水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法

1.本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法。


背景技术：

2.水曲柳(fraxinus mandshurica rupr.)是第三孑遗种，被称为中国东北珍贵的“三大硬阔树种”之一，在国际市场中是一种用途较广的优良用材树种，具有极高的经济和生态价值。然而水曲柳生长期周期长，缺乏遗传转化系统，其发育调控机制的分子基础研究受到很大局限。同时其遗传背景较为复杂，尤其生殖器官的发育出现了显著性改变，其调控模式也不尽相同，使得水曲柳特异基因与特异调控通路的研究无法取得突破。
3.目前以离体再生和遗传转化为基础的现代生物技术手段可以将外源基因导入水曲柳基因组并使之稳定遗传，产生定向变异，实现大幅度遗传改良，缩短育种周期，但是转化率低，无法解决水曲柳高效遗传转化的问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，操作简便，周期短，转化效率高。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，包括以下步骤：将水曲柳的胚性愈伤组织在农杆菌介导作用下进行遗传转化；
7.在所述遗传转化后对所述胚性愈伤组织进行共培养，筛选后获得抗性愈伤组织；
8.将所述抗性愈伤组织进行体胚诱导，得抗性体胚。
9.优选的，所述胚性愈伤组织在进行所述遗传转化前，还包括将胚性愈伤组织接种继代培养基中进行暗培养；所述继代培养基包括以下浓度的组分：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/l k2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20-30g/l蔗糖、100-200mg/l肌醇、400-500mg/l酸水解酪蛋白和3.5-5.5g/l结冷胶，ph＝5.8-6.0。
10.优选的，所述暗培养的温度为25℃，时间为15d。
11.优选的，所述遗传转化包括利用农杆菌侵染液侵染所述胚性愈伤组织；
12.所述农杆菌侵染液的制备方法，包括：将含有目的基因的农杆菌菌株在含有抗生素的yeb固体培养基上倒置暗培养，挑取单菌落，接种于含有相同抗生素的yeb液体培养基内培养至对数期，收集菌体，利用乙酰丁香酮重悬至od
600
＝0.4～0.6，得所述农杆菌侵染液。
13.优选的，所述抗生素包括kan和rif，所述yeb固体培养基和yeb液体培养基中，kan
的浓度均为50mg/l，rif的浓度均为50mg/l。
14.优选的，所述共培养包括吸取所述愈伤组织的表面液体后，接种到共培养基中，所述共培养基包括以下浓度的组分：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/l k2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20-30g/l蔗糖、100-200mg/l肌醇、400-500mg/l酸水解酪蛋白、3.5-5.5g/l结冷胶和20～60μm乙酰丁香酮。
15.优选的，所述共培养为暗培养，所述共培养的时间为2d。
16.优选的，所述筛选包括在筛选培养基中连续筛选培养3次，每次筛选培养的时间为15～20d；
17.所述筛选培养基包括以下浓度的组分：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/l k2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20-30g/l蔗糖、100-200mg/l肌醇、400-500mg/l酸水解酪蛋白、3.5-5.5g/l结冷胶、10mg/l潮霉素和250mg/l头孢噻肟纳。
18.优选的，所述体胚诱导包括将所述抗性愈伤组织接种到体胚诱导培养基上暗培养40～60d；
19.所述体胚诱导培养基包括以下浓度的组分：1mg/l aba、950mg/l kno3、825mg/l nh4no3、85mg/l kh2po4、185mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、22.3mg/l mnso4
·
4h2o、0.83mg/l ki、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、0.025mg/l cocl2·
6h2o、27.85mg/l feso4·
7h2o、37.25mg/l na
