修饰NF-YC4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力

修饰nf-yc4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力
1.本技术是申请号为201680022422.6，申请日为2016年02月17日，题目为“修饰 nf-yc4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力”的专利申请的分案 申请。
2.关于联邦资助的研究或开发的声明
3.本文所述工作至少部分由来自美国国家科学基金会的拨款支持，mcb授予号为 0209789和0951170。因此，美国政府对本发明拥有一定权利。
技术领域
4.本公开涉及增加真核细胞的蛋白质含量，提高植物对胁迫，如非生物(例如盐、干 旱和污染)或生物(如病原体和害虫)胁迫，的抗性，有经修饰的转录抑制子结合位点的启 动子，使得转录抑制子无法阻碍基因nf-yc4的转录，qqs，talens，crispr/cas9， 组织培养物，杂交和回交植物，杂交种植物，可再生细胞和种子。
5.发明背景
6.蛋白质缺乏是发展中国家中的主要健康问题。低蛋白摄入每年在数亿儿童中引起智 力迟钝、发育迟缓、疾病易感性、消耗病和/或死亡(forrester等,plos one 7:e35907(2012)； gomes等,j.neuroscience res.87:3568-3575(2009))。
7.植物提供超过60％的人膳食蛋白质(young等,am.j.clin.nutr.59:1203s-1212s (1994))。增加主要作物的蛋白质含量能帮助缓解蛋白质缺乏，尤其是当使用动物产生等 量蛋白时需要约100倍的水和11倍的能量(pimentel等,am.j.clin.nutr.78:6605-6635 (2003))且增加动物蛋白质含量通常伴随着蛋白质质量或产率减少(bellaloui等, agricultural sciences 1:110-118(2010)；wenefrida等,j.agricultural food chem.61: 11702-11710(2013))。
8.拟南芥qqs(at3g30720,qua-quine starch)孤独基因调节拟南芥蛋白质含量。拟南芥 淀粉合酶3(atss3)突变体与野生型(wt)对照系在形态上相似但淀粉水平不同(zhang等, plant physiol.138:663-674(2005))，具有比wt中所发现的超过5倍的qqs转录物的量 (li等,plant j.58:485-498(2009))。拟南芥中的qqs过表达提高叶的总蛋白质含量并降 低总淀粉含量，同时qqs下调具有逆效应(li等,plant biotech.j.13:177-187(2015)；li 等.(2009),同上)。作为转基因的qqs表达提高其它植物的蛋白质含量，如大豆(williams82变种；li等(2014)，同上；li等(2009)，同上)。
9.观察到qqs表达与多种发育、环境和遗传学扰动紧密联系(参见例如arendsee等, trends in plant sci doi:10.1016/j.tplants.2014.07.003(2014)；li等(2009),同上；和li等 (2015),同上)。然而，其在这类扰动中的作用尚未阐明。例如，pen3(penetrationresistance 3(atlg59870、pen3、abc结合盒转运子基因)赋予对真菌和卵菌病原体的非 宿主抗性。据报道，qqs是在pen3敲除(ko)突变体中上调的唯一基因；然而，qqs在 感染和非感染突变体中上调(stein等,plant cell 18(3):731-746(2006))。作为另一示例，2 种突触融合蛋白即syp121(at3gl l820,pen1)和syp122(at3g52400)赋予对白粉菌的抗 性。这些
基因的敲除体引起对这些病原体的敏感性增加；qqs据报道是在两者中都上调 的唯一基因(zhang等(2008))。相反，pen3和exll在暴露于一些病原体后上调，qqs 响应一些病原体感染而下调，如丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)(kwon等,planta236(3):887-900(2012)；和thilmony等,plant j.46(1):34-53(2006))。当用phytoptherainfestans接种拟南芥植物时，qqs据报道首先在接种后6小时下调，然后在接种后12 和24小时上调(scheel等,arrayexpress的实验id是"e-geod-5616")。
10.因此，鉴于上述情况，本公开的目的是鉴定与qqs相互作用的基因。在拟南芥中， qqs与核因子y亚基c4(nf-yc4,at5g63470)相互作用。另一目的是提供用于操作所鉴 定基因的材料和方法。在实施方案中，操作这种基因引起蛋白质含量增加和/或碳水化合 物含量减少。另一目的是提供用于提高植物对病原体或害虫抗性的材料和方法。这些和 其它目的以及发明特征通过本文所提供的详细描述是显然的。


技术实现要素：

11.提供在包含nf-yc4基因的真核细胞中增加蛋白质含量的方法，所述基因包含启动 子，所述启动子包含转录抑制子结合位点。所述方法包括修饰转录抑制子结合位点，从 而转录抑制子无法阻碍nf-yc4转录。真核细胞的蛋白质含量增加；因此，该方法还可 以包括就蛋白质含量增加进行选择。所述方法还可以包括从真核细胞产生细胞集合、组 织、器官或生物体。真核细胞可以是细胞集合、组织、器官或生物体的部分。生物体可 以是植物，如农作物，如大豆、水稻、玉米等。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。 转录抑制子结合位点能通过缺失修饰。转录抑制子结合位点可以包含erf基序、rav 1 基序或erf基序和rav 1基序两者，基本由其组成，或由其组成。真核细胞可以是水 稻细胞和(i)缺失2个erf基序，(ii)缺失rav 1基序，或(iii)缺失rav 1基序和erf 基序。真核细胞可以是大豆细胞，(i)缺失2个rav 1基序或(ii)缺失rav 1基序和erf 基序。erf基序、rav 1基序或erf基序和rav 1基序两者能用talens或crispr/cas9 缺失。
12.还提供产生蛋白质含量增加的植物的方法。所述方法包括将根据上述方法所得植物 与第二植物杂交以产生后代植物和选择蛋白质含量增加的后代植物。该方法还能包括将 选定的后代植物与第二植物杂交以产生回交后代植物，选择蛋白质含量增加的第一回交 后代植物以产生选定的回交后代植物，重复3次或更多次杂交和选择以产生蛋白质含量 增加的回交后代植物。
13.还提供细胞、细胞集合、组织、器官或生物体，其中nf-yc4基因包含启动子，所 述启动子包含经修饰的转录抑制子结合位点，使得转录抑制子不能阻碍nf-yc4转录。 相较于对应的细胞、细胞集合、组织、器官或生物体(其中nf-yc4基因包含的启动子 包含未修饰的转录抑制子结合位点)，所述细胞、细胞集合、组织、器官或生物体的蛋 白质含量增加。在实施方案中，所述生物体可以是植物或其杂交种。还提供上述植物或 其杂交种的种子。在另一个实施方案中，所述生物体可以是非人动物，如牲畜，例如牛、 猪、鸡、火鸡、绵羊和美洲野牛。
14.还提供在包含nf-yc4基因的植物细胞或植物中提高对病原体或害虫抗性的方法， nf-yc4基因包含启动子，所述启动子包含经修饰的转录抑制子结合位点。所述方法包 括在有感染病原体或害虫风险的植物细胞或植物中修饰nf-yc4基因启动子的转录抑制 子结合
位点，从而转录抑制子不能阻碍nf-yc4基因转录。植物细胞或植物中对病原体 或害虫的抗性增加；因此，该方法还能包括就对病原体或害虫的抗性增加进行选择。所 述方法还能包括将包含编码qua-quine starch(qqs)多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入 植物或植物细胞并在其中表达，所述多肽具有seq id no:16所示的氨基酸序列，其中 所述核苷酸序列操作性连接启动子。该方法还能包括从植物细胞再生植物或其部分。转 录抑制子结合位点可以包括erf基序、rav 1基序或erf基序和rav 1基序两者。植 物细胞或植物可以是水稻细胞或水稻植物和(i)缺失2个erf基序，(ii)缺失rav l基 序，或(iii)缺失rav 1基序和erf基序。植物细胞或植物可以是大豆细胞或大豆植物， (i)缺失2个rav 1基序或(ii)缺失rav 1基序和erf基序。erf基序、rav 1基序或erf基序和rav 1基序两者能用talens或crispr/cas9缺失。病原体可以是细菌或 病毒。害虫可以是蚜虫。植物可以是农作物如大豆。植物可以是双子叶植物。
15.进一步提供产生对病原体或害虫抗性增加的植物的方法。所述方法包括将根据以上 所得植物与第二植物杂交以产生后代植物和选择对植物病原体或害虫抗性增加的后代 植物。该方法还能包括将选定的后代植物与第二植物杂交以产生回交后代植物，选择对 病原体或害虫抗性增加的第一回交后代植物以产生选定的回交后代植物，重复3次或更 多次杂交和选择以产生对病原体或害虫抗性增加的回交后代植物。
16.进一步提供对病原体或害虫抗性增加的植物。所述植物包括nf-yc4基因，该基因 包含启动子，所述启动子包含转录抑制子结合位点。修饰转录抑制子结合位点，从而转 录抑制子不能阻碍nf-yc4转录。在所述植物的一个实施方案中，其野生型不包含和表 达qqs，将包含编码qqs多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入并表达，所述多肽具有seqid no:16所示氨基酸序列。所述核苷酸序列操作性连接启动子。
17.还提供上述植物的种子，以及植物杂交种。还提供杂交种植物的种子。
18.附图简要说明
19.图1a是表达qqs的载体图。
20.图1b是表达来自拟南芥的nf-yc4的载体图。
21.图1c是表达来自大豆的nf-yc4的载体图。
22.图1d是表达来自水稻的nf-yc4的载体图。
23.图1e是表达来自玉米的nf-yc4的载体图。
24.图2a、2b、2c、2d、2e和2f如下显示与本公开相关的序列：
25.seq id no:1显示水稻(oryza sativa)nf-yc4基因的启动子区(os03g14669)，其中 rav 1基序(反向)以粗体显示，rav 1(反向)和erf(正向)基序以加下划线、粗体显示， erf(反向)基序以粗斜体显示。
26.seq id no:2显示水稻nf-yc4基因的启动子区，其中缺失rav 1(反向)基序 (tgttg，参见seq id no:1中的粗体)，其中rav1(反向)和erf(正向)基序以加下划 线、粗体显示，erf基序(反向)以粗斜体显示。
27.seq id no:3显示水稻nf-yc4基因的启动子区，其中缺失rav1(反向)基序和 erf(正向)基序的重叠序列(tgttgact；参见seq id no:1中的加下划线粗体)，其中 rav1基序(反向)以粗体显示，erf基序(反向)以粗斜体显示。
28.seq id no:4显示水稻nf-yc4基因的启动子区为，其中缺失111bp区段，含有 2个
erf基序(反向)
ꢀꢀ
参见seq id no:1中的2个粗斜体erf和介于中间的序列)，其中rav 1 基序(反向)以粗体显示，rav 1(反向)基序和erf(正向)基序以加下划线粗体显示。
29.seq id no:6显示水稻nf-yc4基因的启动子区，其中缺失190bp区段，含有2 个erf基序(反向)、rav 1(反向)和erf(正向)基序以及介于中间的序列
ꢀꢀ
参见seq idno:1中的2个粗斜体erf基序(反向)、加下划线粗体的rav1(反向)和erf(正向)基序 以及介于中间的序列)，其中rav 1基序(反向)以粗体显示。
30.seq id no:8显示大豆(glycine max)nf-yc4基因的启动子区(glyma06g17780)，其 中erf基序(反向)以粗斜体显示，rav1基序(反向)以粗体显示，rav1基序(正向)以加 下划线粗体显示。
31.seq id no:9显示大豆nf-yc4基因的启动子区，其中缺失erf基序(反向)、rav1 基序(正向)和介于中间的序列参见seqid no:8中的粗斜体和加下划线粗体)，其中erf基序(反向)以粗斜体显示且rav1基 序(反向)以粗体显示。
32.seq id no:11显示大豆nf-yc4基因的启动子区，其中缺失erf基序(反向)、rav1 基序(正向)和介于中间的序列基序(正向)和介于中间的序列参见seq id no:8中的粗斜 体和粗体)，其中erf基序(反向)以粗斜体显示，rav1基序(反向)以粗体显示，rav1 基序(正向)以加下划线粗体显示。
33.seq id no:13显示大豆nf-yc4基因的启动子区，其中缺失2个rav1基序和介 于中间的序列间的序列参见 seq id no:8中的粗体)，其中erf基序(反向)以粗斜体显示，rav1基序(反向)以粗体 显示，rav1基序(正向)以加下划线粗体显示。
34.seq id no:15显示拟南芥qua-quine starch(qqs)cdna的核苷酸序列。
35.seq id no:16显示拟南芥qqs蛋白的氨基酸序列。
36.seq id no:17显示大豆nf-yc4的核苷酸序列，在rav1-a基序与具有序列 ggtcagtttttgttaacattaatttttaggat的w盒基序之间。
37.seq id no:1 8显示正向引物gmnf-yc4fd:5'-cctcccaggcatggcagtcc-3'。
38.seq id no:19显示反向引物gmnf-yc4rev:5'-ccatcaaggctccgctgg-3'。
39.seq id no:20显示玉米(zea mays)nf-yc4基因的启动子区，其中2个rav1基序 (正向)以粗体显示。
40.图3是来自进化上不同的真核生物物种的nf-yc基因的系统树。
41.图4a是表达qqs的大豆优良(elite)品系和其各分离的姊妹株(sibling)对照的f3代 种子蛋白质(％/g鲜重，湿度13％)的柱状图。种子蛋白相较于各分离的姊妹株对照的百 分比增加示于突变体柱顶部。a＝没有来自qqs-e williams 82转化株的qqs基因的分离 的姊妹株；b＝qqs-e williams 82转化株；c＝没有qqs基因的分离的姊妹株对照，来自 ia优良品系或williams 82和qqs-e williams 82的杂交物；d＝qqs-e突变体，来自ia 优良品系和qqs-e williams 82的杂交物。学生t检验用于比较qqs-e和对照。**p《 0.01。
42.图4b是表达qqs的大豆优良品系和其各分离的姊妹株对照的f3代种子油(％/g鲜 重，湿度13％)的柱状图。a＝没有来自qqs-e williams 82转化株的qqs基因的分离的 姊妹株；b＝qqs-e williams 82转化株；c＝没有qqs基因的分离的姊妹株对照，来自ia 优良品系或williams 82和qqs-e williams 82的杂交物；d＝qqs-e突变体，来自ia优 良品系和qqs-e williams 82的杂交物。学生t检验用于比较qqs-e和对照。*p《0.05。
43.**p《0.01.
