一种特异质肝损伤评价模型及其应用的制作方法

1.本文涉及药物筛选领域，尤其但不限于涉及一种用于特异质肝损伤药物筛选评价模型及该模型在筛查补骨脂中致特异质肝损伤的成分以及筛选可用于治疗补骨脂引起的特异质肝损伤的药物的应用。


背景技术：

2.药物性肝损伤是一种严重的药物不良反应，是药物研发失败或撤市的主要原因。药物特异质肝损伤作为一种难以预测，难以治疗，易复发的肝损伤类型，威胁着病人的生命安全，增加了家庭经济负担。因此，亟待阐明特异性肝损伤的相关科学机制，为临床合理用药、趋利避害提供科学依据。目前有的研究表明，特异质肝损伤具有再次激发迅速发作的特点，是典型的免疫介导反应，组织学检查提示有强烈免疫介导的反应。
3.黑色素瘤缺乏因子2(aim2)样受体(alr)家族，含有一个hin结构域和一个蛋白结构域(pyrin domain，pyd)的aim2炎症小体是alrs家族中第一个在先天免疫感知方面具有特征的蛋白成员。aim2在细胞质中表达，可以于外来的双链dna(dsdna)以及自身的dsdna结合，形成dna-aim2复合体，招募asc和半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1前体(pro-caspase-1)，诱导pro-caspase-1活化，活化的caspase-1一方面可以诱导细胞焦亡，另一方面则可诱导pro-il-1β和pro-il-18剪切活化形成il-1β和il-18，招募中性粒细胞等免疫细胞，从而参与人类众多疾病的发生发展。然而，有关致特异质肝损伤的药物是否可以利用aim2炎症小体活化模型(即在lps刺激下，药物对aim2炎症小体的影响)来进行特异质肝损伤评价尚未见报道。
4.中药特异质肝损伤是中药临床应用中常见的严重不良反应之一，尽管其发生率通常较低，但严重者可致急性肝衰竭甚至死亡，受到医药界、制药业、管理部门及公众的高度重视。中药由于公众对于中药存在“天然安全、无毒副作用”的认识误区，以及其自身成分复杂、研究基础薄弱、联合用药较普遍以及等因素，其肝损伤往往较为隐匿，导致中药特异质肝损伤评价比化药更加困难。
5.补骨脂作为传统无毒补益类中药，始载于《雷公炮炙论》，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。然而，近年来补骨脂及相关制剂致肝损伤现象屡见报道，其中壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊已被国家不良反应中心多次通报。目前已多项关于补骨脂及其相关制剂肝毒性的研究，其中一项研究发现连续灌胃小鼠6个月补骨脂后可见肝脏脂肪变性，结果发现补骨脂存在潜在肝毒性，并与提取工艺、给药剂量和用药疗程存在密切关系；另一项研究表明，高剂量的补骨脂酚可明显引起谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高以及肝脏组织病变。如何客观认识补骨脂致肝损伤问题是当前中药安全性研究的难点。


技术实现要素：

6.以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
7.已有的特异质肝损伤研究多基于传统毒理学评价模式，尚未以机体状态作为核心考量因素。本技术基于特异质肝损伤免疫反应特点及aim2炎症小体在特异质肝损伤中发挥的重要作用，建立了一种药物特异质肝损伤模型，并探讨其应用。
8.具体地，本技术提供了一种免疫特异质肝损伤的评价模型，所述评价模型包括aim2炎症小体以及促进aim2炎症小体活化的成分，其中，促进aim2炎症小体活化的成分为补骨脂酚。
9.本技术还提供了免疫特异质肝损伤的体外评价模型的构建方法，所述构建方法包括：
10.s100.细胞水平评价；
11.s101.补骨脂单体成分样品溶液的制备；
12.s102.制备小鼠原代骨髓巨噬细胞，并加入脂多糖(lps)进行刺激；
13.s103.将步骤s101中制备的溶液加入小鼠原代骨髓巨噬细胞进行刺激；
14.s104.western blot检测aim2炎症小体相关蛋白的表达，elisa检测细胞上清中il-1β、tnf-α的含量，并进行统计学分析。