2-edta、220mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l vitamin b6、0.1mg/l vitamin b1、0-100g/l蔗糖、100-200mg/l肌醇、400-500mg/l酸水解酪蛋白、4.5-9.5g/l结冷胶和1-2g/l活性炭，ph＝5.8-6.0。
20.优选的，所述暗培养的温度为25℃。
21.有益效果：本发明提供了水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，将体细胞胚胎发生途径与遗传转化技术相结合，利用体胚发生途径能够将遗传转化过程中筛选的抗性愈伤组织进一步发育成体胚，体胚萌发后获得完整的抗性植株，从而获得更高的转化效率，以及获得更纯合的转化植株。利用本发明所述方法，首次通过转基因获得了水曲柳抗性体胚。在本发明实施例中，利用水曲柳的胚性愈伤组织进行所述的遗传转化，转化率为80％以上，最高可达91.17％。
附图说明
22.图1为实施例1水曲柳胚性愈伤组织增殖培养示意图；
23.图2为实施例1水曲柳胚性愈伤组织共培养示意图；
24.图3为实施例1水曲柳胚性愈伤组织抗性筛选示意图；
25.图4为实施例1水曲柳野生型胚性愈伤组织gus组织化学染色示意图；
26.图5为实施例1水曲柳抗性胚性愈伤组织gus组织化学染色示意图；
27.图6为实施例1水曲柳抗性胚性愈伤组织体胚发生示意图。
具体实施方式
28.本发明提供了水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，包括以下步骤：将水曲柳的胚性愈伤组织在农杆菌介导作用下进行遗传转化；
29.在所述遗传转化后对所述胚性愈伤组织进行共培养，筛选后获得抗性愈伤组织；
30.将所述抗性愈伤组织进行体胚诱导，得抗性体胚。
31.本发明将水曲柳的胚性愈伤组织在农杆菌介导作用下进行遗传转化，所述胚性愈伤组织在进行所述遗传转化前，优选还包括将胚性愈伤组织接种继代培养基中进行暗培养。本发明所述继代培养基，优选包括以下浓度的组分：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/l k2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、400mg/l酸水解酪蛋白和3.5g/l结冷胶，ph＝5.8。本发明所述暗培养的温度优选为25℃，时间优选为15d。本发明优选挑选淡黄色，结构松散的水曲柳胚性愈伤组织转入所述继代培养基进行所述暗培养，以继代增殖胚性愈伤，为后续进行不同批次胚性愈伤组织遗传转化提供原材料。本发明中所述水曲柳胚性愈伤组织是参考文章indirect somatic embryogenesis and regeneration of fraxinus mandshurica plants via callus tissue中的方法获得。
32.本发明优选利用经上述继代培养基暗培养后的胚性愈伤组织浸泡在农杆菌侵染液中进行侵染，所述农杆菌侵染液的制备方法，优选包括：将含有目的基因的农杆菌菌株在含有抗生素的yeb固体培养基上倒置暗培养，挑取单菌落，接种于含有相同抗生素的yeb液体培养基内培养至对数期，收集菌体，利用乙酰丁香酮重悬至od
600
＝0.4～0.6，得所述农杆菌侵染液。本发明所述倒置暗培养的温度优选为28℃，时间优选为2d。本发明所述抗生素优选包括kan和rif，所述yeb固体培养基和yeb液体培养基中，kan的浓度均为50mg/l，rif的浓度均为50mg/l。本发明所述侵染优选包括在所述浸泡后，以60-80r/min的速度轻摇20min，使其充分接触进行侵染。
33.本发明在所述侵染后，对愈伤组织和农杆菌进行共培养。本发明优选在所述侵染后，将侵染液倒掉沥干，放到无菌的滤纸上吸去愈伤组织表面多余的菌液，然后转接到共培养基中，在暗培养条件下培养2d。本发明所述共培养基为在上述继代培养基的基础上，添加20～60μm乙酰丁香酮。
34.本发明优选经上述共培养后的愈伤组织转入到筛选培养基中进行筛选培养15～20d，将筛选出来的抗性组织转接到新的筛选培养基中继续筛选15～20d，连续进行3次筛选，获得抗性胚性愈伤组织。本发明所述帅选培养基的基本成分和植物激素种类、浓度与上述继代培养基相同，只需添加10mg/l潮霉素和250mg/l头孢噻肟纳即可。操作时只需将共培养培养基上的愈伤组织用镊子直接转移至筛选培养基上即可。
35.本发明在获得所述抗性愈伤组织后，优选还包括gus化学组织检测，在进行所述检
测时，优选将抗性愈伤组织进行gus化学组织检测，以非转化组织作为阴性对照，显蓝色的组织为转基因抗性愈伤组织，呈淡黄色为对照组织，说明在转基因水曲柳胚性愈伤组织中检测到gus基因的表达。