44.图4c是表达qqs的大豆优良品系和其各分离的姊妹株对照相比f3代种子纤维 (％/g鲜重，13％水分)的柱状图。a＝没有来自qqs-e williams 82转化株的qqs基因的 分离的姊妹株；b＝qqs-e williams 82转化株；c＝没有qqs基因的分离的姊妹株对照， 来自ia优良品系或williams 82和qqs-e williams 82的杂交物；d＝qqs-e突变体，来 自ia优良品系和qqs-e williams 82的杂交物。学生t检验用于比较qqs-e和对照。 *p《0.05。*p《0.01。
45.图5a是表达qqs(qqs-e)的水稻(栽培品种kitakke)和其野生型姊妹株(姊妹株)的 叶蛋白(％/干重)的柱状图。所有数据显示均值
±
se,n＝3。学生t检验用于比较qqs-e和 对照。**p《0.01.
46.图5b是表达qqs(qqs-e)的水稻(栽培品种kitakke)和其野生型姊妹株(姊妹株)的 种子蛋白(％/干重)的柱状图。所有数据显示均值
±
se,n＝3。学生t检验用于比较qqs-e 和对照。**p《0.01.
47.图6是捕获 诱饵(bk ad)的空载体、qqs-捕获 诱饵的空载体(bk qqs)、 atnf-yc4-诱饵 捕获的空载体(atnf-yc4 ad)、和atnf-yc4-诱饵 qqs-捕获 (atnf-yc4 qqs)加报告的基因相对表达的柱状图。*p《0.05.**p《0.01.
48.图7a是过表达nf-yc4的拟南芥(atnf-yc4-oe)和野生型拟南芥(wt)的叶淀粉 (mg/g鲜重)的柱状图。柱状图中的所有数据显示均值
±
se,n＝3。学生t检验用于比较 wt和atnf-yc4-oe品系的淀粉组成。*p《0.05.
49.图7b是过表达nf-yc4的拟南芥(atnf-yc4-oe)和野生型拟南芥(wt)的叶蛋白 (mg/g鲜重)的柱状图。柱状图中的所有数据显示均值
±
se,n＝3。学生t检验用于比较 wt和atnf-yc4-oe品系的蛋白组成。**p《0.01.
50.图8是来自烟草的luc(荧光素酶)活性的图，其中缺失大豆nf-yc4启动子区的转 录抑制子基序(psoy-luc del1、psoy-luc del2和psoy-luc del3)，该图是与对照 (psoy-lucfull)相比的相对luc活性的图。数据表示为均值
±
se,n＝3。学生t检验用于 比较带缺失启动子与全长启动子驱动的luc活性。*p《0.05.误差条指示标准误差。
51.图9是来自烟草的luc活性的图，其中缺失水稻nf-yc4启动子区的转录抑制子 基序(osnf-yc4pro1、os-nf-yc4pro2和os-nf-yc4pro3)，该图是与对照 (osnf-yc4profull)
突变体和姊妹株对照的油含量。
65.图15c是过表达拟南芥nf-yc4的转化玉米(atnf-yc4-oe)与姊妹株对照相比的籽 粒淀粉(每干重％)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体 和姊妹株对照的淀粉含量。**p《0.01.
66.图16a是过表达水稻nf-yc4的转化水稻(osnf-yc4-1-oe)与野生型相比的籽粒淀 粉(mg/g干重)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和 对照的籽粒淀粉含量。**p《0.01.
67.图16b是过表达水稻nf-yc4的转化水稻(osnf-yc4-1-oe)与野生型相比的种子蛋 白(mg/g干重)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和 对照的种子蛋白质含量。**p《0.01.
68.发明详述
69.本公开至少部分基于发现与qqs相互作用的基因。基因是称为nf-yc4的转录调 节子。所述基因在真核生物物种之间保守，在从拟南芥到主要作物品种如大豆、水稻和 玉米的不同植物物种中存在。拟南芥中的nf-yc4过表达模拟qqs过表达；蛋白质含 量增加且碳水化合物含量减少。因此，本公开提供操作基因如nf-yc尤其是nf-yc4(别 名包括但不限于mle2.10、mle2_10以及核因子y，亚基c)的材料和方法，该基因与 qqs相互作用(本文称为“相互作用因子基因”)。在实施方案中，基因操作引起蛋白质 含量增加和/或碳水化合物含量减少和/或对病原体或害虫的抗性增加。基因操作可能涉 及突变如缺失(或插入、取代、倒置等)包含转录抑制子结合基序的转录抑制子结合位点 (或多于一个位点/基序，只要存在超过一个，该情况中它们能以相同方式或不同方式突 变)。可操作转录抑制子结合位点，如通过突变，例如缺失其中存在的一个或多个转录 抑制子结合基序。“修饰(modification)”、“修饰(modify)”、“修饰(modifying)”和“修 饰(modified)”在本文可用于描述这类操作。
70.nf-yc是nf-y转录因子复合物的一部分。nf-y包括3个亚基，即nf-ya、nf-yb 和nf-yc。这三个亚基各包括进化上保守的区域。保守区位于nf-ya亚基c末端， nf-yc亚基n末端和位于nf-yb亚基中央。nf-ya和nf-yc亚基具有富含谷氨酰胺 的区，其包含活化结构域功能并显示一定程度的保守。nf-y显示包含2个转录活化域 ——一个在nf-ya亚基中而另一个在nf-yc亚基中。nf-yb和nf-yc亚基存在长度 约65个氨基酸的组蛋白折叠基序(hfm)。nf-yb和nf-yc亚基形成紧密二聚体，其随 后与nf-ya亚基关联。所得三聚体能结合dna。
71.植物转录因子包括称为ap2/erf的超家族。ap2/erf超家族由ap2/erf结构域定 义，其由约60-70个氨基酸组成并参与dna结合。所述超家族包括3个家族——ap2 家族、erf家族和rav家族。ap2家族的蛋白质包含2个重复的ap2/erf结构域，erf 家族的蛋白质包含单一ap2/erf结构域，rav家族的蛋白质包含单一ap2/erf结构域 和b3结构域，b3结构域是在其它植物特异转录因子中保守的dna结合结构域。额外 信息可获自植物转录因子数据库(plant tfdb)网站。
72.nf-yc4启动子区域发现的转录抑制子结合基序示例是与rav1结合的基序。rav1 基序序列是caaca。rav1作为单体结合二分靶标，该靶标由具有caaca的基序和 具有cacctg的基序组成。这2个基序可由2-8个核苷酸分开且可以彼此取向不同 (kagaya等,nucleic acids res.27:470-478(1999))。如上所示，rav1是含有单一ap2/erf 和b3结构域的转录因
鉴定。例如，基因能通过就与本文所鉴定nf-yc4基因有氨基酸序列相同性的保守结构 域搜索数据库。遗传密码的简并性允许高度可变的核苷酸序列能翻译成具有高度相似和 甚至相同氨基酸序列的蛋白。诸如megalign(dnastar,inc.,madison,wi)的程序能根 据不同方法如clustal分析(higgin等,gene 73:237-244(1988))在2种或更多序列之间进 行比对。其它比对算法和程序包括fasta、blast和entrez(ncbi；altschul等,j.mol. evol.36:290-300(1993)；altschul等,j.mol.biol.215:403-410(1990))。还参见gcg程序 (美国专利号6,262,333)和其它比对技术，描述于doolittle,methods in enzymology 266, "computer methods for macromolecular sequence analysis,"academic press,inc.,sandiego,ca(1996)。smith-waterman算法允许序列比对中的缺口，该算法能用maspar 电脑和mpsrch软件完成。gap程序使用needleman和wunsch比对法，也能用于比 对序列。另外或替代地，过表达或敲除2个或更多相关转录因子后的转录谱能进行比较。 手工方法还能用于鉴定具有相似性和保守结构域的区域且能涉及三级结构比较。一旦鉴 定，这种基因能根据本领域已知方法克隆。
78.其它nf-yc4基因也能通过在严谨或高度严谨条件下杂交来鉴定。严谨性在杂交和 洗涤溶液中受到多种因素影响，如温度、盐浓度和组成、有机和非有机添加剂、溶剂等 (参见例如sambrook等,同上；nucleic acid hybridization:a practical approach),hames和 higgins,eds,irl press,washington,dc(1985))。可使用杂交试验如southern印迹、 northern印迹、溶液杂交等(参见例如sambrook等,同上)。
79.关于本文所述序列，序列相同性百分比范围为约55％-100％。鉴于nf-yc4基因在 广泛范围的真核生物中高度保守，序列相同性百分比尤其是在氨基酸水平，范围为约 60％-100％，如约65％-100％,约70％-100％,约75％-100％,约80％-100％,约85％-100％, 约90％-100％,或约95％-100％,如约96％,约97％,约98％或约99％。
80.待操作或修饰的nf-yc4区是启动子区。更特定地，操作或修饰结合转录抑制子的 转录抑制子结合位点，如通过突变特别是缺失(或插入、取代、倒置等)操作或修饰，以 阻碍或抑制转录抑制子与结合位点结合，从而改变真核生物如植物的生化组成。具体地， 操作或修饰转录抑制子结合位点基序。例如，能改变存贮产物如蛋白、碳水化合物和脂 质的组成。更特别地，蛋白质含量能增加和/或碳水化合物含量能减少。
81.seq id no:1显示水稻nf-yc4基因启动子区(os03g14669)(参见图2a)。rav1基 序(反向)以粗体显示，而rav1(反向)和erf(正向)基序以加下划线、粗体显示，erf 基序(反向)以斜体加粗显示。
82.seq id no:2水稻nf-yc4基因的启动子区显示，其中缺失rav1(反向)基序 (tgttg，参见seq id no:1中的粗体)。rav1(反向)和erf(正向)基序以加下划线、 粗体显示，而erf基序(反向)以斜体加粗显示。
83.seq id no:3显示水稻nf-yc4基因的启动子区，其中缺失rav1(反向)基序和 erf(正向)基序的重叠序列(tgttgact；参见seq id no:1中的加下划线粗体)。rav1 基序(反向)以粗体显示，而erf基序(反向)以粗斜体显示。
84.seq id no:4显示水稻nf-yc4基因的启动子区，其中缺失111bp区段，包含2 个erf基序(反向)基序(反向)
参见seq id no:1中的2个粗斜体 erf和介于中间的序列)(参见图2b)。rav1基序(反向)以粗体显示，rav1(反向)和erf (正向)基序以加下划线粗体显示。
85.seq id no:6显示水稻nf-yc4基因的启动子区，其中缺失190bp区段，包含2 个erf基序(反向)、rav1(反向)和erf(正向)基序以及介于中间的序列序列参见seq idno:1中的2个粗斜体erf基序(反向)、加下划线粗体的rav1(反向)和erf(正向)基序 以及介于中间的序列)(参见图2c)。rav1基序(反向)以粗体显示。
86.在涉及水稻细胞或水稻植物的方法的实施方案中，(i)能缺失2个erf基序，(ii)能 缺失rav1基序，或(iii)能缺失rav1基序和erf基序。
87.seq id no:8显示大豆nf-yc4基因的启动子区(glyma06g17780)(参见图2c)。erf 基序(反向)以粗斜体显示，rav1基序(反向)以粗体显示，rav1基序(正向)以加下划线 粗体显示。
88.seq id no:9显示大豆nf-yc4基因的启动子区，其中缺失erf基序(反向)、rav1 基序(正向)和介于中间的序列参见seqid no:8中的粗斜体和加下划线粗体)(参见图2d)。erf基序(反向)以粗斜体显示且 rav1基序(反向)以粗体显示。
89.seq id no:11显示大豆nf-yc4基因的启动子区，其中缺失erf基序(反向)、rav1 基序(正向)和介于中间的序列基序(正向)和介于中间的序列参见seq id no:8中的粗斜 体和粗体)(参见图2d)。erf基序(反向)以粗斜体显示，rav1基序(反向)以粗体显示， rav1基序(正向)以加下划线粗体显示。
90.seq id no:13显示大豆nf-yc4基因的启动子区，其中缺失2个rav1基序和介 于中间的序列间的序列参见 seq id no:8中的粗体)(参见图2e)。erf基序(反向)以粗斜体显示，rav1基序(反向) 以粗体显示，rav1基序(正向)以加下划线粗体显示。
91.在涉及大豆细胞或大豆植物的方法的实施方案中，(i)能缺失2个rav1基序，或(ii) 能缺失rav1基序和erf基序。
92.seq id no:20显示玉米nf-yc4基因的启动子区。2个rav1基序(正向)以粗体显 示。在涉及玉米细胞或玉米植物的方法的实施方案中，rav1基序之一或两个都能缺失。
93.所述区域能通过本领域已知的任何合适方法修饰。例如，定点或位点特异性突变、 优化定向进化、基因位点饱和突变(gssm)、合成连接重装配(slr)、易错pcr、重排、 寡核苷酸定点突变、装配pcr、性pcr诱变、体内突变、盒突变、循环整体诱变、指 数整体诱变、基因重装配、slr重组、递归序列重组、硫代磷酸修饰的dna突变、含 尿嘧啶的模板突变、缺口双
重诱变(gapped duplex mutagenesis)、点错配修复诱变、修复 缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、 人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体产生或其它定标突变技术如基因组工程，用 大范围核酸酶、转座子、重组酶、化学dna切口以及可编程的核酸酶如锌指核酸酶 (zfn)、转录激活因子样效应因子核酸酶(talen)、rna引导的工程核酸酶(rgen)和 细菌ii型成簇的、规律间隔性短回文重复序列(crispr)-cas(crispr相关)适应性免疫 系统。采用以下的基因组工程能在培养的细胞、植物和动物中通过以位点特异性方式切 割染色体dna(激发内源dna修复系统，引起靶向基因组修饰)来进行靶向遗传修饰： zfn(氨基末端的锌指蛋白(zfp)和羧基末端的fok i或其它核酸酶结构域)、talen(氨基 末端的转录激活因子样效应因子(tale)和羧基末端的fok i或其它核酸酶结构域)、 rgen和crispr-cas系统。关于综述，参见kim等,nature reviews(genetics)15: 321-334(2014年5月)，其关于上述内容的教导在此通过引用纳入。还参见其中引用的 参考文献178-180(并通过引用纳入)用于工程核酸酶改善转基因作物的用途，其中引用 的参考文献32和168(并通过引用纳入)用于工程核酸酶使牲畜丰富某些营养物或使其抗 病的用途。
