一种以玉米芯为原料培养蛹虫草菌生产虫草素的方法

1.本发明属于食品、生物医药及农业领域，具体涉及一种以玉米芯为原料培养蛹虫草菌生产虫草素的方法。
技术背景
2.近年来的研究结果表明，虫草素因其独特的化学结构具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等生物学活性及药理作用。有学者研究发现虫草素可以通过干扰dna/rna的生物合成达到抗癌、抗肿瘤的目的。patrick等人研究发现虫草素能引起快速和明显的上调细胞周期抑制剂p21和细胞周期启动子cyclin d1的下调，最终导致抑制11z人上皮子宫内膜异位细胞的增殖。虫草素能够降低p38丝裂原活化蛋白激酶及其中一种形式为成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化。虫草素还可以通过nf-κb依赖性炎症反应的失活来抑制t2d调节基因，因此虫草素可作为免疫调节剂治疗免疫疾病。2021年牛津大学与制药公司的研究团队合作证实虫草素具有治疗癌症的效果，虫草素经化学修饰后得到的药物可以克服关键的耐药机制并在癌细胞内产生高水平的活性抗癌代谢物，在i期临床阶段患者表现出良好的耐受性。除此之外，虫草素还具有抑制细胞氧化、延缓衰老，提高机体免疫功能，抑制致病性原生动物等多重功效。正是由于虫草素在各种疾病的缓解与治疗方面的综合性功效，使得其在医药方面具有巨大的潜在研究价值。
3.虫草素的合成途径主要是化学合成和生物合成。相比于化学合成法，生物合成法不仅安全而且更有研究价值。现有研究中主要以蛹虫草菌作为获取虫草素的主要来源，虫草素的合成主要是通过蛹虫草液体发酵，为提高虫草素产量，国内外学者开展了大量应用蛹虫草菌液体培养生产虫草素的研究，如进行前体物质的添加、培养基组成成分及比例、溶氧量等因素的研究，一些学者也通过构建基因工程菌株或者对原始菌株进行诱变等方式来获得虫草素高产菌株。但蛹虫草菌在发酵过程中的许多限制性条件如蛹虫草菌的液体发酵过程存在耗时长(约15-30d)、培养基成分复杂、成本较高等对虫草素的工业化生产了较大的阻碍，导致虫草素的市场价格昂贵，限制了虫草素相关药物的开发及应用。因此，亟需开发一种低成本、高收率的生产虫草素的方法，实现虫草素的规模化生产和应用。


技术实现要素：

4.为解决上述现有技术所存在的问题，本发明提供了一种以玉米芯为原料液体发酵生产虫草素的方法，旨在以玉米芯为主要原料，经预处理和酶解后作为蛹虫草培养基的廉价碳源，有助于实现虫草素的低成本规模化生产和应用。
5.本发明的发明构思是：微生物发酵产物的产量不仅与菌株本身、培养条件等有关，还与培养基成分(特别是碳源)相关。在蛹虫草液体发酵生产中，葡萄糖和木糖均可被代谢利用，用于虫草素的生物合成。当蛹虫草以葡萄糖为碳源时，葡萄糖能够通过糖酵解途径保证细胞能量供应，有利于细胞生长；以木糖为碳源时，木糖代谢有助于增加磷酸戊糖途径及嘌呤代谢途径通量，避免碳通量由糖酵解途径、tca循环进入彻底氧化分解而导致虫草素合
成前体物质供应不足。纤维质原料是一种丰富而廉价的碳源，经过酶水解或酸水解能使可发酵的小分子糖类物质释放出来，可作为微生物的基本营养物质，用于微生物发酵生产工业产品，降低生产成本。玉米芯含有大量纤维素和半纤维素，经过酸、碱及纤维素酶处理降解为小分子糖(主要包括葡萄糖和木糖)，能够满足液体发酵过程中蛹虫草菌的生长并生产虫草素，可应用于低成本工业化生产虫草素。
6.为解决上述问题，本发明采用如下技术方法：
7.一种以玉米芯为原料培养蛹虫草菌生产虫草素的方法，所述方法包括：将玉米芯进行碱预处理，经过预处理的玉米芯进行酶解以获取玉米芯酶解液，使用玉米芯酶解液作为碳源制备蛹虫草发酵培养基，进行蛹虫草液体发酵。为提高玉米芯酶解液的还原糖含量，本发明进行了酶用量及酶解时间的优化，所述方法酶用量为100-500u，酶解时间为12-60h。