36.本发明优选将经过上述检测的抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基上，于25℃暗培养40～60d，获得抗性体胚。本发明所述体胚诱导培养基优选包括以下浓度的组分：1mg/l aba、950mg/l kno3、825mg/l nh4no3、85mg/l kh2po4、185mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、22.3mg/ lmnso4
·
4h2o、0.83mg/l ki、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、0.025mg/l cocl2·
6h2o、27.85mg/l feso4·
7h2o、37.25mg/l na
2-edta、220mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l vitamin b6、0.1mg/l vitamin b1、70-100g/l蔗糖、100-200mg/l肌醇、400-500mg/l酸水解酪蛋白、4.5-9.5g/l结冷胶和1-2g/l活性炭，ph＝5.8-6.0。
37.下面结合实施例对本发明提供的水曲柳利用胚性愈伤组织进行遗传转化的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.在本发明实施例中，所使用的培养基分别为：
39.继代培养基：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/lk2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、400mg/l酸水解酪蛋白和3.5g/l结冷胶，ph＝5.8。
40.共培养基：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/l k2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、400mg/l酸水解酪蛋白、3.5g/l结冷胶和20～60μm乙酰丁香酮。
41.筛选培养基：0.15mg/l 2,4-d、0.1mg/l 6-ba、990mg/l k2so4、400mg/l nh4no3、170mg/l kh2po4、370mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、17.05mg/l mnso4·
h2o、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na
2-edta、96mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l vitamin b5、0.5mg/l vitamin b6、1mg/l vitamin b1、20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、400mg/l酸水解酪蛋白、3.5g/l结冷胶、10mg/l潮霉素和250mg/l头孢噻肟纳。
42.体胚诱导培养基：1mg/l aba、950mg/l kno3、825mg/l nh4no3、85mg/l kh2po4、185mg/l mgso4·
7h2o、6.2mg/l h3bo3、8.6mg/l znso4·
7h2o、22.3mg/l mnso4
·
4h2o、0.83mg/l ki、0.25mg/l na2moo4·
2h2o、0.025mg/l cuso4·
5h2o、0.025mg/l cocl2·
6h2o、27.85mg/l feso4·
7h2o、37.25mg/l na
2-edta、220mg/l cacl2·
2h2o、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l vitamin b6、0.1mg/l vitamin b1、70g/l蔗糖、100mg/l肌醇、400mg/l酸水解酪蛋白、4.5g/l结冷胶和1g/l活性炭，ph＝5.8。
43.实施例1
44.利用水曲柳胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，包括：
45.1.水曲柳胚性愈伤组织的继代培养：
46.将水曲柳胚性愈伤组织接种于继代培养基中，25℃暗培养15d。
47.2.农杆菌工作菌液的制备
48.将含有空载(载体菌种为vb191103-1905rcy)的农杆菌菌株在含有kan、rif各50mg/l的yeb固体培养基上28℃倒置暗培养2d。挑取单菌落，接种于含有相同种类和浓度抗生素的yeb液体培养基内，培养至农杆菌生长至对数期，即od
600
＝0.4。