94.rgen和其它核酸酶的脱靶效应能最小化或避免。例如，选择在基因组他处缺乏高 度同源序列的独特靶位点，是重要的。这类位点能通过搜索鉴定，使用用于talen的 计算机算法。另外，基于网络的程序可用于talen和rgen，如下文所示。就rgen 而言优化核酸酶表达水平，也是重要的。使用在5'末端有2个额外鸟嘌呤的修饰引导 rna或截短sgrna可减少脱靶突变。使用质粒上的重组蛋白以引入可编程核酸酶，由 于重组蛋白在细胞中迅速降解而减少脱靶突变。最后，使单链断裂成dna的dna切 口酶(“切口酶”)能使脱靶突变最小化。
95.在一个实施方案中，使用talen(参见例如美国专利申请公开号2011/0201118，其 在此通过引用全文纳入，特别是第50页第14行到第58页第4行,第64页第2行到第 66页第29行,以及图1-3和10-16；还参见美国专利号8,586,363，其在此通过引用全文 纳入；还参见美国专利申请公开号2014/335618，其在此通过引用全文纳入；还参见美国 专利申请公开号2014/335592，其在此通过引用全文纳入；还参见美国专利申请号 2013/0122581和美国专利号8,697,853，两者都在此通过引用全文纳入；还参见美国专利 申请公开号2012/214228和美国专利号8,450,471，两者都在此通过引用全文纳入；还参 见美国专利申请公开号2012/178169和美国专利号8,440432，两者都在此通过引用全文 纳入；还参见美国专利申请公开号2012/178131和美国专利号8,440,431，两者都在此通 过引用全文纳入；还参见美国专利申请公开号2011/0301073和美国专利号8586526，两 者都在此通过引用全文纳入；美国专利申请公开号2014/087426，其在此通过引用全文 纳入；还参见美国专利申请公开号2014/0073015和美国专利号8,748,134，两者都在此 通过引用全文纳入)。由于talen能设计成靶向几乎任何给定dna序列，talen提供 相比其它核酸酶类型的关键优势，尽管建议选择在5'末端有胸腺嘧啶的靶序列，从而避 免有甲基化胞嘧啶的靶序列或用识别胸腺嘧并因而识别甲基化胞嘧啶的asn-gly rvd 重复序列取代识别胞嘧啶的his-asp rvd重复序列。tal效应因子可以是任何合适的 tal效应因子。例如，可使用天然出现的tal效应因子(即野生型tal效应因子或天然 出现的突变tal效应因子)或人造tal效应因子(如突变、天然出现的tal效应因子或 合成tal效应因子)。一个tal效应因子示例是avrxa7，来自黄单胞菌属(xanthomonasspp.)细菌或罗尔斯通菌属(ralstonia spp.)细菌(参见例如国际专利
申请公开号wo2013/101877，其在此通过引用全文纳入)。核酸内切酶切割两条dna链且允许在切割位 点修饰dna序列。构建体尺寸为～3kb x 2。靶位点的特异性长度是约30bp-约40bp。 靶位点理想上起始于胸腺嘧啶并终止于腺嘌呤。网上资源如e-talen、基因组工程资 源、预测tale(n)活性的评分算法、toolgen talen设计器和zifit targeter软件能用 于设计talen；还参见addgene and talen馆藏资源。talen可获自商业供应商，如 cellectis bioresearch、life technologies、toolgen和transposagen biopharmaceuticals。
96.因此，在实施方案中，本公开提供在含nf-yc4基因的真核细胞中增加蛋白质含量 的方法，nf-yc4基因包含启动子，所述启动子包含转录抑制子结合位点。所述方法包 括修饰nf-yc4基因的转录抑制子结合位点，从而转录抑制子不能阻碍nf-yc4转录。 所述方法包括向细胞引入第一转录激活因子样(tal)效应因子核酸内切酶单体和第二 tal效应因子核酸内切酶单体。所述单体能通过任何合适方法引入细胞，如用编码第一 或第二单体的核酸转染细胞和/或将第一或第二单体的蛋白质机械注入细胞。当作为蛋白 递送时，可使用细菌iii型分泌系统或电穿孔。各tal效应因子核酸内切酶单体包括核 酸内切酶结构域，如非特异核酸内切酶结构域例如fok i核酸内切酶结构域，和含多个 tal效应因子重复序列的tal效应因子结构域。第一tal效应因子核酸内切酶单体的 多个tal效应因子重复序列(如15个或更多dna结合重复序列，如dna结合重复序 列，各自包括重复可变双残基(rvd)，其确定nf-yc4启动子区的碱基对识别且负责识 别nf-yc4启动子区的碱基对)联合结合nf-yc4基因启动子区的第一特异核苷酸序列。 第二tal效应因子核酸内切酶单体的多个tal效应因子重复序列(如15个或更多dna 结合重复序列，如dna结合重复序列，各自包括rvd，其确定nf-yc4启动子区的碱 基对识别且负责识别nf-yc4启动子区的碱基对)联合结合nf-yc4基因启动子区的第 二特异核苷酸序列。第一特异核苷酸序列与第二特异核苷酸序列不同且由间隔子序列分 开，如长度约12-30个核苷酸例如18个核苷酸的间隔子序列。选择第一特异核苷酸序 列和第二特异核苷酸序列以实现修饰，如缺失nf-yc4基因启动子区的转录抑制子结合 位点。转录抑制子结合位点能包括erf基序或rav1基序；在此方面，2个或更多erf 基序，2个或更多rav1基序，或erf和rav1基序的组合能通过例如缺失来修饰。第 一tal效应因子核酸内切酶单体的核酸内切酶结构域和第二tal效应因子核酸内切酶 单体的核酸内切酶结构域形成二聚体，当第一tal效应因子核酸内切酶单体的tal效 应因子结构域结合第一特异核苷酸序列且第二tal效应因子核酸内切酶单体的tal效 应因子结构域结合第二特异核苷酸序列时，所述二聚体切割细胞或其后代内的靶dna 序列。所述方法还能包括向细胞提供核酸，所含序列与至少部分靶dna序列同源，从 而同源重组在靶dna序列与核酸之间发生。真核细胞的蛋白质含量增加，因而，该方 法还能包括就蛋白质含量增加进行选择。
97.真核细胞可以是细胞集合、组织、器官或生物体的一部分。涉及细胞或细胞集合或 其后代时，所述方法还可包括从中产生基因修饰的组织、器官或生物体。生物体可以是 植物，如农作物例如大豆、水稻或玉米，单子叶植物、双子叶植物、藻类如单细胞鞭毛 虫，例如衣藻物种。在实施方案中，所述生物体是大豆、水稻或玉米。植物能杂交和回 交，并根据本领域已知和本文所述方法就蛋白质含量增加进行选择。
98.在另一个实施方案中，本公开提供在含nf-yc4基因的植物细胞中提高对病原体或 害虫抗性的方法，nf-yc4基因包含启动子，所述启动子包含转录抑制子结合位点。所 述病
原体可以是细菌、病毒、真菌或种子植物且其中，所述害虫是昆虫、原质目 (plasmodiophorid)、螨或线虫，其所有示例为本领域已知并在本文描述。在实施方案中， 所述病原体是细菌或病毒，所述害虫是蚜虫。所述方法包括修饰nf-yc4基因的转录抑 制子结合位点，从而转录抑制子不能阻碍nf-yc4基因转录。所述方法包括向细胞引入 第一转录激活因子样(tal)效应因子核酸内切酶单体和第二tal效应因子核酸内切酶单 体。所述单体能通过任何合适方法引入细胞，如用编码第一或第二单体的核酸转染细胞 和/或将第一或第二单体的蛋白质机械注入细胞。当作为蛋白递送时，可使用细菌iii型 分泌系统或电穿孔。各tal效应因子核酸内切酶单体包括核酸内切酶结构域，如非特 异核酸内切酶结构域例如fok i核酸内切酶结构域，和含多个tal效应因子重复序列的 tal效应因子结构域。第一tal效应因子核酸内切酶单体的多个tal效应因子重复序 列(如15个或更多dna结合重复序列，如dna结合重复序列，各自包括重复可变双残 基(rvd)，其确定nf-yc4启动子区的碱基对识别且负责识别nf-yc4启动子区的碱基 对)联合结合nf-yc4基因启动子区的第一特异核苷酸序列。第二tal效应因子核酸内 切酶单体的多个tal效应因子重复序列(如15个或更多dna结合重复序列，如dna 结合重复序列，各自包括rvd，其确定nf-yc4启动子区的碱基对识别且负责识别 nf-yc4启动子区的碱基对)联合结合nf-yc4基因启动子区的第二特异核苷酸序列。第 一特异核苷酸序列与第二特异核苷酸序列不同且由间隔子序列分开，如长度约12-30个 核苷酸例如18个核苷酸的间隔子序列。选择第一特异核苷酸序列和第二特异核苷酸序 列以实现修饰，如缺失nf-yc4基因启动子区的转录抑制子结合位点。转录抑制子结合 位点能包括erf基序或rav1基序；在此方面，2个或更多erf基序，2个或更多rav1 基序，或erf和rav1基序的组合能通过例如缺失来修饰。第一tal效应因子核酸内 切酶单体的核酸内切酶结构域和第二tal效应因子核酸内切酶单体的核酸内切酶结构 域形成二聚体，当第一tal效应因子核酸内切酶单体的tal效应因子结构域结合第一 特异核苷酸序列且第二tal效应因子核酸内切酶单体的tal效应因子结构域结合第二 特异核苷酸序列时，所述二聚体切割细胞或其后代内的靶dna序列。所述方法还能包 括向植物细胞提供核酸，所含序列与至少部分靶dna序列同源，从而同源重组在靶dna 序列与核酸之间发生。植物细胞中对病原体或害虫的抗性增加，因而，该方法还能包括 就对病原体或害虫的抗性增加进行选择。
99.所述方法还能包括将含qua-quine starch(qqs)多肽编码核苷酸序列的多核苷酸引 入植物或植物细胞并在其中表达，所述多肽具有seq id no:16所示的氨基酸序列，其 中所述核苷酸序列操作性连接启动子。
100.植物细胞可以是细胞集合、组织、器官或生物体的一部分。涉及细胞或细胞集合或 其后代时，所述方法还可包括从中产生基因修饰的组织、器官或生物体。植物可以是农 作物如大豆、水稻或玉米，单子叶植物或双子叶植物。植物能杂交和回交，并根据本领 域已知和本文所述方法就病原体或害虫的抗性增加进行选择。
101.在另一个实施方案中，使用crispr-cas系统。靶标特异性crrna和靶标非依赖性 反式激活crrna (tracrrna)与crispr相关蛋白9(cas9)复合形成活性dna核酸内切 酶，即dualrna-cas9。该核酸内切酶切割23-bp靶dna序列，所述序列由crrna中 的20-bp引导序列和前间区序列邻近基序(pam；5'-ngg-3'或5'-nag-3')构成。可使用任 何合适的cas9，如来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9。由于 crispr-cas/rgen易于设计和制
其后代时，所述方法还可包括从中产生基因修饰的组织、器官或生物体。植物可以是农 作物如大豆、水稻或玉米，单子叶植物或双子叶植物。植物能杂交和回交，并根据本领 域已知和本文所述方法就病原体或害虫的抗性增加进行选择。
107.可编程的核酸酶和/或同源模板如靶向载体或单链寡脱氧核苷酸(ssodn)用本领域 已知的任何合适方法递送到靶细胞内。例如，这类方法包括递送质粒dna、体外转录 mrna、病毒载体或纯化蛋白到培养的细胞、胚胎或完整生物体。可编程的核酸酶经常 通过电穿孔或脂质体转染质粒dna来引入细胞系。体外转录的mrna通常微注射入单 细胞胚胎。非整合型病毒载体如整合酶缺陷的慢病毒载体(idlv)、腺病毒和腺相关病毒 (aav)能体外或体内使用，尽管idlv可能与talen不相容，这是由于存在高度同源的 tale重复序列，其能导致不需要的重组事件。使用蛋白避免了外来dna的不必要纳 入，排除了关于密码子优化和启动子选择的问题，就rgen而言方便，因为构建新核酸 酶不需要从头纯化cas9。
108.tal-切割结构域融合蛋白跨细胞膜转位能通过使用以下来促进：肽序列如触角足突 变第三螺旋(prochiantz,curr.opi.neurobiol.6:629-634(1996)；derossi等,j.biol.chem. 269:10444(1994))，或信号肽疏水结构域如信号肽k-fgf(lin等,j.biol.chem.270: 14255-14258(1995))。其它肽包括hiv的tat蛋白的11-氨基酸肽，这是对应p16蛋白氨 基酸84-103的20残基肽序列(fahracus et al.,curr.biol.6:84(1996))，来自hsv的vp22 转运结构域(elliot等,cell 88:223-233(1997))和二元毒素(arora等,j.biol.chem.268: 3334-3341(1993)；perelle等,infect.immun.61:5147-5156(1993)；stennark等,j.cell biol. 113:1025-1032(1991)；donnelly等,pnas usa 90:3530-3534(1993)；carbonetti等,abstr. ann.meet.am.soc.microbiol.95:295(1995)；sebo等,infect.immun.63:3851-3857 (1995)；klimpel等,pnas usa 89:10277-10281(1992)；和novak等,j.biol.chem.267: 17186-17193(1992))。肽序列能与tal-切割融合蛋白融合。任选地，能使用接头如肽接 头。
109.在有感染病原体或害虫风险的植物细胞或植物中提高对病原体或害虫抗性的方法 还能包括将含qua-quine starch(qqs)多肽(seq id no:16)编码核苷酸序列的多核苷酸 引入植物并在其中表达。所述核苷酸序列操作性连接启动子。因此，在一个实施方案中， 所述方法还包括(a)用含qqs多肽编码核苷酸序列的多核苷酸转化植物细胞，所述多肽 具有seq id no:16的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列操作性连接启动子，(b)从植物 细胞再生转基因植物，和(c)鉴定并选择来自转基因植物的转化植物，其显示相较缺乏 qqs并在类似条件下生长的同一物种未转化植物，对病原体或害虫的抗性增加。
