一种提高宠物犬猫消化功能的酪蛋白磷酸肽的制备方法与流程

1.本发明涉及多肽-金属螯合物制备领域，更具体地说，本发明涉及一种高锌酪蛋白磷酸肽的制备方法及其在宠物中的应用。


背景技术：

2.锌是动物必不可少的微量元素之一，在动物的生长发育、免疫、内分泌等生理过程中起着举足轻重的作用。锌有改善味觉，促进食欲，增强免疫力，促进大脑发育等作用。幼年犬猫正处于生长期，消化系统尚未发育完全，肠道无法有效地吸收营养物质。因此幼年犬猫很容易出现肠胃不适，消化不良等症状，这会导致其免疫力低下，容易生病，甚至影响正常的生长发育。多肽具有刺激性小、易吸收等特点，因此将锌与多肽进行螯合，能提高锌的吸收效率，从而促进犬猫消化率的提升。
3.酪蛋白是一种坚硬、致密的凝乳，具有溶解性差、难以被充分酶解消化等缺点，占牛乳蛋白的80％～82％，其中αs1-酪蛋白是牛乳蛋白中的主要成分，它是一种高度磷酸化蛋白(1个分子含8个磷酸基团)，经酶水解之后，可得到酪蛋白磷酸肽，具有降血压、抗氧化、促进机体对金属离子吸收等作用。酪蛋白富含半胱氨酸(大约占3％)，半胱氨酸具有广谱抗菌、螯合金属离子、保护巯基蛋白酶和肝细胞不受损害、刺激造血机能、增加白细胞和促进皮肤损伤的修复、促进肝脏功能恢复、参与细胞的还原过程和肝脏内的磷脂代谢等功能，还是毛发等角蛋白的重要组成氨基酸。这些半胱氨酸的巯基主要以二硫键形式存在。蛋白质的二硫键数目越多，蛋白交联越紧密，越难溶于水，导致蛋白酶很难“进攻”二硫键保护的酶解位点，表现为酪蛋白的酶解效率低，故通过提高酶解效率，制备高含量半胱氨酸的酪蛋白磷酸肽成为研究热点。传统方法通常采用两步：第一步，利用还原方法(如添加还原剂亚硫酸氢钠)将蛋白质的二硫键还原成游离的巯基；第二步，在中性或者碱性的条件下进行蛋白质酶解形成半胱氨酸含量较高的低聚肽。但是由于半胱氨酸的游离巯基在中性或者碱性条件下易被重新氧化成二硫键，故需要对游离的巯基进行保护。
4.锌离子和半胱氨酸的巯基能够配位形成类似手指状结构，从而起到保护自由巯基的作用。金属锌-盐酸还原法是常用的还原l-胱氨酸制备l-半胱氨酸的方法，但利用锌同时实现酪蛋白二硫键的还原、游离巯基的保护、降低后续产物——酪蛋白磷酸肽的分离难度，并利用该方法制备的酪蛋白磷酸肽用于提高宠物犬猫消化功能的研究尚未见到报道。


