一种生物发酵生产长链二元酸的方法与流程

1.本发明涉及一种生产长链二元酸的方法，特别是涉及一种生物发酵生产长链二元酸的方法。


背景技术：

2.长链二元酸(long chain dicarboxy acids)是指碳链中含有9个及以上碳原子的脂肪族二元酸(简称dcn)，包括饱和以及不饱和二元酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能工程塑料、高温电介质、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级油漆和涂料等的重要原料。
3.一般而言，长链二元酸可以用化学合成法或生物发酵法生产得到。化学合成方法合成路线长，反应条件严格，需要在高温高压条件下进行，并且对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上，以化学法合成的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。生物发酵法以长链烷烃为底物，通过微生物发酵转化得到长链二元酸；其生产过程在常温、常压条件下进行，并且可以规模化生产如从c9到c18等多种长链二元酸。因此，长链二元酸的生物发酵法生产相较于化学合成法而言，其优势是不言而喻的。
4.目前，针对生物发酵法生产长链二元酸已经有一定的研究基础。但普遍存在发酵周期长(长达180-190小时)，产酸率低，转化率较低等问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中生物法生产长链二元酸的工艺生产发酵周期长，产酸率和转化率较低等问题，本发明提供一种生物发酵生产长链二元酸的新方法。
6.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，其采用热带假丝酵母或维斯假丝酵母作为发酵微生物，包括下述步骤：
7.1)采用两级种子罐对微生物进行培养，其中一级种子罐培养后菌体生长密度(od620)大于0.5；
8.2)二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵，发酵期间初始风量控制在2200-2800m3/h，控制溶氧在40％-50％，在发酵过程中随着时间推移不断调节ph值，从ph7.2逐渐升高至终点ph8.5。
9.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选所述一级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内；温度121-123℃，保温30分钟；实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃
±
0.5℃时接种、培养。
10.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选一级培养工序如下控制：风量68-72m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；当菌体生长密度(od620)大于0.5，菌液溶氧、ph反弹，一级培养结束。
11.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选所述二级种子罐经历如下过程：
碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内；温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温，其中，碳源为葡萄糖时则单消，温度113-115℃，30分钟，接种前压入二级种子罐。待二级种子罐待温度降至30℃
±
0.5℃时接入一级种子罐培养结束的菌液、培养。
12.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选二级培养工序如下控制：风量700-720m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；菌液溶氧、ph反弹，二级培养结束。
13.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选底料水和碳源连消，氮源实消，消后压入发酵罐。
14.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选发酵开始前发酵罐罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa，ph6.5。
15.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选如下进行补料控制：前三次间隔8h，每次补烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补烷烃原料3t。
16.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，优选发酵罐中如下调节ph值：接入二级菌液前调ph6.5，加烷烃原料前ph低于4.0调至4.5，ph、溶氧反弹后调至7.2，观察菌体无异常，开始正常补加烷烃原料；16h将ph调至7.3，24h将ph调至7.4，36h将ph调至7.5，72h将ph调至7.6，100h将ph调至7.8，120h将ph调至8.0，终点ph调至8.5。
17.本发明从微生物培养和发酵工艺层面进行技术革新，通过实验发现适于热带假丝酵母或维斯假丝酵母的最适生长及代谢条件，本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法将热带假丝酵母或维斯假丝酵母代谢烷烃产出二元酸的发酵周期由原180-190小时缩短至150-170小时。本发明的新方法发酵周期短，烷烃添加量大，产酸高，转化率高，符合节能减排、降低成本的生产要求。
具体实施方式
18.目前的生物法生产长链二元酸的工艺发酵时间较长，一般为180-190小时，较长的发酵周期不利于微生物控制，影响产酸率及转化率，二元酸的纯度不高，较多的杂质也会影响后期提取的难度。本发明从微生物培养和发酵工艺层面进行技术革新，调节热带假丝酵母或维斯假丝酵母培养过程和发酵过程最佳适宜条件和参数，缩短发酵时间，提高产酸率。
19.为了高产率的获得长链二元酸，微生物培养工艺中得到大的菌体量、强的菌体活力非常重要，本发明通过采用两级种子罐对微生物进行培养，并且控制一级种子罐培养后菌体生长密度(od620)大于0.5，相对于现有技术，在菌体量和菌体活力方面取得了明显的改善。
20.本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，一级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内；温度121-123℃，保温30分钟；实消后体积1.4-1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃
±
0.5℃时接种、培养。
21.一级培养工序如下控制：风量68-72m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；当菌体生长密度(od620)大于0.5，菌液溶氧、ph反弹，一级培养结束。