110.qqs能用本领域已知的任何合适方式在植物中表达(参见例如2015年10月13日发 布的美国专利号9,157,091，其在此通过引用纳入，其教授内容涉及同一内容；参见例如 其中的实施例1和2以及详细描述，其部分在此段和后2段中重现以便于参考)。例如， qqs能作为转基因引入植物，使用电穿孔、基因枪、农杆菌介导的转化(如实施例1和 2以及美国专利号9,157,091所例示)和直接接触原生质体。转化/转染(以及用于向植物或 真菌引入dna的其它技术)和再生单子叶植物及双子叶植物是常规方式。所用具体方法 部分取决于待转化/转染的植物或真菌类型。例如，多种操作描述于agrobacteriumprotocols,第2版,卷1和2,methods in molecular biology,kan wang编，humana press, totowa,new jersey出版，其通过引用全文明确纳入本文。这类操作包括浸花法转化和 转化叶外植体、子叶外植
体和根外植体的方法，以及特定操作用于转化苜蓿(barrelclover)、烟草、大麦、玉米、水稻(籼稻和粳稻)、黑麦、高粱、小麦、加拿大油菜(canola)、 棉花、芥菜、向日葵、紫花苜蓿(alfalfa)、鹰嘴豆、三叶草、豌豆、花生、木豆、红三叶 草、大豆、宽叶菜豆、芋头、卷心菜、黄瓜、茄子、生菜、番茄、胡萝卜、木薯、土豆、 甘薯、山药、百慕大草、黑麦草、柳枝稷、高羊茅、草坪草、美洲榆、栓皮栎、桉树、 松树、杨树、橡胶树、香蕉、柑橘、咖啡、木瓜、菠萝、甘蔗、美洲栗、苹果、蓝莓、 葡萄、草莓、胡桃、康乃馨、菊花、兰花、矮牵牛花、玫瑰、人参、大麻、罂粟和蘑菇。 其它农杆菌介导转化谷物的方法描述于shrawat等,plant biotech.j.4(6):575-603(2006 年11月)，其明确地通过引用全文纳入本文。其它转化豆类的方法描述于somers等,plantphysiol.131(3):892-899(2003年3月)，其明确地通过引用全文纳入本文。用于转化水稻 的方法描述于giri等,biotech.adv.18(8):653-683(2000年12月)和hiei等,plant mol. biol.35(1-2):205-218(1997年9月)，两者都明确地通过引用全文纳入本文。vasil等, methods molec.biol.111:349-358(1999)和jones等,plant methods 1(1):5(2005年9月5 日)，两者都明确地通过引用全文纳入本文，描述用于转化小麦的方法。在大麦中使用 直接dna摄入描述于lazzeri,methods molec.biol.49:95-106(1996)，其明确地通过引 用全文纳入本文。在生物反应器系统中使用间歇浸没以转化草莓，描述于hanhineva等, bmc biotech.7:11(2007)，其明确地通过引用全文纳入本文。将转基因引入质体如叶绿 体特别是烟草中的叶绿体，描述于daniell等,trends biotech.23(5):238-245(2005年5 月)，其明确地通过引用全文纳入本文。在此方面，lutz等,plant physiol.145(4):1201-1210 (2007)(明确地通过引用全文纳入本文)提供在选择载体用于高等植物中转化质体基因组 方面的指导。物种特异叶绿体载体的体细胞胚胎发生也应用于植物，如大豆、胡萝卜和 棉花。用于转化的甜菜的其它方法描述于golovko等,tsitol.genet.39(3):30-36(2005年 5月-6月)，其明确地通过引用全文纳入本文。
111.编码qqs编码结构域序列(cds)的核苷酸序列能纳入载体或盒(本文统称为载体)以 在植物中表达。已描述适合转化植物细胞或建立转基因植物的多个表达载体(参见例如 weissbach等,methods for plant molecular biology,academic press,new york,ny(1989)； 和gelvin等,plant molecular biology manual,kluwer academic publishers,norwell,ma (1990))。来自根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)ti质粒或二元农杆菌载体(bevan, nucl.acids res.12:8711-8721(1984))能用于转化单子叶植物和双子叶植物。非ti载体 如病毒载体能用于转移dna到植物细胞、组织、胚胎和植物内。非ti载体能通过使用 以下来引入：脂质体介导的转化、聚乙二醇(peg)介导的转化、病毒转染、微注射、真 空渗入、植物原生质体电穿孔、基因枪、碳化硅晶须等。参见例如ammirato等,handbookof plant cell culture
–
crop species,macmillan pub.co.(1984)；shimamoto等,nature 338: 274-276(1989)；fromm等,bio/technology 8:833-839(1990)；和vasil等,biol.technology8:429-434(1990)。
112.除了编码序列，植物转化/转染载体包括一个或多个5'和3'转录调控序列。转录调控 序列能包括启动子、转录起始位点、转录终止位点、多腺苷酸化信号和3'终止子区(例 如土豆的pi-ii终止子区，章鱼碱合酶3'终止子区或胭脂碱合酶3'终止子区)。如果存在 常规的核加工的内含子，还能包括一个或多个rna加工信号如内含子剪接位点。可使 用任何合适的启动子。在此方面，能使用qqs启动子。或者，能使用非qqs启动子。 例如，启动子可以
是组成型、合成的(如杂合的)、诱导型、由发育调节、由环境调节、 激素调节、化学调节、细胞特异性或组织特异性(例如种子特异性)。组成型启动子包括 花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、胭脂碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子。例如， 由环境调节的诱导型启动子包括由光诱导的启动子。napin启动子、菜豆素启动子和dc3 启动子是种子特异性启动子的示例，而dru1启动子、2a11启动子和番茄聚半乳糖醛酸 酶启动子是果实特异性启动子的示例，pta29、pta26和pta13是花粉特异性启动子的 示例。pban启动子是拟南芥的种皮启动子，而p26、p63和p63tr是来自拟南芥的早期 种子启动子(参见例如美国专利申请公开号2009/0031450)。根特异性启动子的示例描述 于美国专利号5,618,988；5,837,848；和5,905,186。其它启动子由生长素、细胞分裂素、 赤霉素、茉莉酮酸甲酯、水杨酸、热、光等诱导。
113.实施方法采用本领域已知以及文献和本文所述的常规技术。参见例如sambrook等, molecular cloning:a laboratory manual,第2和第3版,cold spring harbor laboratorypress,cold spring harbor,ny(1989and 2001)；ausubel等,current protocols in molecularbiology,john wiley&sons,new york,ny(1987)；methods in enzymology,academicpress,inc.,san diego,ca,具体是卷34"chromatin"；chromatin structure and function, 第3版,academic press,inc.,san diego,ca(1998)；和methods in molecular biology, humana press,totowa,new jersey,具体是卷119,"chromatin protocols"。
114.对于用于引入dna构建体到宿主植物基因组的常规技术，参见例如weissbach& weissbach,methods for plant molecular biology,,章节viii,第421-463页,academicpress,new york,ny(1988)和grierson&corey,plant molecular biology,第2版,blackie, london,uk(1988)。例如，dna构建体可直接引入植物细胞基因组dna，使用技术如 电穿孔和微注射植物细胞原生质体，或dna构建体可直接引入植物组织，使用基因枪 法如dna粒子轰击(参见例如klein等,nature 327:70-73(1987))。或者，dna构建体可 联合适当的t-dna侧翼区并引入常规根癌农杆菌宿主载体。根癌农杆菌介导的转化技 术包括解毒(disarming)和使用二元载体，如文献所述(参见例如horsch等,science 233: 4967-498(1984)和fraley等,pnas usa 80:4803(1983))。当用二元t dna载体(bevan, nucleic acid research 12:8711-8721(1984))或共培养程序(horsch等,science 227: 1229-1231(1985))用细菌感染细胞时，根癌农杆菌宿主的毒性作用会指导构建体和相邻 标记物插入植物细胞dna。一般，农杆菌转化系统用于加工双子叶植物(bevan等,ann. rev.genet.16:357-384(1982)；rogers等,methods enzymol.118:627-641(1986))。农杆菌 转化系统还可用于转化单子叶植物(hernalsteen等,embo j.3:3039-3041(1984)； hooykass-van slogteren等,nature 311:763-764(1984)；grimsley等,nature 325: 1677-1679(1987)；boulton等,plant mol.biol.12:31-40(1989)；和gould等,plant physiol. 95:426-434(1991))。
115.替代的基因转移和转化方法包括但不限于：原生质体转化，通过钙介导、聚乙二醇 (peg)介导或电穿孔介导的裸dna摄入(paszkowski等,embo j 3:2717-2722(1984)； potrykus等,molec.gen.genet.199:169-177(1985)；fromm等,pnas usa 82:5824-5828 (1985)；和shimamoto,nature 338:274-276(1989))和电穿孔植物组织(d'halluin等,
plantcell 4:1495-1505(1992))。用于植物细胞转化的额外方法包括微注射、碳化硅介导的裸 dna摄入(kaeppler等,plant cell reporter 9:415-418(1990))和基因枪(klein等.pnasusa 85:4305-4309(1988)；和gordon-kamm等,plant cell 2:603-618(1990))。
116.转化的细胞(或细胞集合、愈伤组织、组织、器官或生物体，例如植物)能如下鉴定 和分离：就具体特征选择或筛选细胞，如表达标记基因、增加蛋白质含量或提高对病原 体或害虫的抗性。这种筛选和选择方法为本领域熟知。另外，物理和生化方法能用于鉴 定转化子。这些包括southern印迹、pcr扩增、northern印迹、s1 rnase保护、引物 延伸、rt-pcr、酶学测定、蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫测定、 原位杂交、酶染色和免疫染色。
117.能培养转化的细胞如转化的植物细胞以再生完整植物，其具备转化基因型和因而的 所需表型。这种再生技术依赖在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，一般依赖杀 生物剂和/或除草剂标记，其与所需核苷酸序列共同引入(参见例如evans等,"protoplastsisolation and culture,"收录于handbook of plant cell culture,第124-176页,macmillanpublishing.co.,new york,ny(1983)；binding,regeneration of plants,plant protoplasts, 第21-73页,crc press,boca raton,fl(1985)；和klee等,ann.rev.plant phys.38: 467-486(1987))。
118.有经操作或修饰启动子的nf-yc4(理想上是蛋白生产或对病原体或害虫的抗性增 加)能分离并转入另一真核细胞，如另一植物，其可以是同一物种，同一属但不同物种， 或来自不同科或其它系统发生水平。有经操作或修饰转录抑制子结合位点的nf-yc4能 引入另一真核细胞，如另一植物，采用标准育种技术和回交。例如，具有启动子经操作 或修饰的nf-yc4的植物能与缺乏带经操作或修饰启动子的nf-yc4的植物杂交，所得 的世代可以进行杂交，并且可选择显示蛋白生产增加或对病原体或害虫抗性增加的植 物。因此，当具有启动子经操作或修饰的nf-yc4的植物与不具有启动子经修饰的 nf-yc4或具有不同的启动子经操作或修饰的基因的植物杂交时，能收获杂交种种子并 种植以获得杂交种植物或其部分。具有启动子经操作或修饰的nf-yc4且适合组织培养 的植物可以是用于组织培养和再生植物的细胞来源，采用本领域已知的组织培养方法。 类似育种技术能用于非人动物。
