一种便携式厌氧培养装置及其应用

一种便携式厌氧培养装置及其应用
1.技术领域
2.本发明属于厌氧培养装置领域，具体涉及一种针对环境样品制备厌氧培养体系的装置及其应用。
3.

背景技术：

4.在环境学科领域中，研究不同氧气状态下的生物转化过程是一个非常重要的内容。如在场地土壤研究中，污染物排放到土壤中再渗入地下水，表层土壤污染物主要发生好氧降解，而在深层土壤和地下水中污染物则发生厌氧转化。又如在农田土壤研究中，旱作土壤修复会研究好氧降解，而在水田主要研究淹水状态下的厌氧降解过程。而且，在实际环境中好氧-厌氧状态在空间和时间上存在交替，并无明显界限。解析污染环境中好氧和厌氧生物转化过程与贡献对污染修复具有实际意义。通常，好氧研究只需要在开放环境下开展即可，不需要特别的设备支撑。相比而言，开展厌氧研究对设备要求极高，不仅需要体积庞大的厌氧培养箱，更需要在墙面布设复杂的气体管路，提供专门的除氧装置等多方面的配套设施来支撑严格的厌氧体系，这导致进口培养箱价格不菲。实际上，有的实验室并不是专门从事厌氧研究，而配置厌氧装置在占地和使用成本的需求，限制了这些实验室开展厌氧培养工作。
5.针对创造厌氧培养体系，国内提出了一些简易方案取代厌氧培养箱，基本原理都是通过充气/抽气交替的方式来置换培养瓶内的气体，如专利申请公开号为cn210237634u，名称是厌氧培养基制备系统；专利申请公开号为cn107175242a，名称是厌氧培养瓶充气抽真空清洗系统；专利申请公开号为cn104450508a，名称是厌氧微生物接种装置、厌氧微生物培养系统以及厌氧微生物接种、培养方法，这些系统都需要把气路布设在墙体或金属支架，对实验室占地有一定需求。专利申请公开号为cn203794901a，名称是的厌氧培养装置及厌氧培养系统，提供了一个便携式的充气/抽气设备。但是，目前这些系统主要用于制备厌氧微生物培养基或厌氧气瓶，而缺乏针对环境样品的无氧体系制备。首先，环境样品如土壤、沉积物、秸秆等都是固形物体，内部多孔结构本身吸附很多氧气，直接对顶空气体的充气/抽气并不容易去除；其次，传统设备均采用细针头插入培养瓶，细针头直接插入土壤等环境样品中会造成针头堵塞。虽然环境样品中本身存在有机物和微生物，体系封闭一段时间氧气也会被消耗掉，但研究中往往需要排除生物因素，而且在培养前将体系条件统一化，对提高数据可靠性和稳定性具有重要意义。
6.

技术实现要素：

7.解决的技术问题：本发明针对环境样品制备厌氧培养体系的不足，提供一种便携式厌氧培养装置及其应用，提高环境样品的除氧效率，适于在不同实验室进行推广应用。
8.技术方案：一种便携式厌氧培养装置，包括箱体，由气体混合净化区块、充气抽气区块和注气区块组成，所述气体混合净化区块包括一组并联的浮子流量计和气体净化柱，浮子流量计的进气端与气瓶接口经二通球阀a管道连接，浮子流量计的排气端经单向阀a与气体净化柱的进气端管道连接，气体净化柱的排气端与三通球阀a连接；所述充气抽气区块包括三通球阀b、真空泵接口、稳压压力表和一组并联的排气口小孔，三通球阀b的一端与三通球阀a管道连接，真空泵接口经单向阀b与三通球阀b的一端管道连接，稳压压力表的一端与三通球阀b连接，另一端经单向阀c与一组出气口小孔并联管道连接，并联管路上设有泄压阀，每个连接出气口小孔的管路上均设有二通球阀b；注气区块包括一组并联的注气口小孔和微调阀，所述注气口小孔分别通过单向阀d与微调阀管道连接，微调阀通过二通球阀c与三通球阀a管道连接。
9.上述气瓶接口为1/8 in卡套接头，所述真空泵接口为1/8 in卡套接头。
10.上述排气口小孔连接有尖口针头，注气口小孔连接有平口针头。
11.上述浮子流量计由3个并联，分别通过气瓶接口与n2、co2、h2气瓶连接。
12.上述注气口小孔由3个并联。
13.上述排气口小孔由5个并联。
14.上述箱体内部管路采用铜管连接，箱体外部管路采用ptfe管连接。