22.二级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温，其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。待二级种子罐温度降至30℃
±
0.5℃时接入一级种子罐培养结束的菌液、培养。
23.二级培养工序如下控制：风量700-720m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；菌液溶氧、ph反弹，二级培养结束。
24.通过两级种子罐、控制特定的工艺参数例如风量、溶氧、罐温和罐压等，可以获得菌体量大、菌体活力强的利于提高发酵产率的微生物菌液。
25.二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵。发酵过程中菌液的ph是菌体在一定环境条件下代谢活动的综合指标，对菌体生长和产品积累有很大的影响。本发明人经过大量试验发现，为达到高生长速率和最佳产物形成，在发酵过程中需要根据情况不断地调节ph，ph经历酸性-中性-碱性的变化，更有利于获得高产率的长链二元酸。
26.发酵罐中例如可以如下调节ph值：接入二级菌液前调ph6.5，加烷烃原料前ph低于4.0调至4.5，ph、溶氧反弹后调至7.2，观察菌体无异常，开始正常补加烷烃原料；16h将ph调至7.3，24h将ph调至7.4，36h将ph调至7.5，72h将ph调至7.6，100h将ph调至7.8，120h将ph调至8.0，终点ph调至8.5。
27.发酵液中的溶氧浓度对微生物的生长和代谢产物形成有着重要的影响。本发明的发酵方法中发酵期间控制溶氧浓度在40％-50％，初始风量可控制在2200-2800m3/h，优选2500m3/h，这样更有利于短时间有效控制溶氧浓度。
28.本发明采用了特殊的分批加料工艺，以提高烷烃原料的添加量和长链二元酸的产率，优选如下进行补料控制：前三次间隔8h，每次补烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补烷烃原料3t。通过对发酵工艺的改进，烷烃添加量可以由目前的25t左右提升至30t以上，产酸率与转化率也均大幅提高。
29.为了更好地说明本发明，下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
30.实施例1
31.本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：
32.(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：将玉米浆干粉(5kg)、酵母膏(11.5kg)、石蜡油(45kg)、尿素(6.5kg)、磷酸二氢钾(15.5kg)、消泡剂(1kg)、白砂糖(40kg)等成分组成的培养基打入一级罐，消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消后体积1.5m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃
±
0.5℃时采用热带假丝酵母接种、培养。
33.在一级培养工序中，风量71m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在45％左右，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；当菌体生长密度(od620)为0.742，菌液溶氧、ph反弹，一级培养结束。
34.(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：将葡萄糖(500kg)、玉米浆干粉(50kg)、酵母膏(140kg)、尿素(75kg)、磷酸二氢
钾(286kg)、白砂糖(15kg)、消泡剂(7kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。待二级种子罐温度降至30℃
±
0.5℃时接入一级种子罐培养结束的菌液、培养。
35.二级培养工序如下控制：风量700m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在45％左右，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；菌液溶氧、ph反弹，二级培养结束。
36.(3)发酵罐发酵：将玉米浆(700kg)、玉米浆干粉(60kg)、酵母膏(420kg)、尿素(250kg)、磷酸二氢钾(700kg)、精制盐(140kg)、氮钾复合肥(750kg)、消泡剂(50kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，底料水和碳源葡萄糖连消，消后50
±
5t，氮源(可以为尿素、玉米浆、酵母膏、酵母浸粉、酵素等)实消，消后压入发酵罐。
37.发酵开始前发酵罐罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa，ph6.5。
38.补料控制：前三次间隔8h，每次补烷烃原料(c12直链烷烃)3.5t，之后根据残烃，低于4％补烷烃原料3t。
39.发酵期间种后风量控制在2500m3/h，控制溶氧在45％左右。发酵罐中如下调节ph值：接入二级菌液前调ph6.5，加烷烃原料前ph低于4.0调至4.5，ph、溶氧反弹后调至7.2，观察菌体无异常，开始正常补加烷烃原料；16h将ph调至7.3，24h将ph调至7.4，36h将ph调至7.5，72h将ph调至7.6，100h将ph调至7.8，120h将ph调至8.0，终点ph调至8.5。
40.本批次发酵周期156小时，产c12二元酸15.81％，c12烷烃添加量34.5吨，c12烷烃对c12二元酸的重量转化率87.27％。
41.实施例2
42.本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：
43.(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：将玉米浆干粉(5kg)、酵母膏(11.5kg)、石蜡油(45kg)、尿素(6.5kg)、磷酸二氢钾(15.5kg)、消泡剂(1kg)、白砂糖(40kg)等成分组成的培养基打入一级罐，消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消后体积1.6m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃
±
0.5℃时采用热带假丝酵母(candida tropicalis c1201)接种、培养。
44.在一级培养工序中，风量70m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在46％，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；当菌体生长密度(od620)为0.605，菌液溶氧、ph反弹，一级培养结束。