15.本技术中，所述补骨脂单体成分可以选自异补骨脂素(angelicin)，补骨脂酚(bakuchiol)，补骨脂甲素(bavachin)，补骨脂二氢黄酮甲醚(bavachinin)，补骨脂宁(corylin)，大豆苷(daidzin)，异补骨脂二氢黄酮(isobavachin)，补骨脂乙素(isobavachalcone)，新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone)，补骨脂定(psoralidin)，补骨脂素(psoralen)，5-甲氧补骨脂素(5-mehtoxypsoralen)8-甲氧补骨脂素(8-mehtoxypsoralen)中的任一种或更多种。
16.在本技术中，步骤s100还可以包括：筛选所述补骨脂单体成分中促进aim2炎症小体活化的成分，并以40μm的浓度，进一步验证该成分对aim2炎症小体的活化作用。
17.在本技术中，在步骤s101中，取所述补骨脂单体成分，用二甲基亚砜溶解成40mm，于-20℃储存，备用，临用前用opti-mem稀释至40μm。
18.本技术还提供了免疫特异质肝损伤的体内评价模型的构建方法，所述构建方法包括：
19.s100.细胞水平评价；
20.s101.补骨脂单体成分样品溶液的制备；
21.s102.制备小鼠原代骨髓巨噬细胞，并加入lps进行刺激；
22.s103.将步骤s101中制备的溶液加入小鼠原代骨髓巨噬细胞进行刺激；
23.s104.western blot检测aim2炎症小体相关蛋白的表达，elisa检测细胞上清中il-1β和tnf-α的含量，并进行统计学分析；
24.s200.动物水平评价；
25.s201.小鼠尾静脉注射lps；
26.s202.腹腔注射促进aim2炎症小体活化的成分的溶液；
27.s203.测定血清中alt、ast、il-1β、tnf-α的含量，测定肝脏组织中il-1β、il-18和tnf-α的含量，并进行肝脏h&e染色。
28.在本技术中，所述补骨脂单体成分的给药剂量可以为15mg/kg-30mg/kg，优选地，所述补骨脂单体成分是补骨脂酚。
29.在本技术中，mg/kg指的是每kg动物体重的以mg计的给药量。
30.在本技术中，所述补骨脂单体成分的给药时间为在脂多糖注射之后2小时。
31.在本技术中，脂多糖的给药剂量为2mg/kg。
32.本技术还提供了补骨脂酚作为aim2炎症小体激活剂的应用，例如补骨脂酚作为免疫佐剂的应用。
33.本技术还提供补骨脂酚在评价药物特异质肝损伤中的用途。
34.本技术的优点在于，在该模型方法中，在lps刺激作用下，aim2炎症小体尚未激活，当给予致特异质肝毒性目标成分后，诱导aim2炎症小体激活，促炎因子il-1β大量增加，从而介导为严重的免疫炎症反应，进而诱导肝损伤发生。
35.该模型方法在之前并未用于药物免疫特异质肝损伤的预测及筛选评价。该方法可以用于一系列致免疫特异质肝损伤药物的预测及筛选评价。
36.本技术联合aim2炎症小体激活模型及lps诱导的特异质肝损伤模型，用于免疫特异质肝损伤药物的筛选及评价，并在该方法的指导下，筛查出了补骨脂中具有免疫特异质肝损伤的化学成分为补骨脂酚。
37.本技术的筛选和评价方法简单易行，而且耗费人力财力少，实验周期短，成模率高，适用于药物特异质肝损伤发病机制的研究和特异质肝损伤药物的评价，为药物特异质肝损伤治疗策略的拓展和新药研发提供了一种稳定、可靠的动物模型。
38.本技术提供的基于aim2炎症小体激活模型及lps诱导的特异质肝损伤模型可以快速评价药物的免疫特异质肝毒性，为药物肝毒性评价模型、科学机制的研究以及临床应用提供参考。
39.本技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得明显，或者通过实施本技术而了解。本技术的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
40.附图用来提供对本技术技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本技术的技术方案，并不构成对本技术技术方案的限制。
41.图1：小鼠原代骨髓巨噬细胞中，脂多糖预处理后将培养基换成无血清opti-mem配制而成的补骨脂各单体成分(40μm)后收取细胞上清及细胞裂解液进行相关指标检测。细胞上清检测caspase-1p20的蛋白表达，commassie为上样控制。细胞裂解液检测pro-il-1β、caspase-1p45、nlrp3、asc的蛋白表达，gapdh为上样控制。柱状图分别为细胞上清中白细胞介素1β(il-1β)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)的含量。