15.上述便携式厌氧培养装置的应用，包括以下步骤：（1）通过气瓶接口与所需气瓶连接，通过真空泵接口与真空泵连接；（2）打开气瓶，打开二通球阀a，打开二通球阀c，将三通球阀a旋入注气区块，调整微调阀降低整体气体流速，通过调节浮子流量计的旋钮对气体比例进行调整；（3）调节微调阀旋钮提高出气流速，将连接平口针头插入土壤、泥浆或培养基介质中，注入混合气体，进行介质除氧的预处理；通气一段时间后，将介质分装于经过通气的培养瓶，盖上丁基橡胶塞并用铝盖封口；（4）将三通球阀a旋入充气抽气区块，再将三通球阀b旋入充气气路；（5）将连接充气抽气区块的尖口针头插入封口培养瓶中注入气体，之后在培养瓶盖上再插入一个单独的尖口针头，气体边充边放，维持一段时间置换瓶内气体；（6）拔掉单独的尖口针头，通过稳压压力表观察瓶内压力上升，由于稳压作用压力提高至25 psi时不再上升从而保护了瓶体；（7）打开真空泵，将三通球阀b旋入抽气气路，通过气压表观察瓶内压力下降，降至-10 psi以下时，旋动三通球阀b，气瓶再次进入充气状态；（8）通过旋动三通球阀b，实现充气/抽气循环，往复3～5次瓶内气体置换完成，最后调整瓶内气体略高于大气压即可；关闭所有二通阀，关闭气瓶和真空泵，再断开与装置的连接。
16.有益效果：1. 功能集成性：设备通过注气区块在开放体系不断通入无氧气体对环境介质进行除氧预处理，通过充气抽气区块在封闭体系对培养瓶内气体进行置换，通过两步骤的处理提高环境样品中氧气的去除效率。2. 便携性：装置设有球阀和单向阀对气路管道和净化柱提供了二重保护作用，解决了系统在非连接状态下可能出现的容易老化的问题，提高了实验稳定性，延长了装置使用寿命。使用时只需将装置连接实验室常规的气瓶和真空泵即可开始工作。现制成的装置箱体大小为50cm(l)*10cm(w)*40cm(h)，改进箱体内部管路布设还可进一步减小体积。该设备占地少、易移动，在不同研究背景的实验室中都可方便使用。
17.附图说明
18.图1 本发明装置的外观示意图；图2 本发明装置的内部机构示意图；图3 本发明装置的实拍图；上图中：1箱体，2气瓶接口，3真空泵接口，4二通球阀a，5浮子流量计，6三通球阀a，7三通球阀b，8稳压压力表，9二通球阀b，10排气口小孔，11二通球阀c，12微调阀， 13注气口小孔，14单向阀a，15气体净化柱，16单向阀b，17单向阀c，18单向阀d，19 卸压阀；图4 利用本装置研究多氯联苯污染土壤厌氧生物修复的应用；图中：fck：厌氧非淹水；f1：厌氧非淹水 零价铁；gck：厌氧完全淹水；g1：厌氧完全淹水 零价铁；hck：好氧非淹水；h1：好氧非淹水 零价铁；图5 利用本装置研究多环芳烃污染场地土壤厌氧生物修复的应用；图中：ck：污染土壤对照；t1：好氧；t2：厌氧。
19.具体实施方式
20.以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
21.实施例1：便携式厌氧培养装置，包括箱体1，箱体内设有气体混合净化区块、充气抽气区块和注气区块，所述气体混合净化区块包括一组并联的浮子流量计5和气体净化柱15，浮子流量计5的进气端与气瓶接口2经二通球阀a 4管道连接，浮子流量计5的排气端经单向阀a 14与气体净化柱15的进气端管道连接，气体净化柱15的排气端与三通球阀a 6连接；所述充气抽气区块包括三通球阀b 7、真空泵接口3、稳压压力表8和一组并联的排气口小孔10，三通球阀b 7的一端与三通球阀a 6管道连接，真空泵接口3经单向阀b 16与三通球阀b 7的一端管道连接，稳压压力表8的一端与三通球阀b 7连接，另一端经单向阀c 17与一组出气口小孔10并联管道连接，并联管路上设有泄压阀19，每个连接出气口小孔的管路上均设有二通球阀b 9；注气区块包括一组并联的注气口小孔13和微调阀12，所述注气口小孔13分别通过单向阀d 18与微调阀12管道连接，微调阀12通过二通球阀c 11与三通球阀a 6管道连接。气瓶接口2为1/8 in卡套接头，所述真空泵接口3为1/8 in卡套接头。排气口小孔10连接有尖口针头，注气口小孔13连接有平口针头。浮子流量计5由3个并联，分别通过气瓶接口与n2、co2、h2气瓶连接。注气口小孔13由3个并联。排气口小孔10由5个并联。箱体内部管路采用铜管连接，箱体外部管路采用ptfe管连接。
