组配制情况表
[0068] 细胞悬浮液μl精油μl紫杉醇/顺铂μlpbs溶液μlpegμl样品组100100
ꢀꢀꢀ
阴性对照组100
ꢀꢀꢀ
100阳性对照组100 100
ꢀꢀ
[0069]
在倒置显微镜镜下拍照后，继续向96孔板每孔加入mts试剂10μl，37℃孵育30min，使用酶标仪在490nm处测定吸光值(od)，计算癌细胞增殖抑制率，计算方法如下：
[0070][0071]
odb：空白组吸光值，ods：样品吸光值，od
p
为培养基吸光值。
[0072]
采用mts法测定了孜然精油对结肠癌hct116细胞体外增殖的抑制率，结果见表4。
[0073]
表4
[0074]
浓度μg/ml抑制率(％)
2531.74
±
3.935038.74
±
8.3810050.44
±
11.8120054.30
±
2.48
[0075]
表5阳性对照药物抑制结肠癌hct116细胞体外增殖实验结果(n＝3)
[0076][0077]
由上表可知，在精油浓度为200μg/ml条件下，孜然精油的抑制率达到了54.3％。因此，可以认为，孜然精油具有良好的抑制结肠癌细胞体外增殖的活性。
[0078]
在倒置显微镜下拍摄hct-116细胞生长的照片。在同一面积视野下，阴性对照组hct-116细胞生长旺盛(图5)，细胞形态正常。经过200μg/ml孜然精油处理后细胞数量明显减少(图6)，细胞胞体出现不同程度的细胞体破裂，细胞轮廓呈不规则状。这表明孜然精油能抑制结肠癌hct116细胞的增殖，与mts法实验研究结论吻合。
[0079]
采用mts法测定了孜然精油对肝癌hepg2细胞体外增殖的抑制率，结果见表6。
[0080]
表6
[0081]
浓度μg/ml抑制率(％)2529.14
±
4.245035.09
±
4.7710037.55
±
3.9720042.17
±
4.56
[0082]
表5阳性对照药物抑制肝癌hepg2细胞体外增殖实验结果(n＝3)
[0083]
[0084]
由上表可知，在精油浓度为200μg/ml条件下，孜然精油的抑制率达到了42.17％。因此，可以认为，孜然精油具有良好的抑制肝癌细胞体外增殖的活性。
[0085]
在倒置显微镜下拍摄肝癌hepg2生长的照片。在同一面积视野下，阴性对照组肝癌hepg2生长旺盛(图7)，细胞形态正常。经过200μg/ml孜然精油处理后细胞数量明显减少(图8)，细胞胞体出现不同程度的细胞体破裂，细胞轮廓呈不规则状。这表明孜然精油能抑制肝癌hepg2细胞的增殖，与mts法实验研究结论吻合。
[0086]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。