8.步骤包括：
9.(1)玉米芯预处理：称取干燥玉米芯(玉米芯粉碎并过筛)于玻璃容器中，加入10％(v/v)naoh溶液，25℃静置20-30h，经过滤后用去离子水清洗固体残渣直至中性，将碱预处理的玉米芯置于60℃烘干备用。
10.(2)玉米芯酶解液的配制：称取上述经碱预处理的玉米芯，置于玻璃容器中，按固液比1:20分别加入纤维素酶液，37℃条件下酶解，获得玉米芯酶解液。
11.(3)菌种活化：将蛹虫草菌接种至装有100ml斜面培养基的茄子瓶中，于25℃恒温培养15-20d产生孢子，优选15d。
12.(4)孢子悬液制备：在无菌操作条件下取适量生理盐水用玻璃棒刮洗孢子并经三层纱布过滤得到孢子悬液(10
7-108孢子/ml)。
13.(5)配制发酵培养基：玉米芯酶解液80-150ml/l、硫酸铵3-8g/l、磷酸氢二钾0.5-2g/l、磷酸二氢钾0.5-2g/l、七水硫酸镁0.2-0.8g/l、七水硫酸锌0.5-1g/l、维生素b10.1-0.5g/l、甘氨酸2-6g/l、天冬氨酸0.2-0.8g/l、谷氨酰胺0.5-2g/l、酪氨酸0.05-0.2g/l、半胱氨酸0.05-0.2g/l、亮氨酸0.2-0.8g/l、赖氨酸0.5-2g/l、苯丙氨酸0.1-0.5g/l。培养基灭菌条件：121℃灭菌15-30min。
14.(6)液体发酵：液体发酵接种量为1-10％(v/v)，150-180r/min、25℃条件下培养15-20d。
15.进一步的，上述步骤(1)玉米芯与naoh溶液质量体积比1g:(5～15)ml。步骤(1)中所用网筛为60-100目筛。
16.进一步的，上述步骤(2)中的纤维素酶液用量为100-500u，酶解时间为12-60h。
17.进一步的，上述步骤(3)中斜面培养基(g/l)：葡萄糖30、蛋白胨10、磷酸二氢钾1、七水硫酸镁0.5、琼脂30，自然ph，121℃灭菌15-20min。
18.进一步的，上述步骤(4)孢子悬液使用显微镜计数并稀释至(1～6.5)
×
107孢子/ml。
19.进一步的，上述步骤(6)中的接种在紫外灭菌30min的超净工作台中进行。
20.与现有技术相比，本发明以玉米芯为原料，经预处理及酶解后能够形成蛹虫草菌可利用的发酵碳源(葡萄糖和木糖混合物)，并在酶解过程控制酶用量及酶解时间进行酶解优化，提高了酶解液的还原糖含量，实现将玉米芯酶解液作为蛹虫草菌的发酵碳源进行液体发酵产生虫草素。本发明为蛹虫草菌液体发酵生产虫草素提供了廉价的碳源，有助于实
现虫草素的低成本工业化生产。
附图说明
21.图1玉米芯的预处理；其中，图(a-c)分别为玉米芯处理前、粉碎后及过筛后样品图。
22.图2为本发明实施例1中以葡萄糖或木糖为碳源进行蛹虫草菌液体发酵。其中，(a-b)、以葡萄糖为碳源，(c-d)以木糖为碳源。
23.图3为实施例2中不同酶用量及不同酶解时间对玉米芯酶解液中还原糖含量的影响；其中(a)为酶用量100u-500u时玉米芯酶解液的还原糖含量，(b)为酶解时间12-60h玉米芯酶解液的还原糖含量。
24.图4为本发明实施例3中以玉米芯水解液为碳源培养蛹虫草产虫草素。
具体实施方式
25.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明中所采用蛹虫草菌cordyceps militaris为本领域已知菌种，为了详细阐述实施例，本实施例所用蛹虫草菌为c.militaris ffcc 5111，由大连工业大学生物工程学院选育保藏。
26.实施例1
27.本实施例考察葡萄糖或木糖作为唯一碳源对蛹虫草菌菌体生长和虫草素代谢的影响，具体操作步骤如下：