119.真核细胞可以是细胞集合、组织、器官或生物体的一部分。在一个实施方案中，所 述生物体可以是植物，如农作物、根农作物或园艺作物。农作物示例包括大豆、水稻、 玉米、小麦、小米、大麦、紫花苜蓿、番茄、苹果、梨、草莓、橙、西瓜、胡椒、胡萝 卜、土豆、甜莱、山药、生菜、菠菜、向日葵和油菜籽、开花植物如矮牵牛、玫瑰和菊 花、针叶树和松树(如松树、冷杉和云杉)、用于植物修复的植物(如累积重金属的植物) 以及用于实验目的的植物(如拟南芥)。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。单子叶植 物示例包括但不限于油棕、甘蔗、香蕉、苏丹草、玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、水 稻、小米和高粱。双子叶植物示例包括但不限于红花、紫花苜蓿、大豆、咖啡、苋菜、 油菜(rapeseed)、花生和向日葵。双子叶植物的目包括木兰目、八角目、樟目、胡椒目、 马兜铃目、睡莲目、毛茛目、罂粟目、瓶子草科、昆栏树目、金缕梅目、杜仲目、塞子 木目、杨梅目、壳斗目、木麻黄目、石竹目、肉穗果目、蓼目、蓝雪目、五桠果目、山 茶目、锦葵目、荨麻目、玉蕊目、堇菜目、杨柳目、白花菜目、杜鹃花目、岩梅目、柿 树目、报春花目、蔷薇目、豆目、川草目、小二仙草目、桃金娘目、山茱萸目、山龙眼 目、檀香目、大花草目、卫矛目、大戟目、鼠李目、无患子目、胡桃目、牻牛儿苗目、 远志目、伞
形目、龙胆目、花葱目、唇形目、车前草目、玄参目、桔梗目、茜草目、川 续断目以及菊目。双子叶植物的属包括颠茄属、油丹属、槚如树属、落花生属、琼楠属、 芸苔属、红花属、木防己属、巴豆属、黄瓜属、柑橘属、西瓜属、辣椒属、长春花属、 椰子属、咖啡属、南瓜属、胡萝卜属、杜氏木属、花菱草属、无花果属、草莓属、galucium、 大豆属、棉属、向日葵属、橡胶树属、莨菪属、莴苣属、卷枝藤属、亚麻属、木姜子属、 番茄属、羽扇豆属、木薯属、墨角纶属、苹果属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、银胶菊 属、罂粟属、鳄梨属、菜豆属、黄连木属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、千 里光属、防己属、千金藤属、白芥属、茄属、可可属、三叶草属、胡芦巴属、蚕豆属、 长春花属、vilis和豇豆属。单子叶植物的目包括泽泻目、水鳘目、茨藻目、霉草目、鸭 跖草目、谷精草目、绳草目、禾本目、灯心草目、莎草目、香蒲目、凤梨目、姜目、椋 榈目、巴拿马草目、露兜树目、天南星目、百合目和兰目。单子叶植物的属包括葱属、 须芒草属、aragrostis、天门冬属、燕麦属、狗牙根属、油棕属、羊茅属、羊茅黑麦草属、 萱草属(heterocallis)、大麦属、浮萍属、毒麦属、芭蕉属、稻属、黍属、pannesetum、 梯牧草属、早熟禾属、黑麦属、高粱属、小麦属和玉米属。其它植物包括裸子植物，如 松目、银杏目、苏铁目和麻黄目，如冷杉属、杉木属、云杉属、松属和黄杉属，如冷杉 和松。在另一个实施方案中，所述生物体可以是藻类如单细胞鞭毛虫，例如衣藻物种。 在另一个实施方案中，所述生物体可以是非人动物，如牲畜，例如牛、猪、鸡、火鸡、 绵羊和美洲野牛。
120.所述病原体可以是细菌、病毒或种子植物。所述害虫是昆虫(如蚜虫)、原质目、螨 或线虫。在实施方案中，所述病原体是细菌或病毒，所述害虫是蚜虫。
121.所述细菌可以是任何植物细菌。示例包括但不限于厚壁菌、放线菌或变形细菌。变 形细菌可以是α变形菌、β变形菌或γ变形菌。α变形菌可以是农杆菌、鞘氨醇单胞菌 或韧皮部杆菌(candidatus liberibacter)。β变形菌可以是食酸菌、伯克霍尔德菌、罗尔斯 通菌或xylophilus。γ变形菌可以是肠杆菌科、假单胞菌科或黄单胞菌科。肠杆菌科可 以是brenneria、dickeya、肠杆菌、欧文氏菌、爱文菌、泛菌、果胶杆菌、candidatusphlomobacter、samsonia或沙雷氏菌。假单胞菌科可以是假单胞菌。黄单胞菌科可以是 黄杆菌或木杆菌。细菌可以是棒形杆菌、短小杆菌、拉氏杆菌、赖氏菌、诺卡氏菌、红 球菌、链霉菌、芽孢杆菌、梭菌、螺原体、暂定植原体(candidatus phytoplasma)或细杆 菌。细菌的具体示例包括但不限于密执安棍状杆菌(clavibacter michiganensis)或其亚种、 萎蔫短小杆菌(curtobacterium flaccumfaciens)、拉氏杆菌(rathayibacter rathayi)、小麦拉 氏杆菌(rathayibacter tritici)、有毒拉氏杆菌(rathayibacter toxicus)、赖氏菌木质部 (leifsonia xyli)或其亚种、带化红球菌(rhodococcus fascians)、鞘氨醇单胞菌 (sphingomonas suberifaciens)、瓜类鞘氨醇单胞菌(sphingomonas melonis)、葡萄土壤杆菌 (agrobacterium vitis)、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)、悬钩子土壤杆菌 (agrobacterium rubi)、莫氏土壤杆菌(acrobacterium larrymoorei)、燕麦食酸菌(acidovoraxavenae)、西瓜细菌性果斑病菌(a.avenae citrulli)、燕麦嗜酸菌燕麦亚种(a.avenaeavenae)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(burkholderiagladioli)、须芒草伯克霍尔德氏菌(burkholderia andropogonis)、石竹伯克霍尔德氏菌 (burkholderia caryophylli)、荚壳伯克霍尔德氏菌(burkholderia glumae)、植物伯克霍尔德 氏菌(burkholderia plantarii)、dickeya dadantii、马铃薯黑胫病菌(dickeya solani)、解淀粉 欧文氏菌(erwinia amylovora)、青枯雷尔氏菌
(ralstonia solanacearum)、蒲桃雷尔氏菌 (ralstonia syzygii)、韧皮杆菌(candidatus phlomobacter fragariae)、柑橘黄龙病菌亚洲种 (candidatus liberibacter asiaticus)、胡萝卜软腐病果胶杆菌(pectobacteriumcarotovorum)、黑腐果胶杆菌(pectobacterium atrosepticum)、丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)、萨氏假单胞菌(pseudomonas savastanoi)、边缘假单胞菌(pseudomonasmarginalis)、绿黄假单胞菌(pseudomonas viridiflava)、树生黄单胞菌(xanthomonasarboricola)、地毯草黄单胞菌(xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)、天竺葵黄单胞菌(xanthomonas hortorum)、水稻黄单胞菌(xanthomonasoryzae)、地毯草黄单胞菌(xanthomonas axonopodis)、半透明黄单胞菌(xanthomonastranslucens)、黄单胞菌(xanthomonas vasicola)或叶缘焦枯病菌(xylella fastidiosa)。根据 mansfield等(mol.plant pathol.13:614-629(2012))，顶级细菌植物病原体是丁香假单胞 菌致病变种(pseudomonas syringae pathovars)、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、白叶枯病菌 (xanthomonas oryze pv.oryze)、野油菜黄单胞菌致病变种(xanthomonas campestrispathovars)、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(xanthomonas axonopodis pv.manihotis)、解淀 粉欧文氏菌、叶缘焦枯病菌、dickeya dadantii、马铃薯黑胫病菌、胡萝卜软腐病果胶杆 菌和黑腐果胶杆菌。
122.所述真菌可以是植物真菌。示例包括但不限于子囊菌(ascomycetes)如镰刀菌 (fusarium spp.)(镰刀菌枯萎病的病原)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、尖孢镰刀 菌(fusarium oxysporum)，根串珠霉(thielaviopsis spp.)(溃疡、黑根腐病和蚕豆根腐病的 病原)，轮枝菌(verticillium spp.)，稻瘟病菌(magnaporthe grisea)(稻瘟病和草坪草中灰色 叶斑病的病原)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)，核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)(白霉) 和白粉菌(powdery mildews)。其它示例包括担子菌(basidiomycetes)如黑粉菌(ustilagospp.)、玉米黑粉菌(ustilago maydis)、丝核菌(rhizoctonia spp.)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)，葛锈病菌(phakospora pachyrhizi)(大豆锈病的病原)，柄锈菌(puccinia spp.)(几乎 所有谷物和栽培牧草严重生锈的病原)和蜜环菌(armillaria spp.)(("蜜环菌"种；树和生产 合格蘑菇的剧毒病原体)。根据dean等.(mol.plant pathol.13:414-430(2012))，前10个 植物真菌病原体是稻瘟病菌、灰葡萄孢(botrytis cinerea)、柄锈菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰 刀菌、小麦白粉病菌blumeria graminis)、禾生球腔菌(mycosphaerella graminicola)、炭 疽菌(colletotrichum spp.)、玉米黑粉菌和亚麻锈菌(melampsora lini)。根据kamoun等 (mol.plant pathol.16:413-434(2015))，前10个卵菌是致病疫霉(phytophthorainfestans)(晚疫病)、活体营养型卵菌(hyaloperonospora arabidopsidis)(霜霉病)、栎树猝死 病菌(phytophthora ramorum)(栎树猝死病和橡树猝死病)、大豆疫霉菌(phytophthorasojae)(根茎腐病)、辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)(枯萎病、疫腐病和其它)、霜霉病 菌(plasmopara viticola)(霜霉病)、樟疫霉(phytophthora cinnamomi)(根腐病和顶梢枯死)、 寄生疫霉(phytophthora parsitica)(根茎腐病和其它)、终极腐霉(pythium ultimum)(立枯病 和根腐病)和白菜白锈病菌(albugo candida)(白锈病)。
123.所述种子植物可以是菟丝子、槲寄生或独脚金。这类植物半寄生或寄生于其它植物。
分析qqs基因的存在，如上所述(li等(2015),同上)。
140.大豆qqs-e williams 82用作花粉供体以与iowa大豆优良品系(ia1022、ia2079、 ia2102、ia2053和ia3022)在实地试验中杂交(williams 82用作对照)。f1代在盆中温室 下生长，3株植物/盆，环境控制为16小时光和8小时暗，27/20℃。f2代种植于ames， ia的田地。qqs-e突变体基于以下鉴定：bar选择，然后是pcr分析qqs基因的存 在。不耐受除草剂且不表达qqs的分离的野生型(wt)植物用作姊妹株对照。
141.水稻植物在生长箱中生长，环境控制为16小时光和8小时暗，28/25℃。分析t3 代植物。类似地，植物通过除草剂和pcr分析测试以鉴定转化子和wt姊妹株对照。
142.玉米植物在ames，ia的田地中生长。植物与b104回交。类似地，植物通过除草 剂和pcr分析测试以鉴定转化子和wt姊妹株对照。
143.如上所述，拟南芥经转化、生长并收获。参见li等(2009),同上。
144.实施例2
145.此实施例描述植物组成的分析。
146.测定叶的组成(淀粉染色和定量以及蛋白)，在拟南芥中，在生长箱中种植后20天 (dap)的苗(seedling shoot)中测定，以及在水稻中，在来自30dap的植物一次枝的倒叶 (挨着旗叶)中测定。每次重复3(用于淀粉)或5(用于蛋白)株植物，分析来自各独立t2 品系(拟南芥)和t3品系(水稻)的3次重复。在光阶段结束时收获叶。单株收获拟南芥、 水稻和大豆的种子。对于叶和种子蛋白定量，植物材料在71℃烘烤。干叶/种子组织(0.07 g)用于各测定。测量总蛋白质含量。总氮量用leco chn-2000((leco,st.joseph,mi) 测定并转化成蛋白质含量(li等(2015),同上)。
147.拟南芥的整个地上部分用i2/ki染色，收集水稻一次枝倒叶(挨着旗叶)的中间部分并 切成小片(约1-1.5cm)。
148.通过近红外光谱(nirs)分析大豆和玉米种子(大豆的蛋白、油和纤维；玉米的蛋白、 油和淀粉)，使用bruins谷物分析仪s/n 106110(德国慕尼黑)。测试约60g种子/植物， 各品系3次生物重复。
149.实施例3
150.此实施例描述酵母双杂交试验。
151.matchmaker system 3(clontech,mountain view,ca)用于鉴定qqs相互作用蛋白， 采用拟南芥(哥伦比亚型)cdna文库，用3日龄黄化幼苗构建 (arabidopsis.org/servlets/tairobject？type＝library&id＝23)。对于交互酵母双杂交试验，将 qqs和atnf-yc4分别克隆到pgbkt7(诱饵载体)和pgadt7(捕获载体)。
152.实施例4
153.此实施例描述双分子荧光互补(bifc)试验。
154.qqs和atnf-yc4分别框内融合nyfp n末端(黄色荧光蛋白(yfp)n末端)和cyfp (yfp c末端)。转化有qqs-nyfp和atnf-yc4-cyfp构建体的农杆菌株gv3101共渗 透到烟草内。重建的yfp信号在渗透后48小时于zeiss axioplan ii荧光显微镜下观察到。
155.实施例5
