一株米卡芬净前体FR901379高产菌株及其应用

一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用。


背景技术：

2.棘白菌素类药物是一种新型抗真菌药物，通过抑制β-1,3-葡聚糖合成酶活性来干扰真菌细胞壁的合成，哺乳动物细胞没有细胞壁，因此该类药物的毒副作用小，且安全性高，对念珠菌属、曲霉菌属及部分对唑类耐药的真菌类均有抗菌活性。现已获得批准上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净(2004年在美国上市)、米卡芬净(2005年在日本上市)和阿尼芬净(2006年在美国上市)，它们都具有相似的非核糖体六元环肽类母核结构，差异仅在于侧链基团、氨基酸连接顺序和后修饰基团的不同。其中，由于米卡芬净前体fr901379具有磺酰基基团，具有极好的水溶性，进而提高了其生物利用度，具有广阔的市场前景。
3.米卡芬净的工业生产包括三步：首先由coleophomaempetri发酵产生fr901379，然后经游他游动链霉菌发酵水解掉脂肪酸侧链，最后通过化学修饰加上4-(5-(4-(戊基氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸甲酯侧链最终生成米卡芬净。其中，棘腔孢霉发酵合成米卡芬净前体fr901379是工业生产的第一步，也是整个工艺的关键核心。高性能的发酵菌株是生产成本控制的关键因素，也是限制该行业准入的技术门槛。生物合成核心途径的代谢工程改造是遗传育种的常用策略，但是，系统分析发现核心途径中可供理性改造的靶点非常有限，且转录组数据显示合成途径中的关键基因相对转录水平都很高，在调控机制不明的情况下，强化关键基因表达的策略很难全面提高合成途径的代谢通量。而菌株的综合发酵性能亟待提高，相关理性改造需要理论指导。相较于理性改造，诱变育种的随机性特点在菌株综合发酵性能改良时更能发挥出优势，尤其是对于相对复杂的多细胞微生物，所以目前工业生产使用的绝大多数放线菌和丝状真菌菌株都是通过诱变育种获得的。重离子辐照具有非常高效的致突变作用，与紫外等其它常用物理诱变源相比，在物理学效应和生物学效应上有很大的不同，具有穿透力强、可处理样品丰富、诱变图谱广泛的独特优势，是一种非常高效的诱变手段。本发明通过重离子辐照诱变、抑菌圈法初筛和摇瓶发酵复筛获得了一株高产、稳定性强的菌株。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种通过诱变得到的高产fr901379的菌株，所述菌株为岩高兰鞘茎点霉(coleophomaempetri)h40-23,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.40075，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。
5.另一方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包括上述菌株。
6.在一个实施方式中，所述菌剂为液体制剂或固体制剂。
7.另一方面，本发明还提供了一种发酵上述菌株的方法，所述方法包括利用培养基
对上述菌株进行发酵的步骤。
8.在一个实施方式中，上述发酵的温度为20℃-40℃，优选，25℃；上述发酵的时间为24h-96h，例如，40h、48h。
9.在一个实施方式中，所述培养基的成分包括玉米淀粉，蛋白胨，(nh4)2so4，kh2po4，feso4·
7h2o，znso4·
7h2o和caco3。
10.另一方面，本发明还提供了上述菌株或菌剂在生产fr901379中的应用。
11.另一方面，本发明还提供了一种制备fr901379的方法，所述方法包括对上述菌株进行发酵的步骤。
12.进一步的，所述制备fr901379的方法还包括分离/纯化所述fr901379的步骤。
13.另一方面，本发明还提供了一种制备米卡芬净的方法，所述方法包括如下步骤：
14.(1)利用本发明所述的菌株制备fr901379；
15.(2)利用步骤(1)得到的fr901379制备米卡芬净。