22.实施例2无氧水的制备制备无氧水用于无氧培养体系中的水分比例调整。
23.利用实施例1的装置，将n2气瓶与气瓶接口2连接，另外两个气瓶接口用卡套堵头封死。真空泵与真空泵接口3连接。打开n2气瓶，打开二通球阀a 4，打开二通球阀c 11，将三
通球阀a 6旋入注气区块，通过调节浮子流量计5和微调阀12调至合适的气体流速。将连接注气区块的其中一个平口针头插入预装有蒸馏水的圆底烧瓶，瓶底加热，待蒸馏水沸腾后将圆底烧瓶放于冰块上冷却，期间一直保持通气状态。加入0.2 mm l-半胱氨酸和0.2 mm 硫化钠作为还原剂，加入0.25 mg/l刃天青作为指示剂，通过磁力搅拌使之溶解并混合均匀。采用分液器将冷却的蒸馏水分装入厌氧培养瓶（预先用另外的瓶口针头对瓶内进行通气）中，盖上丁基橡胶塞并用铝盖封口。
24.将三通球阀a 6旋入充气抽气区块，再将充气抽气管路上的三通球阀b 7旋入充气气路；将连接充气抽气区块的尖口针头插入封口培养瓶顶空注入气体，之后在培养瓶盖上再插入一个单独的尖口针头，气体边充边放，维持3分钟左右；拔掉单独的尖口针头，通过稳压压力表8观察瓶内压力上升，压力提高至25 psi时不再上升；打开真空泵，将充气抽气管路上的三通球阀b 7旋入抽气气路，通过稳压压力表8观察瓶内压力下降，降至-10 psi以下时，旋动充气/抽气管路上的三通球阀b 7，气瓶再次进入充气状态；通过旋动充气抽气管路上的三通球阀b 7，实现充气/抽气循环，往复3次瓶内气体置换完成；关闭所有阀门，关闭气瓶和真空泵，断开与装置的连接。
25.配制溶液经高温灭菌处理，颜色将由初始粉红色变浅或无色状态，即表征水体去氧状态。
26.实施例2：多氯联苯污染土壤中厌氧生物修复研究采用多氯联苯人工污染农田土壤（初始浓度为1.01
±
0.96 mg
·
kg-1
）进行厌氧生物修复研究，用无氧水调整60%最大田间持水量设置厌氧非淹水状态，评估旱地土壤中根际厌氧微环境对生物降解的贡献；用无氧水调整水土比2:1设置厌氧完全淹水状态，模拟水田修复场景下的生物降解作用。
27.利用实施例1的装置，将n2气瓶和co2气瓶分别与气瓶接口2连接，另外一个接口用卡套堵头封死。将真空泵与真空泵接口3连接；打开气瓶，打开n2和co2的二通球阀a 4，打开注气区块二通球阀c11，将三通球阀a 6旋入注气区块，调整微调阀12降低整体气体流速，通过调节对应n2和co2的浮子流量计5旋钮调整气体比例为8:2；调节微调阀12旋钮提高出气流速，将连接注气区块的其中一个平口针头插入预装有机污染土壤样品的厌氧培养瓶中，同时可操作多个培养瓶。保持通气15~20min，盖上丁基橡胶塞并用铝盖封口，加入无氧水调节土壤含水量为60%最大田间持水量。
28.将n2气瓶和co2气瓶分别与气瓶接口2连接，另外一个接口用卡套堵头封死。将真空泵与真空泵接口3连接；打开气瓶，打开n2和co2的二通球阀a 4，打开二通球阀c 11，将三通球阀a 6旋入注气区块，调整微调阀12降低整体气体流速，通过调节对应n2和co2的浮子流量计5旋钮调整气体比例为8:2；调节微调阀12旋钮提高出气流速。有机污染土壤和无氧水按比例1:2混合成泥浆并加入厌氧培养瓶，将连接注气区块的其中一个平口针头插入装有样品的厌氧培养瓶中，同时可操作多个培养瓶。保持通气15~20min，盖上丁基橡胶塞并用铝盖封口。
29.将三通球阀a 6旋入充气抽气区块，再将充气/抽气管路上的三通球阀b 7旋入充气气路；将连接充气抽气区块的尖口针头插入封口培养瓶顶空注入气体，之后在培养瓶盖上再插入一个单独的尖口针头，气体边充边放，维持3分钟左右；拔掉单独的尖口针头，通过