28.(1)菌种活化：将蛹虫草菌接种至装有100ml斜面培养基的茄子瓶中，于25℃恒温培养15d产生孢子。
29.(2)孢子悬液制备：在无菌操作条件下取适量生理盐水用玻璃棒刮洗孢子并经三层纱布过滤得到孢子悬液(1.2
×
108孢子/ml)。
30.(3)配制发酵培养基：葡萄糖20～40g/l(或木糖20～40g/l)、硫酸铵5g/l、磷酸氢二钾1g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、七水硫酸锌0.86g/l、维生素b10.2 g/l、甘氨酸5g/l、天冬氨酸0.5g/l、谷氨酰胺1g/l、酪氨酸0.1g/l、半胱氨酸0.1g/l、亮氨酸0.5g/l、赖氨酸1g/l、苯丙氨酸0.2g/l。121℃灭菌20-30min。
31.(4)液体发酵：液体发酵接种量为1％(v/v)，150-180r/min、25℃条件下培养15-20d。
32.(5)虫草菌生物量测定：采用干重法，取2ml发酵液，12000r/min离心5min弃上清，去离子水清洗2遍菌体，80℃烘干至恒重，测生物量。
33.(6)虫草素产量检测。
34.发酵液中虫草素含量采用高效液相色谱法检测。紫外检测波长为260nm，色谱柱用venusil mp c18(2)(4.6mm
×
250mm)，柱温设定25℃，进样量10μl，流速0.8ml/min，流动相为甲醇：水(20:80)，梯度洗脱。
35.实验结果如图2所示，蛹虫草既能利用葡萄糖作为碳源进行虫草素液体发酵生产
虫草素，也能利用木糖作为碳源进行虫草素液体发酵生产虫草素。
36.实施例2
37.本实施例考察了不同酶用量及不同酶解时间对玉米芯酶解液中还原糖含量的影响，优化了玉米芯的酶解的纤维素酶用量和酶解时间，具体操作步骤如下：
38.(1)玉米芯预处理：称取10g干燥玉米芯粉(玉米芯粉碎并过80目筛)于三角瓶中，加入100ml10％(v/v)naoh溶液，25℃静置20-30h，经过滤后用去离子水清洗固体残渣直至中性，将碱预处理的玉米芯置于60℃烘干备用。
39.(2)玉米芯酶解液的配制：
40.最佳酶用量：称取1g经碱预处理的玉米芯，置于250ml三角瓶中，按固液比1:20分别加入100u、200u、300u、400u和500u的纤维素酶液，37℃酶解48h收集酶解液，测定还原糖含量，以确定最佳酶用量。最佳酶解时间；按固液比1:20加入由上述确定的最佳纤维素酶用量，37℃条件下酶解72h，每隔12h取样并测定还原糖含量，以确定最佳酶解时间。
41.(3)菌种活化：将蛹虫草菌接种至装有100ml斜面培养基的茄子瓶中，于25℃恒温培养15d产生孢子。
42.(4)孢子悬液制备：在无菌操作条件下取适量生理盐水用玻璃棒刮洗孢子并经三层纱布过滤得到孢子悬液(2.5
×
108孢子/ml)。
43.(5)配制发酵培养基：玉米芯酶解液100ml/l、硫酸铵5g/l、磷酸氢二钾1g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、七水硫酸锌0.86g/l、维生素b10.2 g/l、甘氨酸5g/l、天冬氨酸0.5g/l、谷氨酰胺1g/l、酪氨酸0.1g/l、半胱氨酸0.1g/l、亮氨酸0.5g/l、赖氨酸1g/l、苯丙氨酸0.2g/l。121℃灭菌20-30min。
44.(6)液体发酵：液体发酵接种量为1％(v/v)，150-180r/min、25℃条件下培养15-20d。
45.(7)玉米芯酶解液中还原糖浓度选用3,5-二硝基水杨酸法测定，参考“xie cy,guz x,fan g j,etal.production of cordycepin and mycelia by submerged fermentation of cordyceps militaris in mixture natural culture[j].appliedbiochemistry biotechnology,2009,158(2):483-492；”中的方法。
