与油菜甲基硒代半胱氨酸含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnMes-5A1及其应用

与油菜甲基硒代半胱氨酸含量性状qtl紧密连锁的分子标记bnmes-5a1及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及与油菜甲基硒代半胱氨酸含量性状qtl紧密连锁的分子标记bnmes-5a1及其应用。


背景技术：

2.现代研究表明，不同形态的硒在生理功能及生物安全性等方面存在较大差异。其中无机硒的生物利用率低且毒副风险大；与无机硒相比，甲基硒代半胱氨酸具有更高的人体吸收效率、生理活性及生物安全性，因此成为营养学家推荐的健康补硒形式。
3.植物是硒元素由环境进入人类食物链的主要途径，也是将环境中的无机硒转化为甲基硒代半胱氨酸等有机硒形态的重要载体。甘蓝型油菜是我国主推的栽培油菜类型，不仅普遍具有较优异的硒富集能力，其菜苗及菜薹还因口味好、营养均衡、易加工等优点，近年来已逐渐成为广受消费者喜爱的蔬菜产品。有研究发现，不同油菜品种的硒形态构成及含量差异较大，有机硒转化相关性状遗传变异丰富。由此可见，油菜是植物源有机硒转化的良好载体。深入挖掘油菜特异种质中有机硒高效合成的遗传调控位点进行育种改良，将有助于缓解我国日益增长的健康补硒需求。
4.传统的育种手段由于育种年限长、选择效率低，难以满足当前作物育种需求。随着分子生物学和测序技术的快速发展，通过基因型选择加速育种进程已成品种选育中广泛应用的技术手段。利用分子标记辅助选择检测油菜中与甲基硒代半胱氨酸高效合成性状紧密关联的分子标记，可以克服不同形态硒含量表型鉴定中的困难，指导性状的精准导入或聚合，将极大提高育种效率。目前，植物甲基硒代半胱氨酸转化效率相关研究尚无报道，而油菜中尚无相关的遗传调控位点被鉴定的报道。
5.本发明以油菜核心种质资源群体为材料，利用全基因组关联分析鉴定油菜中具有育种应用潜力的甲基硒代半胱氨酸高效合成qtl位点，并基于qtl位点信息开发分子标记，将有助于提高高甲基硒代半胱氨酸油菜品种育种效率。