42.图2：小鼠骨髓来源巨噬细胞中，脂多糖预处理后将培养基换成无血清opti-mem配制而成的补骨脂酚(10、20、40μm)。细胞上清检测caspase-1p20的蛋白表达，commassie为上样控制。细胞裂解液检测pro-il-1β、caspase-1p45、asc的蛋白表达，laminb为上样控制。柱状图分别为细胞上清中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的含量。
43.图3：小鼠骨髓来源巨噬细胞中，脂多糖预处理后将培养基换成无血清opti-mem配制而成的补骨脂酚(40μm)，分别孵育0.25h，0.5h，1h，2h。细胞上清检测caspase-1p20的蛋白表达，commassie为上样控制。细胞裂解液检测pro-il-1β、caspase-1p45、asc的蛋白表
达，laminb为上样控制。柱状图分别为细胞上清中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的含量。
44.图4：补骨脂酚激活aim2炎症小体而非nlrp3炎症小体。野生型和nlrp3-/-敲除bmdm用lps引发4小时，然后用补骨脂酚处理1小时；bmdm用lps诱导4小时，然后使用多种炎症小体的抑制剂(mcc950、echinatin、odn)处理1小时，然后用补骨脂酚处理1小时。全细胞裂解液(wcl)中pro-caspase-1(p45)、pro-il-1β和asc的蛋白质印迹分析；显示了bmdm培养基上清液中活化的caspase-1(p20)的分泌。考马斯亮蓝染色用作上清液上样对照，而gapdh用作裂解液上样对照。用四种靶向aim2的sirna(sirna#1、#2、#3、#4)或对照rna转染ibmdms 24h，用lps诱导4小时，然后用bak或poly(da:dt)处理1小时，全细胞裂解液(wcl)中pro-caspase-1(p45)、pro-il-1β和asc的蛋白质印迹分析；显示了bmdm培养基上清液中活化的caspase-1(p20)的分泌。柱状图分别为rt-pcr测定各sirna对aim2的抑制效应，elisa试剂盒测定细胞上清中白细胞介素1β。
45.图5：细胞裂解液检测asc，gapdh为上样定量；柱状图分别为ros释放以及jc-1绿色荧光的比列；zeiss lsm800检测线粒体的结构完整性以及aim2(红色荧光)和mtdna(绿色荧光)的定位。
46.图6：小鼠经脂多糖(2mg/kg)尾静脉注射后，给予不同浓度的补骨脂酚(15、30mg/kg)处理后测血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白细胞介素1β、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α的含量，肝大叶用于h&e染色，肝小叶进行蛋白提取后，免疫印迹测定肝组织中caspase-1的激活。
具体实施方式
47.以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
48.已有的特异质肝损伤研究多基于传统毒理学评价模式，尚未以机体状态作为核心考量因素。本研究方法，基于特异质肝损伤免疫反应特点及aim2炎症小体在特异质肝损伤中发挥的重要作用，建立一种药物特异质肝损伤模型，并探讨其应用。本发明要解决的技术问题是提供一种用肝毒物配方诱导，适用于常规实验动物，简单易行，使aim2激活的动物模型，而且耗费人力财力少，实验周期短，成模率高，适用于药物特异质肝损伤发病机制的研究和特异质肝损伤药物的评价，为药物特异质肝损伤治疗策略的拓展和新药研发提供了一种稳定、可靠的动物模型。
49.具体地，本技术提供了一种免疫特异质肝损伤的评价模型，所述评价模型包括aim2炎症小体以及促进aim2炎症小体活化的成分，其中，促进aim2炎症小体活化的成分为补骨脂酚。
50.在本技术中，所述评价模型使用aim2炎症小体以及促进aim2炎症小体活化的成分进行构建。
51.在本技术中，所述评价模型还可以使用aim2炎症小体以及促进aim2炎症小体活化的成分作为标记物进行构建。
52.本技术还提供了免疫特异质肝损伤的体外评价模型的构建方法，所述构建方法包括：
53.s100.细胞水平评价；
54.s101.补骨脂单体样品溶液的制备；
55.s102.制备小鼠原代骨髓巨噬细胞，并加入脂多糖(lps)进行刺激；
56.s103.将步骤s101中制备的溶液加入小鼠原代骨髓巨噬细胞进行刺激；