156.此实施例描述his-mbp-标签重组nf-y的纯化。
157.含atnf-yc4基因(或其它nf-y基因或基因片段)的大肠杆菌(e.coli)转化子在
0.6lluria-bertani(lb)培养基中37℃生长，直至od
600 0.90，然后加入异丙基-β-d-硫代半乳 糖苷(iptg)至终浓度0.075mm。12℃孵育20小时后，经诱导的细胞通过5,000x g离 心5分钟来收获。his-mbp-标签(即6x组氨酸麦芽糖结合蛋白-标签)蛋白用ni琼脂糖 凝胶6fast flow(ge healthcare life sciences,pittsburgh,pa)亲和色谱在4℃天然条件下 纯化。细胞团重悬于15ml结合缓冲液(50mm nah2po4,ph 8.0,500mm nacl和30mm 咪唑)。细胞通过间歇式超声波处理来裂解。10,000x g离心20分钟后，向澄清的裂解 物加入树脂。4℃振荡30分钟后，将裂解物-树脂混合物加样到柱中。用洗涤缓冲液(50 mm nah2po4,ph 8.0,500mm nacl和60mm咪唑)冲洗树脂。用洗脱缓冲液(50mmnah2po4,ph 8.0,500mm nacl和250mm咪唑)从柱中洗脱结合蛋白。洗脱的蛋白用 pbs缓冲液(140mm nacl,2.7mm kcl,10mm na2hpo4和1.8mm kh2po4,ph 7.3)透析 2次。蛋白浓度通过bca蛋白测定试剂盒(thermo scientific,st.louis,mo)检测，牛血 清白蛋白(bsa)用作标准物。
158.实施例6
159.此实施例描述gst-标记的qqs的表达和纯化。
160.表达qqs基因的大肠杆菌转化子在1.2l的luria-bertani(lb)培养基中37℃生长， 直至od
600 0.90，然后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度0.075mm。2℃ 孵育20小时后，经诱导的细胞通过5,000x g离心5分钟来收获。gst-标签(即谷胱甘肽
ꢀ‑
s-转移酶-标签)qqs的纯化用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4b(ge healthcare life sciences)亲 和色谱在4℃天然条件下纯化。细胞团重悬于15ml pbs缓冲液(140mm nacl,2.7mmkcl,10mm na2hpo4和1.8mm kh2po4,ph 7.3)，细胞通过间歇式超声波处理来裂解。 10,000x g离心20分钟后，向澄清的裂解物加入树脂。4℃振荡30分钟后，将裂解物
‑ꢀ
树脂混合物加样到柱中。树脂用pbs洗涤。用洗脱缓冲液(50mm tris-hcl,10mm还原 型谷胱甘肽,5mm dtt,ph 8.0)从柱中洗脱结合蛋白。洗脱的蛋白用pbs缓冲液透析2 次。蛋白浓度通过bca蛋白测定试剂盒(thermo scientific)检测，bsa用作标准物。
161.实施例7
162.此实施例描述拉下实验。
163.纯化的his-mbp-标签蛋白(5μg)在1ml pbs缓冲液中与珠固定的gst-qqs融合蛋 白(10μg)混合，pbs缓冲液含有1％np-40,1mm dtt和0.5μg/μl bsa。混合物在4℃ 孵育2小时。珠上固定的gst蛋白用于与his-mbp-标签蛋白孵育，作为负对照。珠通 过离心回收，用1ml pbs缓冲液洗6次，重悬于50μl sds-样品缓冲液。15μl所得样 品如下分析：在12％凝胶上进行sds-page，然后免疫沉淀并用针对mbp的抗血清分 析。
164.实施例8
165.此实施例描述统计设计和分析。
166.植物在随机完全区组设计或完全随机设计中生长、收集和分析。定性和定量分析用 来自各独立转基因系和各对照的最少3个生物测定进行。对于组成分析，植物样品被赋 予随机数字并提供给分析设备用于按随机顺序测定，没有基因型标识。
167.数据表示为均值
±
se。2组独立样品用学生t检验(双尾)比较，假设等方差(n＝3)。p《0.05被视作显著(*)；p《0.01被视作极显著(**)。
168.实施例9
169.此实施例描述系统发生的推论。
随机完全区组设计的生长箱中生长。来自3次独立转化事件的t3植物的叶和成熟t4 种子进行一式三份分析。表达qqs基因(qqs-e)的水稻植物的独立转基因品系和其种子 在视觉和发育上与其各野生型(wt)姊妹株对照类似。然而，3个独立转基因品系中的 qqs基因表达使表达qqs基因(qqs-e)的叶和其野生型姊妹株(姊妹株)中的淀粉含量减 少并增加叶的蛋白质含量(参见图5a，这是表达qqs(qqs-e)的水稻(栽培品种kitakke) 和其野生型姊妹株(姊妹株)的叶蛋白(％/干重)的柱状图；所有数据显示均值
±
se,n＝3。 学生t检验用于比较qqs-e和对照。**p《0.01)。跨3个转基因品系的成熟水稻种子的 平均蛋白增加是20％(参见图5b，这是表达qqs(qqs-e)的水稻(栽培品种kitakke)和其 野生型姊妹株(姊妹株)的种子蛋白(％/干重)的柱状图；所有数据显示均值
±
se,n＝3。学 生t检验用于比较qqs-e和对照。**p《0.01.)。
180.还将qqs转基因引入田间生长的玉米。相较于姊妹株对照，表达qqs的玉米中的 籽粒蛋白质(％/干重)从约10％增加到约20％(参见li等,pnas usa 112(47): 14734-14739(2015)，其在此通过引用纳入)。
181.实施例12
182.此实施例描述使用qqs作为诱饵针对拟南芥幼苗的cdna文库酵母双杂交筛选， 以鉴定与qqs相互作用的基因。
183.酵母双杂交筛选使用qqs作为诱饵针对拟南芥幼苗的cdna库，鉴定了拟南芥核 因子yc4(atnf-yc4)作为与qqs相互作用的基因。交互酵母双杂交试验与qqs和 atnf-yc4相互作用一致；诱饵上的atnf-yc4具有自动信号，qqs-捕获 atnf-yc4
‑ꢀ
诱饵的信号高于atnf-yc4-诱饵。qqs与atnf-yc4之间的相互作用进一步通过酵母 双杂交成对交互研究确认(图6)。图6是捕获 诱饵的空载体(bk ad)、qqs-捕获 诱饵 的空载体(bk qqs)、atnf-yc4-诱饵 捕获的空载体(atnf-yc4 ad)、和atnf-yc4
‑ꢀ
诱饵 qqs-捕获(atnf-yc4 qqs)加报告基因相对表达的柱状图。*p《0.05.**p《 0.01.统计分析指示atnf-yc4-诱饵 qqs-捕获表达高于atnf-yc4-诱饵(*p《0.05)。 烟草叶的双分子荧光互补试验指示，qqs和atnf-yc4与细胞溶质和核相互作用；在没 有qqs和atnf-yc4相互作用的情况下，未检测到yfp信号。
184.实施例13
185.此实施例描述谷胱甘肽-s-转移酶(gst)拉下实验，使用纯化的重组atnf-yc4-gst 融合蛋白以鉴定qqs结合所需的atnf-yc4区域。
186.表达含不同atnf-yc4区域(即全长、氨基酸1-72、氨基酸73-162、氨基酸163-250、 氨基酸1-162和氨基酸73-250)的融合gst的蛋白。融合蛋白用于拉下实验。分析表明， qqs结合atnf-yc4的氨基酸73-氨基酸162区域中的氨基酸。此区域对应组蛋白折叠 样结构域的位置。烟草叶的双分子荧光互补试验指示，qqs和nf-yc4与细胞溶质和核 相互作用。位于核的相互作用用作正对照。gst拉下实验也显示qqs与大豆和水稻 nf-yc4同源物的相互作用。
187.实施例14
188.此实施例描述gst拉下实验，使用纯化的重组拟南芥核因子yb7(atnf-yb7)-gst 融合蛋白以鉴定qqs一般是否结合组蛋白折叠样结构域蛋白。
189.atnf-yb7包含组蛋白折叠样结构域且预测与atnf-yc4复合(hackenberg等,mol. plant 5:876-888(2012))。然而，atnf-yb7在gst拉下实验中不结合qqs，表明qqs 结合带组
蛋白折叠样结构域的蛋白，其具有某些特有的特征。
190.实施例15
191.此实施例描述qqs和atnf-yc4在烟草叶中的体内共表达。
192.qqs和atnf-yc4在烟草叶中体内共表达。qqs-nf-yc4复合体在细胞溶质和核 中检测到。这些数据(就载体图参见图1a和1b)表明，主要在细胞溶质的qqs(li等(2009), 同上)和nf-yc(kahle等,molec.cell.biol.25:5339-5354(2005))于细胞溶质中结合并移 入核，类似细胞溶质中的nf-yb结合nf-yc和nf-yb
–
nf-yc复合体移入核的模型。
193.实施例16
194.此实施例描述qqs与水稻和大豆蛋白的相互作用，所述蛋白具有类似atnf-yc4 氨基酸73-162的氨基酸序列。
195.氨基酸序列类似atnf-yc4氨基酸73-162的水稻和大豆蛋白通过在来自10个不同 真核物种基因组的蛋白编码基因中系统发育分析所有nf-y组蛋白折叠样结构域来选择 (图3是nf-yc基因的系统树，来自进化上不同的真核生物物种，其显示对水稻、大豆 和拟南芥的分析)。qqs与大豆(glyma06g17780和glyma04g37291)和水稻(os3g14669、 os2g07450和os6g45640)同源物的物理相互作用通过gst拉下实验检测。qqs与所有 同源物相互作用。这些发现与qqs表达经nf-yc4相互作用赋予大豆和水稻高蛋白表 型一致。
196.实施例17
197.此实施例描述atnf-yc4和osnf-yc4在拟南芥中的过表达。
198.atnf-yc4(at＝拟南芥)转基因在拟南芥中过表达。分析来自3次独立转化事件的 20日龄t2植物幼苗。atnf-yc4过表达使叶的淀粉含量减少约16％(参见图7a，这是 过表达nf-yc4的拟南芥(atnf-yc4-oe)和野生型拟南芥(wt)的叶淀粉(mg/g鲜重)的柱 状图；柱状图中的所有数据显示均值
±
se,n＝3；学生t检验用于比较wt和 atnf-yc4-oe品系的淀粉组成；*p《0.05.)和使叶的蛋白质含量增加约17％(参见图7b， 这是过表达nf-yc4的拟南芥(atnf-yc4-oe)和野生型拟南芥(wt)的叶蛋白(mg/g鲜重) 的柱状图；柱状图中的所有数据显示均值
±
se,n＝3；学生t检验用于比较wt和 atnf-yc4-oe品系的蛋白组成。**p《0.01.)。
199.这些数据表明qqs与atnf-yc4联合作用以改变氮和碳的分配。认为qqs结合 nf-yc4，所得复合体移至核并改变基因转录，所述基因被nf-yc4-相关nf-y复合体 抑制和活化。这些表达变化引起蛋白质含量增加和淀粉含量减少。
200.osnf-yc4(os＝水稻；os3g14669)转基因也在拟南芥中过表达。来自稻的nf-yc4 cds被插入载体pb2gw7，所述载体包含bar基因(草丁膦乙酰转移酶基因)，在来自烟 草的胭脂碱合酶的pnos(nos启动子)和tnos(nos终止子)控制下。此载体上的osnf-yc4 受p35s(花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子)控制并由t35s终止(camv 35s)。仅将lb 与rb之间的区域引入拟南芥植物以产生转基因拟南芥osnf-yc4-oe植物(参见图1d， 这是载体图)。osnf-yc4过表达使叶的淀粉含量相较于野生型拟南芥减少～16％。分 析蛋白质含量。
201.实施例18
202.此实施例描述在nf-yc4基因启动子区中靶向移出鉴定的抑制子基序。
203.在nf-yc4基因启动子区鉴定rav1结合基序特别是rav1-a。rav1-a基序具有 序列caaca(关于rav1讨论，参见例如kagaya等,nucleic acids res.27:470-478 (1999))。还在nf-yc4基因启动子区鉴定“w盒”基序(关于erf3基因启动子区的w 盒讨论，参见例如
nishiuchi等,j.biol.chem.279:55355-55361(2004))。w盒基序具有 序列tgacy，其中y＝c或t。在植物顺式作用调控dna元件(place)数据库中鉴定 这类基序：1999(nucleic acids res.27(1):297-300(1999))；这类基序用signal scan (prestridge,cabios 7:203-206(1991)；可获自 www.dna.affrc.go.jp/place/signalscan.html)鉴定。基序还用plantcare (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)发现。大豆和水稻nf-yc4基因启动 子区的抑制子基序缺失。关于大豆，特定缺失rav1-a基序与w盒基序之间的区域(即 核苷酸360-391，具有序列ggtcagtttttgttaacattaatttttaggat[seq id no: 17]；参见图2e)。关于水稻，特定缺失rav1-a基序(即核苷酸250-254，具有序列 caaca)。有突变启动子的构建体和有全长启动子的构建体分别与作为报告基因的荧光 素酶融合。二元载体上的各构建体分别转化入农杆菌gv3101，然后转化入本氏烟草 (nicotiana benthamiana)(leuzinger等,vis.exp.77(2013))。使用本氏烟草的推荐发育阶 段和农杆菌生长及渗透浓度。瞬时表达重组荧光素酶蛋白。在经农杆菌渗透的烟草叶中 定量荧光素酶表达。每构建体纳入3株植物中的至少3次重复。从大豆nf-yc4基因移 出抑制子基序引起2/3重复中的荧光素酶表达增加。类似地，从水稻nf-yc4基因移出 抑制子基序引起2/3重复中的荧光素酶表达增加。总体上，就来自大豆的nf-yc4基因 和来自水稻的nf-yc4基因基因而言，所有3次重复的总荧光素酶表达增加。
[0204]
在分开的实验中，产生osnf-yc4启动子区的3个单独突变以移出转录抑制子基序。
ꢀ“
pro1”突变中，1164bp上游处的“rav1”基序缺失(参见seq id no:2和图2a)。
ꢀ“
pro2”突变中，982bp上游处的“rav1”基序和979bp上游处的“ii类erf”基序 缺失(参见seq id no:3和图2b)。rav1基序和介于中间的序列在“pro3”突变中缺失 (参见seq id no:4和图2b)。对照“profull”包含全长启动子区，即起始密码子上游 1,448bp(参见seq id no:1和图2a)。启动子区与荧光素酶编码区融合，转化入农杆 菌，然后转化入烟草，如上所述。结果示于图9。