[0046]
(8)虫草素产量检测。
[0047]
发酵液中虫草素含量采用高效液相色谱法检测。紫外检测波长为260nm，色谱柱用venusil mp c18(2)(4.6mm
×
250mm)，柱温设定25℃，进样量10μl，流速0.8ml/min，流动相为甲醇：水(20:80)，梯度洗脱。
[0048]
不同酶用量及不同酶解时间对玉米芯酶解液中还原糖含量的影响如图3所示，可见使用不同的酶用量酶解玉米芯，玉米芯酶解液中还原糖浓度差异较大，当纤维素酶用量为300u时，1g玉米芯酶解48h后酶解的还原糖含量最高。确定最适酶用量后，称取等量玉米芯原料酶解不同时间(12-72h)，结果显示36h为最适酶解时间。
[0049]
实施例3
[0050]
本实施例结合优化的纤维素酶用量和酶解时间酶解玉米芯，实现以玉米芯为原料生产虫草素，具体步骤如下：
[0051]
(1)玉米芯预处理：称取5g干燥玉米芯粉(玉米芯粉碎并过80目筛)于三角瓶中，加入100ml10％(v/v)naoh溶液，25℃静置20-30h，经过滤后用去离子水清洗固体残渣直至中
性，将碱预处理的玉米芯置于60℃烘干备用。
[0052]
(2)玉米芯酶解液的配制：称取1g经碱预处理的玉米芯，置于250ml三角瓶中，按固液比1:20分别加入300u的纤维素酶液，37℃条件下酶解36h，获得酶解液。
[0053]
(3)菌种活化：将蛹虫草菌接种至装有100ml斜面培养基的茄子瓶中，于25℃恒温培养15d产生孢子。
[0054]
(4)孢子悬液制备：在无菌操作条件下取适量生理盐水用玻璃棒刮洗孢子并经三层纱布过滤得到孢子悬液(6.5
×
107孢子/ml)。
[0055]
(5)配制发酵培养基：玉米芯酶解液100ml/l、硫酸铵5g/l、磷酸氢二钾1g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、七水硫酸锌0.86g/l、维生素b10.2 g/l、甘氨酸5g/l、天冬氨酸0.5g/l、谷氨酰胺1g/l、酪氨酸0.1g/l、半胱氨酸0.1g/l、亮氨酸0.5g/l、赖氨酸1g/l、苯丙氨酸0.2g/l。121℃灭菌20-30min。
[0056]
(6)液体发酵：液体发酵接种量为1％(v/v)，150-180r/min、25℃条件下培养15-20d。
[0057]
(7)还原糖浓度选用3,5-二硝基水杨酸法测定。
[0058]
(8)蛹虫草菌生物量测定：采用干重法，取2ml发酵液，12000r/min离心5min弃上清，去离子水清洗2遍菌体，80℃烘干至恒重，测生物量。
[0059]
(9)虫草素产量检测。
[0060]
发酵液中虫草素含量采用高效液相色谱法检测。紫外检测波长为260nm，色谱柱用venusil mp c18(2)(4.6mm
×
250mm)，柱温设定25℃，进样量10μl，流速0.8ml/min，流动相为甲醇：水(20:80)，梯度洗脱。
[0061]
如图4所示，利用玉米芯为原料，经酶解处理后的玉米芯酶解液可作为蛹虫草液体发酵培养基的碳源，可实现虫草素的低成本生产。
[0062]
以上所述的具体实施方式仅仅用于示例说明或解释本发明的原理，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本专利范围的限制。因此，在不偏离本发明精神和范围的情况下，任何熟悉本技术领域的技术人员，根据本发明所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。