49.3、农杆菌介导的水曲柳遗传转化：
50.将农杆菌菌液，4℃，8000r/min离心5min收集菌体。用含有40μmas悬浮液重新悬浮菌体至od
600
＝0.4，作为侵染液侵染水曲柳胚性愈伤组织，轻摇20min。
51.4.愈伤组织与农杆菌的共培养：
52.用无菌滤纸上吸去胚性愈伤组织表面多余的菌液，转接到共培养基中，在暗培养条件下共培养2d。
53.5.抗性愈伤组织的筛选培养：
54.将上述胚性愈伤组织转入到筛选培养基中筛选培养20d，将筛选出来的抗性组织转接到新的筛选培养基中继续筛选20d，连续3次筛选，获得抗性胚性愈伤组织；
55.6.抗性愈伤组织的检测
56.挑取适量的抗性愈伤组织浸入适量的gus染色液，进行抽真空处理。将组织与染液37℃水浴一周。
57.7.抗性体胚的发生
58.将水曲柳抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，25℃，暗培养40d。
59.在实施例1中，经过连续3次抗性筛选，共获得34个抗性愈伤组织，经gus染色，有31块愈伤组织呈蓝色，染色率为91.17％。
60.实施例2
61.利用水曲柳胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，包括：
62.1.水曲柳胚性愈伤组织的继代培养：
63.将水曲柳胚性愈伤组织接种于继代培养基中，25℃暗培养20d。
64.2.农杆菌工作菌液的制备
65.将含有空载(载体菌种为vb191103-1905rcy)的农杆菌菌株在含有kan、rif各50mg/l的yeb固体培养基上28℃倒置培养2d。挑取单菌落，接种于含有相同种类和浓度抗生素的yeb液体培养基内，培养至农杆菌生长至对数期，即od
600
＝0.6。
66.3、农杆菌介导的水曲柳遗传转化：
67.将农杆菌菌液，4℃，8000r/min离心5min收集菌体。用含有20μmas悬浮液重新悬浮菌体至od
600
＝0.6，作为侵染液侵染水曲柳胚性愈伤组织，轻摇15min。
68.4.愈伤组织与农杆菌的共培养：
69.用无菌滤纸上吸去愈伤组织表面多余的菌液，转接到共培养基中，在暗培养条件下共培养2d。
70.5.抗性愈伤组织的筛选培养：
71.将上述愈伤组织转入到筛选培养基中筛选培养15d，将筛选出来的抗性组织转接
到新的筛选培养基中继续筛选15d，连续3次筛选，获得抗性胚性愈伤组织；
72.6.抗性愈伤组织的检测
73.挑取适量的抗性愈伤组织浸入适量的gus染色液，进行抽真空处理。将组织与染液37℃水浴一周。
74.7.抗性体胚的发生
75.将水曲柳抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，25℃，暗培养50d。
76.在实施例2中，经过连续3次抗性筛选，共获得28个抗性愈伤组织，经gus染色，有24块愈伤组织呈蓝色，染色率为85.71％。
77.实施例3
78.利用水曲柳胚性愈伤组织进行遗传转化的方法，包括：
79.1.水曲柳胚性愈伤组织的继代培养：
80.将水曲柳胚性愈伤组织接种于继代培养基中，25℃暗培养25d。
81.2.农杆菌工作菌液的制备
82.将含有空载(载体菌种为vb191103-1905rcy)的农杆菌菌株在含有kan、rif各50mg/l的yeb固体培养基上28℃倒置培养2d。挑取单菌落，接种于含有相同种类和浓度抗生素的yeb液体培养基内，培养至农杆菌生长至对数期，即od
600
＝0.8。
83.3、农杆菌介导的水曲柳遗传转化：
84.将农杆菌菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体。用含有60μmas悬浮液重新悬浮菌体至od
600
＝0.4，作为侵染液侵染水曲柳胚性愈伤组织，轻摇20min。
85.4.愈伤组织与农杆菌的共培养：
86.用无菌滤纸上吸去胚性愈伤组织表面多余的菌液，转接到共培养基中，在暗培养条件下共培养2d。
87.5.抗性愈伤组织的筛选培养：
88.将上述胚性愈伤组织转入到筛选培养基中筛选培养18d，将筛选出来的抗性组织转接到新的筛选培养基中继续筛选18d，连续3次筛选，获得抗性胚性愈伤组织；
89.6.抗性愈伤组织的检测
90.挑取适量的抗性愈伤组织浸入适量的gus染色液，进行抽真空处理。将组织与染液37℃水浴一周。
91.7.抗性体胚的发生
92.将水曲柳抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中，25℃，暗培养60d。
93.在实施例3中，经过连续3次抗性筛选，共获得38个抗性愈伤组织，经gus染色，有32块愈伤组织呈蓝色，染色率为84.21％。
94.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。