技术实现要素：

6.本发明的目的是在于提供了检测甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组a05染色体上第36898348位碱基的试剂在油菜甲基硒代半胱氨酸含量筛选育种中的应用，通过对甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组第a05染色体上第36898348位碱基进行基因型的检测，即可实现对油菜甲基硒代半胱氨酸合成能力的筛选育种。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
8.与油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成性状qtl位点qbnmes-5a1的获得：
9.(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用ctab法提取总dna，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50k illumina snp芯片对每个样本进行基因型分析。
10.(2)利用illumina beadstudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率》0.05以及snp标记在甘蓝型油菜darmor基因组(chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行snp标记的过滤，最终获得21,243个高质量snp标记用于全基因组关联分析。
11.(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入structure v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用spagedi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(hardy and vekemans,2002)。
12.(4)利用油菜水培培养体系，将327份材料种植于水培温室；培养至三叶期后，在培养基质中添加10μm亚硒酸钠继续培养5天，采集菜苗样品进行硒形态测定。设置3次生物学重复，每个样本取5株材料均匀粉碎，通过液相色谱-形态预处理装置-原子荧光联用仪(lc-afs，gh/t 1135-2017)测定甲基硒代半胱氨酸含量。
13.(5)结合基因型数据、群体结构和油菜苗期硒含量数据，利用tassel 5.0软件(bradbury et al.,2007)进行关联分析，在a05染色体上检测到与油菜甲基硒代半胱氨酸含量显著关联的snp标记a05-36898348，最高可解释5.1％的表型变异，该snp变异位点(由c到g的变异)位于甘蓝型油菜darmor-bzh v10(rousseau-gueutin et al.,2020)基因组a05染色体的第36898348位碱基处，该snp位点紧密连锁的甲基硒代半胱氨酸高效合成主效qtl位点被命名为qbnmes-5a1。
14.检测甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组a05染色体上第36898348位碱基的试剂在油菜甲基硒代半胱氨酸富集能力筛选育种中的应用，属于本发明的保护范围。
15.检测包含有甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组a05染色体上第36898348位碱基的油菜序列的试剂在油菜甲基硒代半胱氨酸富集能力筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
16.以上所述应用中，优选的，所述的油菜序列为seq id no.2所示。
17.针对甘蓝型油菜darmor-bzh v10基因组a05染色体上第36898348位碱基设计的引物在油菜甲基硒代半胱氨酸富集能力筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
18.以上所述的应用中，申请人根据上述snp位点，开发了其正义链的kasp标记bnmes-5a1，根据该标记设计的引物为：
19.qbnmes-5a1低富硒能力等位基因型特异引物bnmes-5a1-f1：gaattacacatttgaggagcaaac
20.qbnmes-5a1高富硒能力等位基因型特异引物bnmes-5a1-f2：gaattacacatttgaggagcaaag
21.反向引物bnmes-5a1-r：cggatctctccatacttagctttct。
22.上述引物，需根据kasp标记开发的原则，在使用前需加上kasp标记的通用接头。
23.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
24.(1)本发明首次获得了与油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成显著关联的主效qtl位点qbnmes-5a1，最高可解释5.1％的表型变异，可有效应用于油菜的甲基硒代半胱氨酸高效合成性状的遗传改良。
25.(2)首次研究发现了与油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成显著关联的分子标记
bnmes-5a1，为油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成性状的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
26.(3)利用分子标记bnmes-5a1可在油菜幼苗生长期快捷地对油菜品种或品系中qbnmes-5a1的优异等位变异进行选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成的育种进程。
具体实施方式
27.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。在本发明中，如未特殊说明，所述甘蓝型油菜基因组均以darmor-bzh v10(rousseau-gueutin et al.,2020)为参照。本发明的甘蓝型油菜参考：whole-genome resequencing of a worldwide collection of rapeseed accessions reveals the ge netic basis of ecotype divergence。
28.实施例1：
29.油菜甲基硒代半胱氨酸含量性状qtl位点qbnmes-5a1的获得：