稳压压力表8观察瓶内压力上升，压力提高至25 psi时不再上升；打开真空泵，将充气/抽气管路上的三通球阀b 7旋入抽气气路，通过稳压压力表8观察瓶内压力下降，降至-10 psi以下时，旋动充气/抽气管路上的三通球阀b 7，气瓶再次进入充气状态；通过旋动充气/抽气管路上的三通球阀b 7，实现充气/抽气循环，往复3次瓶内气体置换完成；关闭所有阀门，关闭气瓶和真空泵，断开与装置的连接。
30.厌氧瓶于28 ℃静置培养，2个月后检测污染土壤多氯联苯总量和组成。结果发现（图4），厌氧处理（fck、gck）和好氧处理（hck）相比并未明显降低土壤中污染物总量，但显著促进了土壤中高氯组分向低氯组分的转化。相比于好氧处理（hck），厌氧非淹水处理（fck）6氯组分降低了13.5%，5氯组分降低了18.4%，4氯组分降低了28.0%，2氯组分提高了20.2%；厌氧完全淹水处理（gck）6氯组分降低了30.7%，5氯组分降低了14.8%，4氯组分降低了22.0%，2氯组分提高了58.7%；在两种厌氧状态之间，厌氧完全淹水处理（gck）下高氯向低氯污染物转化的效率会更明显。同时，处理中加入零价铁在好氧状态（h1）下并未显著改变土壤中污染物总量与组成，而在厌氧条件下零价铁（f1、g1）进一步促进了高氯组分向低氯组分的转化。相比于好氧处理（fck），厌氧非淹水 零价铁（f1）6氯组分降低了32.7%，5氯组分降低了27.7%，4氯组分降低了6.6%，2氯组分提高了92.9%；厌氧完全淹水处理（g1）6氯组分降低了36.9%，5氯组分降低了27.0%，4氯组分降低了8.9%，2氯组分提高了100%。
31.实施例3：多环芳烃污染土壤中厌氧生物修复研究采集多环芳烃污染场地土壤（初始浓度为161
ꢀ±ꢀ
29.4 mg kg-1
）进行厌氧生物修复研究，用无氧水调整水土比1:1设置厌氧淹水状态，模拟场地土壤地下水饱和状态下的生物降解作用。
32.利用实施例1的装置，将n2气瓶和co2气瓶分别与气瓶接口2连接，另外一个接口用卡套堵头封死。将真空泵与真空泵接口3连接；打开气瓶，打开n2和co2的二通球阀a 4，打开二通球阀c 11，将三通球阀a 6旋入注气区块，调整微调阀12降低整体气体流速，通过调节对应n2和co2的浮子流量计5旋钮调整气体比例为8:2；调节微调阀12旋钮提高出气流速。将连接注气区块的其中一个平口针头插入预装有机污染土壤样品的厌氧培养瓶中，同时可操作多个培养瓶。保持通气15~20min，盖上丁基橡胶塞并用铝盖封口，加入无氧水调节水土比1:1。
33.将三通球阀a 6旋入充气/抽气区块，再将充气/抽气管路上的三通球阀b 7旋入充气气路；将连接充气/抽气区块的尖口针头插入封口培养瓶顶空注入气体，之后在培养瓶盖上再插入一个单独的尖口针头，气体边充边放，维持3分钟左右；拔掉单独的尖口针头，通过稳压压力表8观察瓶内压力上升，压力提高至25 psi时不再上升；打开真空泵，将充气/抽气管路上的三通球阀b 7旋入抽气气路，通过稳压压力表8观察瓶内压力下降，降至-10 psi以下时，旋动充气/抽气管路上的三通球阀b 7，气瓶再次进入充气状态；通过旋动充气/抽气管路上的三通球阀b 7，实现充气/抽气循环，往复3次瓶内气体置换完成；关闭所有阀门，关闭气瓶和真空泵，再断开与装置的连接。
34.厌氧瓶于28 ℃静置培养，2个月后检测污染土壤多环芳烃总量和组成。结果发现（图5），好氧处理（t1）和厌氧处理（t2）均促进了土壤中多环芳烃的降解，厌氧处理下多环芳烃总量降低了31.0%。其中，高环组分表现降解效果更为明显，为茚并(1,2,3-cd)芘34.1%，二苯并(a,h)蒽33.3%，苯并(g,h,i)苝32.6%。
35.以上所述的实施例只是为更好地解释本发明而给出的优选实施方案，因此上述实施例并不用于限制本发明，在本发明的原则之内做的修改、改进和替换均应包含在本发明的保护范围之内。