57.s104.western blot检测aim2炎症小体相关蛋白的表达，elisa检测细胞上清中il-1β和tnf-α的含量，并进行统计学分析。
58.本技术中，所述补骨脂单体成分可以选自异补骨脂素(angelicin)，补骨脂酚(bakuchiol)，补骨脂甲素(bavachin)，补骨脂二氢黄酮甲醚(bavachinin)，补骨脂宁(corylin)，大豆苷(daidzin)，异补骨脂二氢黄酮(isobavachin)，补骨脂乙素(isobavachalcone)，新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone)，补骨脂定(psoralidin)，补骨脂素(psoralen)，5-甲氧补骨脂素(5-mehtoxypsoralen)和8-甲氧补骨脂素(8-mehtoxypsoralen)中的任一种或更多种。
59.在本技术中，步骤s100还可以包括：筛选所述补骨脂中促进aim2炎症小体活化的成分，并以40μm的浓度，进一步验证该成分对aim2炎症小体的活化作用。
60.在本技术中，在步骤s101中，取所述补骨脂单体成分，用二甲基亚砜溶解成40mm，于-20℃储存，备用，临用前用opti-mem稀释至40μm。
61.本技术还提供了免疫特异质肝损伤的体内评价模型的构建方法，所述构建方法包括：
62.s100.细胞水平评价；
63.s101.补骨脂单体样品溶液的制备；
64.s102.制备小鼠原代骨髓巨噬细胞，并加入lps进行刺激；
65.s103.将步骤s101中制备的溶液加入小鼠原代骨髓巨噬细胞进行刺激；
66.s104.western blot检测aim2炎症小体相关蛋白的表达，elisa检测细胞上清中il-1β和tnf-α的含量，并进行统计学分析；
67.s200.动物水平评价；
68.s201.小鼠尾静脉注射lps；
69.s202.腹腔注射促进aim2炎症小体活化的成分的溶液；
70.s203.测定血清中alt、ast、il-1β、tnf-α的含量，测定肝脏组织中il-1β、il-18和tnf-α的含量，并进行肝脏h&e染色。
71.在本技术中，所述补骨脂酚的给药剂量可以为15mg/kg-30mg/k。
72.在本技术中mg/kg指的是每kg动物体重的以mg计的给药量。
73.在本技术中，所述补骨脂酚的给药时间为在脂多糖注射之后2小时。
74.在本技术中，脂多糖的给药剂量为2mg/kg。
75.本技术还提供了补骨脂酚作为aim2炎症小体激活剂的应用，例如补骨脂酚作为免疫佐剂的应用。
76.本技术还提供补骨脂酚在评价药物特异质肝损伤中的用途。
77.为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本技术的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
78.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
79.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
80.材料和方法
81.本研究主要评价补骨脂酚对aim2炎症小体的激活作用，并探讨其激活aim2炎症小体的机制。补骨脂酚对bmdm中aim2炎症小体活化的影响及其潜在作用机制。通过免疫印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光，评估了其激活效果。
82.老鼠(8周龄c57bl/6小鼠)购自spf生物技术有限公司(中国北京)。研究人员对动物实验不知情，随机选择小鼠并分组，将它们安置在特定无菌设施中(12小时/12小时光/暗循环；20
±
2℃)。所有动物实验均经中国人民解放军总医院第五医学中心实验动物福利与伦理委员会批准。
83.试剂
84.补骨脂酚、mcc950和蛋白酶抑制由topscience(中国，上海)获得。超纯lps、dmso、poly(da:dt)和尼日利亚菌素由sigma生产。抗小鼠caspase-1(ag-20b-0042)，24个抗小鼠asc(sc-51441)和抗gapdh(60004-1-1g)来自adipogen(美国)；抗小鼠aim2(66066s)，抗小鼠il-1β(12507)购自bioss(中国)。
85.细胞培养