30.(1)收集327份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用ctab法提取总dna，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50k illumina snp芯片对每个样本进行基因型分析。
31.(2)利用illumina beadstudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率》0.05以及snp标记在甘蓝型油菜darmor基因组(chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行snp标记的过滤，最终获得21,243个高质量snp标记用于全基因组关联分析。
32.(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入structure v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用spagedi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(hardy and vekemans,2002)。
33.(4)利用油菜水培培养体系，将327份材料种植于水培温室；培养至三叶期后，在培养基质中添加10μm亚硒酸钠继续培养5天，采集菜苗样品进行硒形态测定。设置3次生物学重复，每个样本取5株材料均匀粉碎，通过液相色谱-形态预处理装置-原子荧光联用仪(lc-afs，gh/t 1135-2017)测定甲基硒代半胱氨酸含量。
34.(5)结合基因型数据、群体结构和油菜苗期甲基硒代半胱氨酸含量数据，利用tassel 5.0软件(bradbury et al.,2007)进行关联分析，在a05染色体上检测到与油菜甲基硒代半胱氨酸含量显著关联的snp标记a05-36898348，最高可解释5.1％的表型变异，该snp变异位点(由c到g的变异)位于甘蓝型油菜darmor-bzh v10(rousseau-gueutin et al.,2020)基因组a05染色体的第36898348位碱基处，该snp位点紧密连锁的甲基硒代半胱氨酸高效合成主效qtl位点被命名为qbnmes-5a1。
35.实施例2：
36.一种与甲基硒代半胱氨酸含量性状qtl位点qbnmes-5a1紧密连锁的分子标记引物的获得：
37.(1)提取甘蓝型油菜a05染色体第36898348位碱基上下游各100bp的序列，按照
kasp(kompetitive allele-specific pcr，即竞争性等位基因特异性pcr)分子标记引物设计原则，针对其正义链，开发kasp分子标记bnmes-5a1，该标记包括两条竞争性正向引物bn mes-5a1-f1和bnmes-5a1-f2，分别对应上述snp变异位点的序列碱基c和g，以及一条反向通用引物bnmes-5a1-r，引物序列如下：
38.bnmes-5a1-f1：gaattacacatttgaggagcaaac
39.bnmes-5a1-f2：gaattacacatttgaggagcaaag
40.bnmes-5a1-r：cggatctctccatacttagctttct
41.上述引物，需根据kasp标记开发的原则，在使用前需加上kasp标记的通用接头。
42.其中bnmes-5a1-f1前所加接头序列为gaaggtgaccaagttcatgct，bnmes-5a1-f2前所加接头序列为gaaggtcggagtcaacggatt。
43.在甘蓝型油菜bingo中扩增的序列为a基因型(即cc基因型)，序列如下所示：gaattacacatttgaggagcaaacagaaagctaagtatggagagatccg(seq id no.1所示)。
44.在甘蓝型油菜westar中扩增的序列为b基因型(即gg基因型)，序列如下所示：gaattacacatttgaggagcaaagagaaagctaagtatggagagatccg(seq id no.2所示)。
45.(2)对标记采用竞争性等位基因特异性pcr技术在油菜关联群体中进行基因型分型，扩增使用试剂盒为五引物扩增受阻突变体系(pams)，按照pams pro snp gentyping pcr m ix试剂盒说明，设计10ul反应体系：2
×
parms master mix 5μl，allele x primer(10μm)0.15μl，allele y primer(10μm)0.15μl，common r primer(10μm)0.4μl，油菜基因组dna 10-100ng。扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65-57℃(touch-down)1min，循环10次；94℃20s，57℃1min，循环30次；采集1次荧光信号并输出基因型结果。再利用tassel软件进行关联分析，明确bnmes-5a1与油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成性状主效qtl位点qbnmes-5a1显著关联。
46.利用上述方法，明确bnmes-5a1标记与油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成性状主效qtl位点qbnmes-5a1显著关联。
47.实施例3：
48.基于油菜a05染色体第36898348位碱基设计的引物在油菜甲基硒代半胱氨酸高效合成性状筛选育种中的应用，其步骤如下：
49.(1)挑选出327份材料中经过多代自交已纯合的甲基硒代半胱氨酸含量较高和甲基硒代半胱氨酸较低的材料各25份；将上述材料种植于水培温室，培养至三叶期后，在培养基质中添加10μm亚硒酸钠继续培养5天，采集菜苗样品进行硒形态测定。设置3次生物学重复，每个样本取5株材料均匀粉碎，通过液相色谱-形态预处理装置-原子荧光联用仪(lc-afs，gh/t 1135-2017)测定甲基硒代半胱氨酸含量。
50.(2)检查分子标记bnmes-5a1的两种基因型在上述甲基硒代半胱氨酸含量较高和较低的材料中分布情况。结果表明，分子标记bnmes-5a1的基因型在25份甲基硒代半胱氨酸含量较高的材料中4份为a，21份为b，而在25份甲基硒代半胱氨酸含量较低的材料中15份为a，10份为b(表1)。
51.(3)t测验结果表明分子标记bnmes-5a1检测出的a和b两类基因型在油菜苗甲基硒代半胱氨酸含量上存在极显著差异(p《0.01)。
52.以上的结果足以说明我们制备的分子标记bnmes-5a1与油菜菜苗甲基硒代半胱氨
酸含量是高度关联的，因而可用于油菜高甲基硒代半胱氨酸性状的分子标记辅助选择。
53.表1：分子标记bnmes-sc7在油菜菜苗甲基硒代半胱氨酸含量极端材料中的基因型
54.