[0205]
图9是来自烟草的luc活性的图，其中缺失水稻nf-yc4启动子区的转录抑制子 基序(osnf-yc4pro1、os-nf-yc4pro2和os-nf-yc4pro3)，该图是与对照 (osnf-yc4profull)相比的相对荧光素酶(luc)活性的图。数据表示为均值
±
se,n＝3。学 生t检验用于比较带缺失启动子与全长启动子驱动的luc活性。*p《0.05.误差条指示 标准误差。
[0206]
如所示，当移出启动子区的转录抑制子基序时，nf-yc4表达上调。缺失2个erf 基序产生的效果大于缺失1个rav1基序或1个rav1基序和1个erf基序的联合缺 失。
[0207]
在另一个实验中，产生gmnf-yc4启动子区的3个单独突变以移出转录抑制子基 序。“pro1”突变中，缺失erf基序(反向)、rav1基序(正向)和介于中间的序列(参见 seq id no:9和图2d)。“pro2”突变中，缺失erf基序(反向)、rav1基序(反向)和介 于中间的序列(参见seq id no:11和图2d)，而“pro3”突变中缺失2个rav1基序和 介于中间的序列(参见seq id no:13和图2e)。对照“profull”包含全长启动子区，即 起始密码子上游1,448bp(参见seq id no:8和图2c)。启动子区与荧光素酶编码区融合， 转化入农杆菌，然后转化入烟草，如上所述。结果示于图8。
[0208]
图8是来自烟草的luc(荧光素酶)活性的图，其中缺失大豆nf-yc4启动子区的转 录抑制子基序(psoy-luc del1、psoy-luc del2和psoy-luc del3)，该图是与对照 (psoy-lucfull)相比的相对luc活性的图。数据表示为均值
±
se,n＝3。学生t检验用于 比较带缺失启动子与全长启动子驱动的luc活性。*p《0.05.误差条指示标准误差。如 所示，当移出启
动子区的转录抑制子基序时，nf-yc4表达上调。缺失2个rav1基序 产生的效果大于1个rav1基序和1个erf基序的联合缺失。
[0209]
在另一个实验中，水稻t0植物(kitaake)用crispr/cas9构建体转化，该构建体靶 向引入osnf-yc4启动子区的突变。使用grna/cas9技术包括用于水稻中靶向基因编 辑的多个步骤。选择osnf-yc4的靶序列(参见seq id no:6和7)，设计并构建表达荧 光素酶的质粒(即cas9和grna)，胚性愈伤组织经农杆菌介导的基因转移来转化，就位 点特异性dna变化筛选原代转基因系并加以鉴定，pcr基因分型用于鉴定有缺失序列 的突变体。鉴定了大于19个有杂合突变的突变植物(t0)。t0植物自交以获得带纯合突 变的后代和分离出t-dna。收获t1种子。选择带纯合突变和没有t-dna插入的突变 体。
[0210]
实施例19
[0211]
此实施例描述筛选nf-yc4基因启动子区以鉴定可能含转录抑制子结合位点的区 域。
[0212]
kitakke叶的基因组dna用作pcr模板以产生突变的osnf-yc4启动子构建体。 nf-yc4基因启动子区(起始密码子上游1kb区)通过依序缺失100bp区段来突变，从
ꢀ‑
1000bp位开始(起始密码子上游)。通过双接头pcr构建突变nf-yc4启动子，其在启 动子中间部分缺失100-bp(即-900bp to-100bp位)(yu等,fungal genet.biol.41:973-981 (2004))。
[0213]
带突变启动子的构建体和带全长启动子的构建体分别与作为报告基因的荧光素酶 融合。二元载体上的各构建体分别转化入农杆菌gv3101，然后转化入本氏烟草 (leuzinger等(2013),同上)。使用本氏烟草的推荐发育阶段和农杆菌生长及渗透浓度。 瞬时表达重组荧光素酶蛋白。在经农杆菌渗透的烟草叶中定量荧光素酶表达以鉴定哪个 缺失引起表达相较全长启动子增加。建议表达增加的启动子包含转录抑制子结合位点。 每构建体纳入3株植物中的至少3次重复。
[0214]
实施例20
[0215]
此实施例描述qqs过表达和表达不足对参与植物防御的基因表达的影响。
[0216]
总rna提取自收集的叶样品，使用trizol(life technologies,carlsbad,ca)。rna 进一步用qiagen rneasy迷你试剂盒(qiagen,valencia,ca)纯化，采用dnase i(lifetechnologies,carlsbad,ca)处理以去除dna污染。
[0217]
构建200-bp短插入文库。转录组测序通过illumina hiseq2000系统用v3试剂(91 空气末端测序)进行。低质量读数如下过滤：移出带连接物的读数，有大于5％未知核苷 酸的读数以及大于20％碱基的质量≤10的读数。经净化的读数在phytozome 8.0版 (phytozome.net)中与参照拟南芥基因组对齐，使用tophat。绘图的读数通过htseq-count (huber.embl.de/users/anders/htseq/doc/count.html)计数。
[0218]
分析来自qqs rnai(下调qqs)、qqs oe(过表达qqs)和野生型col-0拟南芥植 物的rna-seq数据显示，植物防御相关的标记基因相对野生型拟南芥具有扰动的转录 物水平，如表1所示。
[0219]
表1.
[0220][0221][0222]
所述模式能分成3组。第一组包括在2个突变体中表达都减少的一个基因即 wrky47，其由细菌感染高度活化且参与诱导基础防御(truman等,plant j.46(1):14-33 (2006))。第二组包括在2个突变体中表达都增加的四个基因。这四个基因是jmt、myc2、 pap1和rab2-6，jmt是茉莉酮酸(ja)-调节的植物反应的关键代谢酶(seo等,pnas usa98(8):4788-4793(2001))，myc2是ja响应性转录因子，调节茉莉酮酸与乙烯(et)信号 传递之间的拮抗作用(chico等,plant cell 26(5):1967-1980(2014)；song等,plant cell26(1):263-279(2014)；和zhang等,plant cell 26(3):1105-1117(2014))，pap1是ja响应 性转录因子，激活花青素生物合成，依赖于ja激活col1(shan等,j.exp.bot.60(13): 3849-3860(2009))，rab2-6是et响应性转录因子，激发植物的胼胝质沉积(ali等,bmcplant biol.13:47(2013))。第三组包括在qqs下调的突变体中表达减少和qqs过表达 的突变体中表达增加的三个基因。这三个基因是wrky38、npr1调节蛋白和pr1病程 相关蛋白1，wrky38是npr依赖性基础防御负调节物，调节sa引发的免疫(caillaud 等,plos biol.11(12):e1001732(2013)；kim等,plant cell 20(9):2357-2371(2008)；pre等, plant physiol.147(3):1347-1357(2008)；和seo等(2001),同上)。
[0223]
实施例21
[0224]
此实施例证明过表达nf-yc4或qqs的转基因拟南芥植物中的病毒感染减少。
[0225]
携带绿色荧光蛋白的芜菁花叶病毒(tumv-gfp)接种试验如上所述进行(yang等, molecular plant-microbe interactions 20(4):358-370(2007))，有一些小的修改。冷冻的 tumv-gfp-感染的芜菁(前7个)叶在20mm磷酸钠缓冲液(ph 7.2,1:6wt/vol)中研磨，经 miracloth(calbiochem,san diego,ca)过滤以获得接种体。接种体效价调至产生良好分离 的gfp基因座。
[0226]
拟南芥植物在10小时光下22℃生长7周以允许大莲座叶发育。莲座叶用碳化硅 抹
去灰尘并用棉花棒涂料器摩擦接种tumv-gfp。接种后120小时(hai)，所接种莲座叶 上的gfp基因座在uv辐照((100-w blak-ray长波uv灯；uvp,upland,ca)下计数。 各品系具有10个随机选择植物的3次生物重复。计算各品系10株植物的平均病灶数， 品系之间病灶数差异的显著性用学生t检验测定(p《0.01或0.05)。
[0227]
对于各基因型，随机选择40个单一gfp病灶并在zeiss stemi sv11荧光解剖显微 镜上使用zeiss axiocam mrc5数码相机拍照(hewezi等,plant cell 20(11):3080-3093 (2008))。数字文件随后用zeiss axiovision软件处理。各拍照的gfp病灶用imagej测量 工具(nih)处理，针对来自stemi sv11初始图像的正确缩放来校准。gfp病灶的总面积 计算为平方毫米。各品系gfp病灶的单独测量用于计算所测各品系的平均病灶尺寸。 品系之间尺寸差异的显著性用学生t检验测定(p《0.01或0.05)。
[0228]
tumv-gfp在拟南芥植物上接种，所述植物有不同qqs和nf-yc4遗传背景。计 数gfp病灶(数字指示tumv起始感染过程的能力)，在接种后5天测量gfp病灶尺寸(尺 寸指示tumv在植物繁殖的能力)。qqs表达改变和qqs相互作用物nf-yc4表达改变 的拟南芥col-0系用于所有感染试验。所用品系是col-0(很少毛状体，转化株的对照) 用于atqqs rnai(qqs-下调)、atqqs oe(qqs-过表达)和atnf-yc4 oe(nf-yc4-过 表达)，以及col-0(毛状体，t-dna敲除(ko)突变体的对照)用于atqqs ko和atnf-yc4 ko。
[0229]
如图10a(突变体vs.对照的图，用于每10株拟南芥植物的平均病灶数(
±
病毒接种后 120小时(hai)的标准误差)；学生t检验用于比较对照和qqs或nf-yc4突变体的病灶数； *p《0.05.**p《0.01.***p《0.001.)和10b(突变体vs.对照的图，用于平均病灶尺寸 (mm2)(
±
病毒接种后在120hai处的标准误差(n＝40))；学生t检验用于比较对照和qqs 或nf-yc4突变体的病灶数。***p《0.001.)所示，atnf-yc4 oe植物具有显著降低的 gfp病灶数，比对照少约88％。相反，atnf-yc4 ko植物具有略增加的病灶数，比对 照多约16.5％；尽管小，但学生t检验表明差异显著。类似地，atqqs oe植物相较对 照植物具有21.7％更少的病灶，而atqqs rnai植物具有比对照植物多12.2％的病灶， atqqs ko植物具有比对照多45.9％的病灶。这些结果显示过表达atqqs或atnf-yc4 削弱病毒感染起始，而沉默或敲除atqqs或atnf-yc4促进病毒感染起始。yc4过表 达几乎阻断病毒感染。
[0230]
病灶数变化具有类似趋势。atnf-yc4 ko、atqqs ko和atqqs-沉默植物中的病 灶分别比对照大27.8％、52.5％和51.9％，而atnf-yc4 oe和atqqs oe植物中的病灶 分别比对照小51％和32％。
[0231]
这些结果显示过表达atnf-yc4或atqqs削弱病毒繁殖，而沉默或敲除atnf-yc4 或atqqs促进病毒繁殖。试验指示qqs和其相互作用物nf-yc4减少植物的感染起始 和降低病毒繁殖。因此，其是植物免疫应答的正调节物，因为各自的过表达提高植物对 病毒的抗性。
[0232]
实施例22
[0233]
此实施例证明过表达nf-yc4或qqs的转基因拟南芥植物中的细菌生长减少。
[0234]
拟南芥植物在10小时光和14小时暗下22℃生长4-5周。洗涤丁香假单胞菌 (pseudomonas syringae)并重悬于接种缓冲液(10mm mgcl2,0.05％silwet l-77)。植物用 细菌接种体喷涂，细菌水平调至108菌落形成单位(cfu)/ml(katagiri等,thearabidopsis thaliana
–
pseudomonas syringae interaction.the arabidopsis book/americansociety of plant biologists,1,e0039.http://doi.org/10.1199/tab.0039(2002))。植
物的细菌水 平如下测定：用软木钻孔机切割叶盘(内径0.5cm)并在500μl接种缓冲液中完全匀化它 们。含细菌的所得悬液进行稀释并接种于有合适抗生素的kb板。
[0235]
检测实施例21所列同一组拟南芥植物中pst dc3000和δcel株的植物细菌生长。 pst dc3000是稳健感染拟南芥植物的细菌病原体，而δcel是在植物生长缓慢的无毒 株，这是在多个效应基因中有突变的突变的pst dc3000株。pst dc3000在4天中生长 约1,000倍，而δcel生长约10倍。pst dc3000生长在过表达atnf-yc4或atqqs的 植物中大幅受损，分别减少88％和63％。相反，在atqqs或atnf-yc4 rnai和ko品 系中，pst dc3000生长增加约30％。pst dc3000生长增加在atqqs rnai植物中相当 显著，而atqqs或atnf-yc4 ko品系在p＝0.05水平不显著。
[0236]
另一方面，很显然δcel在atqqs或atnf-yc4 rnai和ko品系中的生长大幅提 高约2.6倍。δcel生长变化在atqqs或atnf-yc4过表达植物中不类似显著。总体上， 关于2种细菌株在遗传背景不同的拟南芥植物中生长改变的数据表明，过表达 atnf-yc4或atqqs可提高植物免疫应答，使得稳健感染的细菌病原体毒性较弱且生长 缓慢，而沉默或敲除atnf-yc4或atqqs削弱植物免疫应答，使得无毒细菌病原体生 长更佳。因此，这些数据表明atnf-yc4和atqqs是植物免疫应答的正调节物。
[0237]
结果概括于图11。图11是pst dc3000和δ cel接种拟南芥植物后第0天(0dpi) 和第4天(4dpi)的细菌数(log
10
(cfu/cm2))的图。初始接种体统一调至108cfu/ml。误 差条指示标准误差。学生t检验用于比较对照和qqs或nf-yc4突变体的细菌数。**p 《0.01.***p《0.001.