16.在一个实施方式中，上述步骤(2)可通过以下方式实现：由fr901379经游他游动链霉菌发酵水解掉脂肪酸侧链，最后通过化学修饰加上4-(5-(4-(戊基氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸甲酯侧链最终生成米卡芬净。
17.进一步的，上述制备米卡芬净的方法还包括分离/纯化米卡芬净的步骤。
18.本发明公开了一种米卡芬净前体fr901379高效诱变和快速筛选的方法。首先通过重离子辐照诱变进行了诱变，通过抑菌圈法筛选初筛和摇瓶发酵复筛获得了一株高产、稳定性强的菌株h40-23，该菌株fr901379产量为587.8mg/l，比对照菌株(365.2mg/l)高222mg/l，比诱变前提高了60.8％。
附图说明
19.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。
20.在附图中：
21.图1.米卡芬净前体fr901379生产菌株高通量筛选流程图。
22.图2.辐照剂量对出发菌株cgmcc 21058(mk01)致死率的影响。
23.图3.重离子辐照突变体库中菌落形态多样性。
24.图4.重离子辐照突变菌株fr901379抑菌圈直径初筛结果，其中，图中横线位置为野生型对照菌株的抑菌圈直径。
25.图5.重离子辐照突变菌株fr901379复筛发酵产量，其中，图中横线位置为野生型对照菌株的fr901379产量。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
27.pda固体培养基：39g/l马铃薯土豆培养基pda干粉(bd公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min，待冷却至约60℃制备平板。
28.pdas产孢培养基：39g/l马铃薯土豆培养基pda干粉(bd公司产品，产品目录号：633840)，36.7g/l山梨醇，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min，待冷却至约60℃制备平板。
29.软琼脂培养基：24g/l马铃薯土豆培养基pdb干粉(bd公司产品，产品目录号：7114771)，5g/l琼脂粉，余量为去离子水，115℃高压灭菌30min后50℃保温。
30.种子培养基：15g/l可溶性淀粉，10g/l蔗糖，5g/l棉籽饼粉，10g/l蛋白胨，1g/l kh2po4，2g/l caco3。
31.发酵培养基：30g/l玉米淀粉，30g/l蛋白胨，6g/l(nh4)2so4，1g/l kh2po4，0.3g/l feso4·
7h2o，0.01g/l znso4·
7h2o，2g/l caco3。
32.实施例1.米卡芬净前体fr901379生产菌株高通量筛选方法的建立
33.以coleophomaempetrimk01野生菌株为出发菌株，首先是从-80℃冰箱取出一冻存甘油管，稀释后涂布pda平板，25℃倒置培养3～5d，待单菌落大小合适后用无菌牙签挑取点15cm pda平板，25℃倒置培养4d，然后取8～14h处于对数生长期的白色念珠菌液，用无菌水将其稀释到od
600
＝0.6～1左右，取500μl于不烫手的软琼脂中混匀后覆盖平板，24h后即可测量抑菌圈的直径，且随着时间的延长抑菌圈直径不会发生改变(图1)。其中将单菌落挑取点板生长代替涂布平板后直接喷洒白色念珠菌会防止漏筛，因为单菌落在平板中分布均匀是一种理想状态，通常是很多单菌落连成一片；其次将白色念珠菌混匀到软琼脂中覆盖平板代替用喷壶直接喷洒白色念珠菌会减小误差、防止染菌，另外白色念珠菌是条件致病菌，覆盖代替喷洒会更安全。
34.实施例2.利用重离子辐照诱变对coleophomaempetrimk01进行诱变
35.从-80℃冰箱取出一冻存甘油管，稀释后涂布pdas平板，25℃倒置培养5～8d，使菌株孢子处于成熟状态。取2～3ml无菌生理盐水于pda平板中，用无菌小毛笔刷洗下孢子，将洗下的孢子用300～500目滤布过滤，收集孢子悬浮液并用无菌生理盐水洗涤2～3次，孢子计数仪计数并将其稀释至104～106cfu/ml的孢子悬浮液。