技术实现要素：

5.为克服已有方法存在的缺陷，本发明的目的一方面是提供一种酪蛋白磷酸肽-锌螯合物的制备方法，另一方面是提供其在宠物功能食品中的应用。
6.本发明提供的一种提高宠物犬猫消化功能的酪蛋白磷酸肽的制备方法，按照下述步骤进行：
7.(1)酪蛋白酶解：10份酪蛋白加入250～500份水，调节ph为1.5～2.0，加入0.02～0.05份胃蛋白酶，维持温度35～42℃，酶解至水解度为15％～20％。
8.(2)锌还原二硫键：在酪蛋白水解液中加入浓盐酸，调节盐酸终浓度至1.5～2.5mol/l，加入2～5份锌粉，50～60℃反应1.5～2.5h。
9.通过本设定，锌粉与盐酸反应的产生的h2，可将酪蛋白及其水解物中半胱氨酸二硫键还原成游离巯基，同时游离的巯基可以与锌离子进一步螯合，降低多肽的溶解性。
10.(3)酪蛋白磷酸肽沉淀：加入0.1～0.2份蛋氨酸，缓慢加入naoh固体并搅拌，调节ph至5.5～6.5，降温至0～10℃，静置至少1h，离心后去除上清，取沉淀用95％的乙醇清洗除尽杂质后烘干，获得酪蛋白磷酸肽。
11.通过本设定，若干个多肽和氨基酸侧链上的游离的巯基、羧基、氨基同锌离子螯合物可以与蛋氨酸进一步螯合桥接，形成分子聚集物进一步降低复合物的溶解度，在ph为5.5～6.5时，复合物的净电荷量最小，此时溶解度最小，通过降低温度，进一步降低溶解度，可通过简单的离心获得酪蛋白磷酸肽。
12.将上述方法获得的酪蛋白磷酸肽在改善幼年宠物犬猫消化功能的宠物食品中应用。
13.本发明具体的优点：
14.(1)工艺上：第一步在酸性条件进行酶解，反应结束后，通过调节至盐酸浓度为1.5～2.5mol/l可直接实现对蛋白酶灭酶处理，工艺简单；第二步利用锌与盐酸反应生产h2和锌离子，在还原二硫键的同时无需在后续工艺加入锌离子；第三步单纯的锌离子与低聚肽鳌合，沉淀形成慢，得率低，通过加入蛋氨酸提供更多可供配位的氨基，显著增加螯合率，后续通过调节ph和降低温度，进一步提高沉淀生成速度和沉淀得率(提高88％以上)；
15.(2)效果上：本发明制备酪蛋白磷酸肽含有较高比例的有机螯合锌、还原型半胱氨酸和谷氨酰胺。有机螯合锌在实现补锌的同时具有刺激性小、吸收率高的优点，可以促进食欲提高动物对蛋白质、脂肪等的消化机能。半胱氨酸除可供身体补充营养外，还可以进一步转化为牛磺酸参与身体代谢，具有消炎、镇痛、维持机体渗透压平衡、维持正常视觉、促进脂类的消化吸收等功能，另外谷氨酰胺对胃肠黏膜上皮成分己糖胺和葡萄糖胺的生化合成有促进作用，能够发挥其保护肠道粘膜、促进肠道吸收能力。在进食了添加本发明制备的酪蛋白磷酸肽日粮一周后，幼年中华田园猫对粗蛋白质、粗脂肪的消化率至少增加了21％和22％，幼年中华田园犬对粗蛋白质、粗脂肪的消化率至少增加了19％和10％，平均日采食量提升了10g/d以上，说明本发明制备的酪蛋白磷酸肽能促进宠物犬猫食欲并提高其对蛋白质和脂肪等的消化吸收率。
具体实施方式
16.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
17.在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
18.对比例和实施例中蛋白质含量的测定方法参考国标gb/t 5009.5-2016。
19.对比例和实施例中油脂含量的测定方法参考国标gb/t 5009.6-2016。
20.对比例和实施例中螯合率含量的测定方法参考邝小贤,张敏婕,何冠浩,等.乳源锌螯合物酶解制备及其螯合特性分析[j].食品与发酵工业,2019,45(10):135-141.
[0021]
本发明中使用的胃蛋白酶购于南宁庞博生物工程有限公司，单位酶活为3000nf u/mg。
[0022]
对比例1
[0023]
10g酪蛋白加入500g水，调节ph为2.0，加入0.05g胃蛋白酶，维持温度35℃，酶解至水解度为15％。
[0024]
缓慢加入naoh固体并搅拌，调节ph至5.5，降温至10℃，静置至少1h，离心后去除上清，取沉淀用95％的乙醇清洗除尽杂质后烘干，获得酪蛋白磷酸肽，得率为17％。
[0025]
实施例1
[0026]