45.(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：将葡萄糖(500kg)、玉米浆干粉(50kg)、酵母膏(140kg)、尿素(75kg)、磷酸二氢钾(286kg)、白砂糖(15kg)、消泡剂(7kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。待二级种子罐温度降至30℃
±
0.5℃时接入一级种子罐培养结束的菌液、培养。
46.二级培养工序如下控制：风量700m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在46％左右，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；菌液溶氧、ph反弹，二级培养结束。
47.(3)发酵罐发酵：将玉米浆(700kg)、玉米浆干粉(60kg)、酵母膏(420kg)、尿素(250kg)、磷酸二氢钾(700kg)、精制盐(140kg)、氮钾复合肥(750kg)、消泡剂(50kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，底料水和碳源葡萄糖连消，消后50
±
5t，氮源实消，消后压入发酵罐。
48.发酵开始前发酵罐罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa，ph6.5。
49.补料控制：前三次间隔8h，每次补烷烃原料(c11直链烷烃)3.5t，之后根据残烃，低于4％补烷烃原料3t。
50.发酵期间种后风量控制在2700m3/h，控制溶氧在47％左右。发酵罐中如下调节ph值：种前调ph6.5，加烷烃原料前ph低于4.0调至4.5，ph、溶氧反弹后调至7.2，观察菌体无异常，开始正常补加烷烃原料；16h将ph调至7.3，24h将ph调至7.4，36h将ph调至7.5，72h将ph调至7.6，100h将ph调至7.8，120h将ph调至8.0，终点ph调至8.5。
51.本批次发酵周期166小时，产c11二元酸15.41％，c11烷烃添加量32.0吨，c11烷烃对c11二元酸的重量转化率85.32％。
52.实施例3
53.本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：
54.(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：将玉米浆干粉(5kg)、酵母膏(11.5kg)、石蜡油(45kg)、尿素(6.5kg)、磷酸二氢钾(15.5kg)、消泡剂(1kg)、白砂糖(40kg)等成分组成的培养基打入一级罐，消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消后体积1.5m3；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃
±
0.5℃时采用维斯假丝酵母(candida viswanathii ws-1101)接种、培养。
55.在一级培养工序中，风量70m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在46％，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；当菌体生长密度(od620)为0.711，菌液溶氧、ph反弹，一级培养结束。
56.(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：ph≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：将葡萄糖(500kg)、玉米浆干粉(50kg)、酵母膏(140kg)、尿素(75kg)、磷酸二氢钾(286kg)、白砂糖(15kg)、消泡剂(7kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，消前适当调节ph，使种前ph在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。待二级种子罐温度降至30℃
±
0.5℃时接入一级种子罐培养结束的菌液、培养。
57.二级培养工序如下控制：风量700m3/h，当溶氧低于40％时，逐步提高风量，确保溶氧保持在46％左右，罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa；菌液溶氧、ph反弹，二级培养结束。
58.(3)发酵罐发酵：将玉米浆(700kg)、玉米浆干粉(60kg)、酵母膏(420kg)、尿素(250kg)、磷酸二氢钾(700kg)、精制盐(140kg)、氮钾复合肥(750kg)、消泡剂(50kg)等成分组成的培养基打入二级罐进行实消，底料水和碳源葡萄糖连消，消后50
±
5t，氮源实消，消后压入发酵罐。
59.发酵开始前发酵罐罐温29.5℃
±
1℃，罐压0.1mpa，ph6.5。
60.补料控制：前三次间隔6h，每次补烷烃原料(c14直链烷烃)3.5t，之后根据残烃，低于4％补烷烃原料3t。
61.发酵期间种后风量控制在2600m3/h，控制溶氧在45％左右。发酵罐中如下调节ph值：种前调ph6.5，加烷烃原料前ph低于4.0调至4.5，ph、溶氧反弹后调至7.2，观察菌体无异常，开始正常补加烷烃原料；16h将ph调至7.3，24h将ph调至7.4，36h将ph调至7.5，72h将ph调至7.6，100h将ph调至7.8，120h将ph调至8.0，终点ph调至8.5。
62.本批次发酵周期160小时，产c14二元酸15.72％，c14烷烃添加量30.5吨，c14烷烃对c14二元酸的重量转化率83.9％。
63.对比例1
64.对比例1的生物发酵生产长链二元酸的方法中，仅采用一级种子罐对热带假丝酵母接种、培养，当菌体生长密度(od620)为0.498，菌液溶氧、ph反弹，培养结束，进行发酵罐发酵；除此以外，与实施例1同样地制备c12长链二元酸。
65.发酵周期188小时，产c12二元酸11.2％，c12烷烃添加量24.2吨，c12烷烃对c12二元酸的重量转化率65.39％。
66.对比例2
67.对比例2的生物发酵生产长链二元酸的方法中，发酵过程中，调节ph恒定在7.5左右，溶氧控制在36％；除此以外，与实施例1同样地制备c11长链二元酸。
68.发酵周期180小时，产c11二元酸11.5％，c11烷烃添加量25.1吨，c11烷烃对c11二元酸的重量转化率70.64％。
69.下表示出实施例和对比例的各参数：
[0070] 发酵周期(hr)产酸率(％)烷烃添加量(t)烷烃转化率(％)实施例115615.81％34.587.27％实施例216615.41％32.085.32％实施例316015.72％30.583.9％对比例118811.2％24.265.39％对比例218011.5％25.170.64％
[0071]
通过上述实施例1-3可以看出，本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法发酵周期明显缩短，可由现有的180-190小时缩短至150-170小时，极大地减少能耗，降低生产成本，并且烷烃添加量可以由目前的25t左右提升至30t以上，产酸率与转化率也均大幅提高。尤其是实施例1的生物发酵生产长链二元酸的方法，发酵周期短，产酸率高，效果明显优于其他实施例。
[0072]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。