86.安乐死后将小鼠浸泡在75％的酒精中。在含有fbs(10％[v/v]；gibco,rockford,il,usa)、青霉素/链霉素(1％,100u/ml；sigma,darmstadt,germany)和m-csf(50ng/ml；medchemexpress,monmouth,nj,usa)的dmem(macgene,china,beijing)中培养从股骨中分离出的bmdms。细胞在培养液中第二次补液后2天用于实验。永生化的野生型小鼠骨髓巨噬细胞(ibmdms)在补充有fbs(10％[v/v])和青霉素/链霉素(1％，100微克/毫升)的dmem中培养。所有的细胞在37℃、5％的二氧化碳条件下进行培养。
[0087]
细胞激活
[0088]
将bmdms(1.0
×
106cells/ml)和ibmdms(2.0
×
106cells/ml)在24孔板中播种过夜，更换新鲜培养基，用lps(50ng/ml)刺激4小时，然后，用含有补骨脂酚的opti-mem更换1小时。lipofectamine 2000(sigma)用于转染poly(da:dt)(2μg/ml)到bmdms，激活aim2炎症体。
[0089]
酶标仪检测
[0090]
用小鼠il-1β、小鼠tnf-αelisa试剂盒(中国北京达科威)测定细胞上清液中il-1β和tnf-α的产生。
[0091]
乳酸脱氢酶(ldh)测定
[0092]
ldh的释放反映在细胞热解的发生上。根据制造商的说明，用非活性细胞毒性试验(g1780，progen)评估ldh的产生。
[0093]
用sirnas敲除aim2
[0094]
将ibmdms以1.0
×
106的数量放入24孔板，培养2小时后，用lipofectamine rnaimax试剂(invitrogen,carlsbad,ca,usa)转染针对aim2的sirnas(2mg/ml)或对照sirna(sigma)。转染后24h，用50ng/ml lps刺激ibmdms，4h后，分别用bak和poly(da:dt)刺激细胞。
[0095]
sirna的序列为：
[0096]
#1：aguacuaagaaaucagugadtdt、ucacugauuucuuaguacudtdt；
[0097]
#2：caaaugcucuugaagagaadtdt、uucucuucaagagcauuugdtdt；
[0098]
#3：caguugugguugauguugadtdt、ucaacaucaaccacaacugdtdt；
[0099]
#4：guaugguauacaugauaaadtdt、uuuaucauguauaccauacdtdt。
[0100]
蛋白质印迹(western blot)测定：
[0101]
检测上清中caspase-1(p20)蛋白表达水平，检测细胞裂解液中asc、caspase-1(p45)、pro-il-1β、gapdh、laminb蛋白水平。细胞上清蛋白样品采用12％浓度的sds-page凝胶电泳，细胞裂解液样品采用10％浓度的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接通电源，设定恒定电压80v，1h后电压改为135v，溴酚蓝临近分离胶底部时，结束电泳，安装转印装置。细胞上清液结束电泳后，沿marker 45kda位置裁胶，45kda以上采用考马斯亮蓝染色45min，脱色液(水:甲醇:乙酸(v:v:v)＝5:4:1)，至背景蓝色脱透明；剩余部分转印到pvdf膜上，结束后在5％脱脂奶粉中室温封闭1h，caspase-1(p20)、il-1β、caspase-1(p45)、pro-il-1β、asc、gapdh、laminb抗体4℃摇床孵育过夜后，回收抗体，pvdf膜用1％tbst溶液洗膜3次，每次5min，再与相应标记的鼠或兔来源的二抗(1:5000，按照说明书)溶液进行孵育1h，弃二抗，用1％tbst溶液间隔5min洗膜3次，将显影液a和b两种试剂等体积混合后，立即加到膜上，暗室采用x光胶片压片曝光方式显影。
[0102]
rna表达的检测
[0103]
根据制造商的指示，用trizol试剂(invitrogen)从受刺激的ibmdms或肝组织中提取rna，然后用nanodrop 2000检测rna的浓度。随后，使用starscript ii first-strand cdna synthesis kit(a212-02，genstar，北京，中国)将收费rna转录成cdna，并使用sybr green qpcr master mix(hy-k0522，mce)和引物进行rt-pcr分析。
[0104]