(1)10g酪蛋白加入500g水，调节ph为2.0，加入0.05g胃蛋白酶，维持温度35℃，酶解至水解度为15％。
[0027]
(2)在酪蛋白水解液中加入浓盐酸，调节盐酸终浓度至2.5mol/l，加入2g锌粉，60℃反应1.5h。
[0028]
(3)加入0.2g蛋氨酸，缓慢加入naoh固体并搅拌，调节ph至5.5，降温至10℃，静置至少1h，离心后去除上清，取沉淀用95％的乙醇清洗除尽杂质后烘干，获得酪蛋白磷酸肽，得率为37％。
[0029]
实施例2
[0030]
(1)10g酪蛋白加入250g水，调节ph为1.5，加入0.02g胃蛋白酶，维持温度42℃，酶解至水解度为20％。
[0031]
(2)在酪蛋白水解液中加入浓盐酸，调节盐酸终浓度至1.5mol/l，加入5g锌粉，50℃反应2.5h。
[0032]
(3)加入0.1g蛋氨酸，缓慢加入naoh固体并搅拌，调节ph至6.5，降温至0℃，静置至少1h，离心后去除上清，取沉淀用95％的乙醇清洗除尽杂质后烘干，获得酪蛋白磷酸肽，得率为32％。
[0033]
实施例3
[0034]
(1)10g酪蛋白加入375g水，调节ph为1.5，加入0.04g胃蛋白酶，维持温度37.5℃，酶解至水解度为18％。
[0035]
(2)在酪蛋白水解液中加入浓盐酸，调节盐酸终浓度至2.0mol/l，加入4g锌粉，55℃反应2h。
[0036]
(3)加入0.15g蛋氨酸，缓慢加入naoh固体并搅拌，调节ph至6.0，降温至4℃，静置至少1h，离心后去除上清，取沉淀用95％的乙醇清洗除尽杂质后烘干，获得酪蛋白磷酸肽，得率为47％。
[0037]
以下通过动物实验例来说明本发明的有益效果。
[0038]
实验方法：选取40只幼年中华田园犬(年龄5～7月，体重5.0～7.5kg)和40只幼年中华田园猫(年龄4～7月，体重1.0～3.0kg)，随机分为4组，每组分别有10只幼猫和10只幼犬，其中雄性：雌性＝5：5。对照组饲喂添加了0.01％对比例1的日粮(见表1、2)，犬、猫实验组1、2、3饲喂分别添加了0.01％实施例1、2、3的日粮，自由进食，连续饲喂7天，每天测量宠物犬猫的采食量及体重，第8天收集其粪便，进行粗蛋白质和粗油脂的消化率检测。
[0039]
实验前已对犬猫进行必要的免疫、驱虫处理，并且实验开始15天前没有给犬猫喂食会改变肠道微生物菌群的任何药物(如抗生素)。保持宠物圈舍内的清洁，每天定时给每只犬猫喂食日粮，在整个实验期间保证其自由饮水和进食。
[0040]
表1幼年中华田园犬基础日粮的营养水平
[0041]
成分含量/％粗蛋白质32.0粗脂肪13.0粗纤维5.0水分10.0钙1.2总磷1.0赖氨酸1.2粗灰分10.0水溶性氯化物(以cl-计)0.4
[0042]
表2幼年中华田园猫基础日粮的营养水平
[0043][0044][0045]
实验结果：
[0046]
如表3所示，实施例1、2、3均有效提升了宠物犬猫的食欲。喂食7天后，添加了实施例1、2、3的犬实验组1、2、3平均每日可采食至少153.47g的日粮，与犬对照组142.48g比较差异显著。添加了实施例1、2、3的猫实验组1、2、3平均每日可采食至少54.56g的日粮，而猫对照组采食量为43.74g，差异显著。
[0047]
表3宠物犬猫的生长情况
[0048]
组别平均日采食量g/d犬对照组142.48犬实验组1159.25犬实验组2153.47犬实验组3156.93猫对照组43.74
猫实验组159.47猫实验组254.56猫实验组355.93
[0049]
如表4所示，实施例1、2、3均能提高宠物犬猫的消化功能。喂食7天后，添加了实施例1、2、3的犬实验组1、2、3粗蛋白质消化率和粗脂肪消化率最低为81.68％和84.44％，与犬对照组相比，至少提升了19.52％和10.71％。添加了实施例1、2、3的猫实验组1、2、3粗蛋白质消化率和粗脂肪消化率最低为71.87％和73.79％，而猫对照组的粗蛋白质消化率和粗脂肪消化率为59.34％和60.25％，差异十分显著。
[0050]
表4宠物犬猫对粗蛋白质、粗脂肪的消化率
[0051][0052][0053]
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。