36.吸取1ml孢子悬浮液均匀平铺在无菌的35mm辐照培养皿中，平区辐照，辐照剂量分别为0gy、40gy、80gy、100gy、120gy、140gy、160gy、200gy、500gy、800gy，每个剂量做三个平行。
37.对辐照诱变后的孢子悬浮液保藏20％～50％甘油管-80℃冻存。从-80℃冰箱取出一冻存甘油管，取100～200μl均匀涂布到pda培养基表面，25℃培养5～8d进行平板计数，确定致死率随诱变剂量的变化数值关系。如图2所示，随着诱变剂量的增加，致死率越来越大，在诱变剂量为160gy时致死率为94％。
38.实施例3.诱变后菌株的fr901379抑菌圈直径测定初筛
39.由于coleophomaempetrimk01菌株本身的萌发率就比较低，我们将不同诱变剂量下的菌株稀释到1
×
10-3
cfu/ml梯度后，取100μl～200μl全部均匀涂到pda培养基表面，25℃培养4～6d，在不同的诱变剂量下获得了形态各异的突变菌株，将这些菌株点板后主要出现了三种菌落形态，一种与对照菌株菌落形态一样，另外两种菌落形态分别为小黑而结实、小黑而干瘪(图3)。
40.用无菌牙签挑选单菌落点15cm的pda平板，25℃培养3～4d，将对数生长期的白色念珠菌稀释到od
600
＝0.6～1，取od
600
＝0.6～1的白色念珠适量于不烫手的软琼脂培养基中
混匀后覆盖平板，25℃培养1～7d后检测诱变菌株抑菌圈直径。如图4所示，结果表明通过4批次初筛可以得到90株诱变菌株的抑菌圈直径比出发菌株大(图4a、图4b、图4c、图4d)。
41.实施例4.抑菌圈初筛fr901379高产菌株发酵验证
42.选取81株诱变菌株和对照菌株coleophomaempetrimk01接种于pda固体平板上，25℃培养5～8d。挑取少量的菌丝，利用核酸提取仪对菌丝进行破碎，将破碎后的菌丝接种于50mlcoleophomaempetri的种子培养基，25℃，220rpm，摇床培养40～48h。将上述培养的种子液取5ml～50mlcoleophomaempetri的发酵培养基，25℃，220rpm，摇床培养8d，每个菌株设置3个平行。从每一瓶发酵液中取1ml，加入等体积的甲醇，超声萃取1h，离心，取上清。用0.22μm的有机滤器过滤处理样品，并通过hplc对处理后的样品进行分析。
43.hplc分析方法为：液相色谱柱为agilent c-18反向柱883975-902(4.6
×
150mm，5μm)；流动相为a：0.05％(体积比)三氟乙酸水溶液，流动相b：0.05％(体积比)三氟乙酸乙腈溶液，流速为1ml/min，紫外检测波长：210nm，30℃，总洗脱时间为37min。梯度洗脱条件：0-5min，流动相b占流动相的体积由5％线性上升到24％，5-35min，流动相b占流动相的体积由24％线性上升到62％，35-37min，流动相b占流动相的体积由62％线性上升到100％。结果如图5所示，对以上突变体库中的菌株分为四批次进行了发酵复筛，一批次摇瓶发酵fr901379产量比对照菌株高的有4株(图5a)；二批次摇瓶发酵fr901379产量比对照菌株高的有2株(图5b)；三批次摇瓶发酵fr901379产量比对照菌株高的只有1株，fr901379产量为587.8mg/l，比对照菌株(365.2mg/l)高222mg/l，且其形态为小黑而结实(图5c)；四批次发酵fr901379产量比对照菌株高的有0株(图5d)。我们将第三批次筛选的高产菌株命名为岩高兰鞘茎点霉(coleophomaempetri)h40-23,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.40075，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355，该菌株发酵产fr901379产量为587.8mg/l，比野生型对照菌株(365.2mg/l)高222mg/l，且其单菌落形态为小黑而结实，发酵液不黏稠，菌球形态规则，更加有利于产业化。
44.上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。