基于lps模型，明确lps/bakuchiol可导致严重的特异质肝脏损伤
[0105]
6-8周c57bl/6雌性小鼠尾静脉注射lps(2mg/kg)，2h后腹腔注射补骨脂酚(15或30mg/kg)6h后小鼠眼眶取血，3500rpm/min离心，测血清中alt、ast的含量；解剖小鼠，肝大叶放入5％福尔马林，肝小叶组织匀浆，提取蛋白he染色检测肝细胞损伤。
[0106]
结果：
[0107]
1.补骨脂多种单体成分对炎症小体活化的影响
[0108]
在bmdms细胞中，先用lps(50ng/ml)处理细胞4h，然后将培养基换成无血清opti-mem配制而成的补骨脂多种单体成分(40μm)，处理1h，收取细胞上清及裂解液进行相关指标检测。从图1中可以看出，lps刺激下，细胞上清中caspase-1、il-1β蛋白未表达，表明炎症小体未激活；在lps、补骨脂单体共同刺激下，细胞上清caspase-1蛋白表达，elisa试剂盒il-1β的含量测定结果显示补骨脂酚、补骨脂定均促进炎症小体激活。说明该模型能评价特异质肝损伤药物或成分，并可用于致特异质肝损伤相关药物或成分的筛选及评价。
[0109]
2.补骨脂酚剂量依赖性地诱导caspase-1成熟和产生il-1β和tnf-α，确认了bak诱导的炎症体激活的上调效应。
[0110]
3.补骨脂酚时间依赖性地诱导caspase-1成熟和产生il-1β和tnf-α，确认了bak诱导的炎症体激活的上调效应。
[0111]
4.补骨脂酚在野生型和aim2-/-bmdms均可以激活caspase-1的活化。echinatin、mcc950均不影响补骨脂酚诱导的caspase-1成熟和il-1β的分泌。相反，odn(被称为特异性aim2炎症体抑制剂)可以明显抑制bak诱导的炎症体激活。此外，ibmdm转染sirnas(靶向
aim2或对照)四种不同的sirna(sirna#1、#2、#3、#4)24小时后，用lps诱导4h，然后补骨脂酚或poly(da:dt)处理30min，结果表明sirna(sirna#2、#3、#4)具有显著的aim2的抑制效果，同时，靶向aim2的sirna，而不是对照rna，显著性抑制补骨脂酚和poly(da:dt)诱导的caspase-1的成熟以及il-1β的产生。
[0112]
5.补骨脂酚作用于炎症小体激活上游，促进asc寡聚化，诱导mtdna释放以及随后被aim2受体结合从而激活aim2炎症小体。
[0113]
补骨脂酚诱导asc寡聚化；补骨脂酚可诱导线粒体损伤；在jc-1试剂盒在线粒体膜电位降低时显绿色荧光，随着补骨脂酚的浓度的增加绿色荧光增加，表明补骨脂酚可减少线粒体膜电位；此外补骨脂酚还可浓度依赖地诱导线粒体ros的产生；lps诱导的bmdm，用补骨脂酚以及阳性药poly(da:dt)处理半小时后，分别加入dna抗体(绿色)以及aim2抗体(红色)，补骨脂酚与阳性药种，dna与aim2形成共定位，但阴性对照组没有。表明补骨脂酚通过促进mtdna释放从而诱导aim2炎症小体激活。
[0114]
6.lps诱导的特异质肝损伤模型进一步确证补骨脂中致特异质肝损伤标志物
‑‑
补骨脂酚的肝损伤作用
[0115]
与对照组相比，lps组血清alt、ast、il-1β及tnf-α显著升高(p＜0.05)，肝脏caspase-1激活较弱，肝组织表现轻微损伤。而单独给药组(15、30mg/kg)与对照组相比无显著性差异。单独给药组(100mg/kg)与对照组相比，血清ast，il-1β及tnf-α无变化，肝脏caspase-1未激活，肝组织未见损伤，提示该浓度的补骨脂酚没有产生肝脏毒性。而与lps组相比，lps 给药组(15、30mg/kg)血清alt、ast、il-1β及tnf-α显著升高(p＜0.001)，随着浓度增加肝脏caspase-1表达增加同时伴随着肝组织损伤加重，说明在lps诱导的特异质肝损伤模型中，补骨脂酚导致肝脏损伤，且这种损伤伴随着炎症因子il-1β及tnf-α的升高，表明补骨脂酚确实是导致补骨脂免疫特异质肝损伤的主要化学成分。
[0116]
本技术描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本技术所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征或要素可以与任何其它实施例中的任何其他特征或要素结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或要素。