[0238]
实施例23
[0239]
此实施例证明过表达nf-yc4或表达qqs的转基因大豆植物中的细菌生长减少。
[0240]
将来自大豆的nf-yc4 cds(gmnf-yc4)插入载体pb2gw7，所述载体包含bar基 因(草丁膦乙酰转移酶基因)，在来自烟草的胭脂碱合酶的pnos(nos启动子)和tnos(nos 终止子)控制下(参见图1c，这是载体图)。此载体上的gmnf-yc4受p35s(花椰菜花叶 病毒(camv)35s启动子)控制并由t35s终止(camv 35s)。仅将lb与rb之间的区域引 入植物以产生转基因植物。
[0241]
产生表达atqqs(atqqs；参见实施例1和图1a的载体图,qqs-oe-pb2gw7)或过 表达gmnf-yc4(glyma06g17780；gmnf-yc4 oe)的稳定转基因大豆品系，并在生长箱 中于14小时光和10小时暗下22℃生长。qqs e、gmnf-yc4-oe的大豆突变植物和 空载体对照通过叶dna的pcr筛选来选择。23日龄大豆上的第一个三叶用于接种。 新鲜培养的萨氏假单胞菌大豆致病变种4号生理小种(p.savastanoi pv.glycinea race 4) (psgr4)悬于接种缓冲液(参见实施例22)至终浓度约107cfu/ml。各三叶状叶片的小叶 在5μl接种体置于各伤口(10个/小叶)前由针刺伤。植物的细菌水平在接种后10天测定， 如上所述。
[0242]
psg导致大豆上的细菌疫病，这被视作对大豆生产的极大威胁。psgr4是最强毒株 之一，因为其能感染几乎所有商业大豆栽培品种。使用携带空载体的大豆品系作为对照， psgr4在大豆gmnf-yc4 oe品系和大豆atqqs-e品系中生长慢很多，分别减少62.4％ 和55.3％。psgr4在过表达gmnf-yc4或表达atqqs的大豆品系中的细菌生长削弱， 指示gmnf-yc4和atqqs也提高大豆免疫应答，这与上面关于nf-yc4和qqs是植 物免疫应答正调节物的数据一致。
[0243]
结果概括于图12a。图12a是就细菌数(cfu*104/cm2)而言的大豆品系的图。初始 接种体统一调至107cfu/ml。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较对照和qqs 或nf-yc4突变体的细菌数。**p《0.01.(ev＝空载体)。
[0244]
为确认gmnf-yc4在转基因大豆品系中过表达，gmnf-yc4的表达水平用定量实 时pcr测定。约100mg大豆叶用于rna分离，根据厂商说明采用rneasy植物迷你试 剂盒(qiagen)。2μg rna和iii第一链试剂盒(invitrogen)用于cdna合成。 定量实时pcr(qrt-pcr)用cdna和基因特异引物(gmnf-yc4fd: 5'-cctcccaggcatggcagtcc-3'[seq id no:18]和gmnf-yc4rev: 5'-ccatcaaggctccgctgg-3'[seq id no:19])进行。各cdna通过定量pcr扩增， 采用iq
tm
green supermix(bio-rad)和icycler实时pcr系统(伯乐)。gmactin 表达用于使各样品的表达值标准化，相对表达值针对模拟样品用比较ct法(2-δδct
)确定。
[0245]
gmactin(glyma 15g050200)用作参照基因(liu等,mol.plant microbe interact. 27(8):824-834(2014))。gmnf-yc4在gmnf-yc4 oe品系中的表达水平比大豆对照品 系中的表达高4.47倍。
[0246]
结果概括于图12b。图12b是就相对表达水平而言的nf-yc4-oe大豆品系的图。 误差条指示标准误差。**p《0.01.(ev＝空载体)。
[0247]
实施例24
[0248]
此实施例证明过表达nf-yc4或表达qqs的转基因大豆植物中的蚜虫减少。
[0249]
转基因大豆植物如实施例23所述产生。大豆种子在25℃种植，光周期是16小时 光和8小时暗。植物在种植后18天感染害虫。感染后7天，测定每株植物的蚜虫平均 数。结果示于图13。
[0250]
图13显示大豆基因型qqs-e 16-6(qqs表达品系16-6)、qqs-e 32-6(qqs表达品 系32-6)、对照、nf-yc4-oe l1(nf-yc4过表达品系1)和nf-yc4-oe l2(nf-yc4过 表达品系2)相比每株植物平均蚜虫数。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较对照 和qqs或nf-yc4-oe突变体的蚜虫数。*p《0.05.**p《0.01.(ev＝空载体)如所示， 每株植物的平均蚜虫数在表达qqs或过表达nf-yc4的大豆植物中相较对照减少约 20％-约30％。
[0251]
实施例25
[0252]
此实施例证明过表达nf-yc4的转基因大豆植物种子中的蛋白或蛋白 油含量增 加。
[0253]
过表达nf-yc4的转基因大豆植物(williams 82)如实施例23所述产生并在田地中生 长。t2种子用nirs分析，如实施例2所述。数据示于图14a-14e。
[0254]
图14a是过表达nf-yc4的转化大豆(nf-yc4-oe)转化事件(1、2、3和4；各数字 指示不同的转化事件)与姊妹株对照相比的蛋白质含量的图。误差条指示标准误差。学 生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和姊妹株对照的蛋白质含量。*p《0.05.**p《 0.01.如所示，过表达nf-yc4的大豆植物中的蛋白相较于对照增加约6％-约12％。
[0255]
图14b是过表达nf-yc4的转化大豆(nf-yc4-oe)转化事件(1、2、3和4；各数字 指示不同的转化事件)与姊妹株对照相比的油含量的图。误差条指示标准误差。学生t 检验用于比较nf-yc4-oe突变体和姊妹株对照的油含量。*p《0.05.如所示，过表达 nf-yc4的大豆植物中的油与对照类似或减少。
[0256]
图14c是过表达nf-yc4的转化大豆(nf-yc4-oe)转化事件(1、2、3和4；各数字 指示不同的转化事件)与姊妹株对照相比的蛋白 油含量的图。误差条指示标准误差。学 生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和姊妹株对照的蛋白 油含量。*p《0.05.**p 《0.01.如所示，过表达nf-yc4的大豆植物中的蛋白 油含量相较于对照增加约5％-约 7％。
[0257]
图14d是过表达nf-yc4的转化大豆(nf-yc4-oe)转化事件(1、2、3和4；各数字 指示不同的转化事件)与姊妹株对照相比的种子纤维(％/g鲜重，湿度13％)的图。误差条 指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和姊妹株对照的纤维含量。**p 《0.01.如所示，过表达nf-yc4的大豆植物中的种子纤维相较于对照减少约3.4％-约 5.6％。
[0258]
图14e是过表达nf-yc4的转化的大豆(nf-yc4-oe)转化事件(1、2、3和4；各数 字指示不同的转化事件)与姊妹株对照相比的每植物种子重量(g/植物)的图。误差条指示 标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和姊妹株对照的每植物种子重量。 如所示，过表达nf-yc4的大豆植物中的每植物种子重量与对照类似。
[0259]
实施例26
[0260]
此实施例证明过表达nf-yc4的转基因玉米植物种子中的蛋白质含量增加。
[0261]
产生过表达nf-yc4的转基因玉米植物并在田地中生长。来自实施例1的构建体通 过农杆菌介导的转化引入玉米。回交2(bc2；b104背景回交b104)种子用nirs分析， 如实施例2所示。数据示于图15a-15c。
[0262]
图15a是过表达拟南芥nf-yc4的转化玉米(atnf-yc4-oe)与姊妹株对照相比的籽 粒蛋白质(每干重％)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变 体和姊妹株对照的的蛋白质含量。**p《0.01.如所示，籽粒蛋白质相较对照增加约 17％。
[0263]
图15b是过表达拟南芥nf-yc4的转化玉米(atnf-yc4-oe)与姊妹株对照相比的 籽粒油(每干重％)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体 和姊妹株对照的油含量。如所示，核油与对照类似。
[0264]
图15c是过表达拟南芥nf-yc4的转化玉米(atnf-yc4-oe)与姊妹株对照相比的 籽粒淀粉(每干重％)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变 体和姊妹株对照的淀粉含量。**p《0.01.如所示，核淀粉相较对照减少约2.2％。
[0265]
实施例27
[0266]
此实施例证明过表达nf-yc4的转基因水稻植物种子中的蛋白质含量增加。
[0267]
产生过表达nf-yc4的转基因水稻植物并在田地中生长。来自实施例17的构建体 (pb2gw7-osnf-yc4)通过农杆菌介导的转化引入水稻。数据示于图16a和16b。
[0268]
图16a是过表达水稻nf-yc4的转化水稻(osnf-yc4-1-oe)与野生型相比的籽粒淀 粉(mg/g干重)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和 对照的籽粒淀粉含量。**p《0.01.如所示，籽粒淀粉减少约6％。
[0269]
图16b是过表达水稻nf-yc4的转化水稻(osnf-yc4-1-oe)与野生型相比的种子蛋 白(mg/g干重)的图。误差条指示标准误差。学生t检验用于比较nf-yc4-oe突变体和 对照的种子蛋白质含量。**p《0.01.如所示，种子蛋白增加约37％。
[0270]
本说明书提及的所有专利、专利申请公开、期刊论文、教材和其它出版物指示本公 开所涉及领域的技术人员的水平。所有这些出版物以相同程度通过引用纳入本文，就好 像各单独出版物通过引用特定和单独表示纳入。
[0271]
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[0272]
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