一种荧光定量PCR检测流感病毒滴度的方法与流程

一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法
技术领域
1.本发明涉及病毒滴度检测技术领域，具体为一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法。


背景技术：

2.流行性感冒简称流感，是流感病毒引起的急性呼吸道感染；流行性感冒病毒(influenzavirus)是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒。流感病毒有四种类型:a型、b型、c型和d型，对人类有影响的主要是a型、b型和c型。其中甲型(a型)流感病毒是唯一已知会导致全球流感大流行的一种传播性强的流感病毒；乙型流感病毒只有一个亚型,宿主特异性较强,至今只发现感染人和海豹。
3.丙型(c型)流感感染通常导致轻微疾病，不会导致人类流感大流行。2018年6月11日，四价流感病毒裂解疫苗在我国上市,甲型h1n1流感病毒、甲型h3n2流感病毒、乙型bv型和乙型by型成为了此次研究的对象。
4.根据中国药典2020版，流感病毒的病毒滴度的检测用的是鸡胚eid50法；但该方法检测时间较长，一般检测一次要用3
‑
4天时间，且结果重复性差，通常波动范围在
±
1.0，对于关键数据需要多次测定确定其滴度，实用性较差。
5.基于上述情况，本技术公开了一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，以解决该技术问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
8.一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，包括以下步骤：
9.(1)提取待测样品rna：
10.(2)配制pcr反应液；
11.(3)取待测样品rna和标准品，稀释后分别加入pcr反应液中，并通过荧光pcr扩增仪进行扩增检测，分别得到待测样品的扩增曲线和标准品的标准曲线；
12.(4)分析待测样品的扩增曲线并计算对应的ct值，判断样品的阴阳性；并根据ct值基于标准曲线计算待测样品的拷贝数，通过拷贝数计算病毒浓度，转换得到病毒滴度。
13.在判断待测样品的阴阳性时，通过以下标准判断：
14.阳性：ct≦35且曲线呈s型。
15.阴性：ct﹥38或者未检出。
16.35﹤ct值≦38：需重复检测，ct值仍在此区间且呈标准s型且有明显指数增长期，则判断为阳性，否则判断为阴性。
17.较优化的方案，步骤(2)中，配制pcr反应液具体步骤为：
18.取流感病毒反应液4ul、rt
‑
pcr反应液7.5ul、酶混合液5ul、去rna酶水3.5ul，配制得到pcr反应液。
19.较优化的方案，选取甲型流感病毒反应液时，其中包括：rt
‑
pcr缓冲液、上游引物、下游引物和荧光探针，上游引物的基因序列如seqidno.1所示；下游引物的序列如seqidno.2所示；荧光探针的基因序列如seqidno.3所示。荧光探针两端分别带有荧光素和猝灭基团，具体为fam
‑
tcaggccccctcaaagccga
‑
bhq1。
20.较优化的方案，选取甲型流感病毒反应液时，pcr扩增片段序列如seqidno.4所示。
21.较优化的方案，选取乙型流感病毒反应液时，其中包括：rt
‑
pcr缓冲液、上游引物、下游引物和荧光探针，上游引物的基因序列如seqidno.5所示；下游引物的序列如seqidno.6所示；荧光探针的基因序列如seqidno.7所示；荧光探针两端分别带有荧光素和猝灭基团，具体为fam
‑
attcgagcagctgaaactgcggtg
‑
bhq1。
22.较优化的方案，选取乙型流感病毒反应液时，pcr扩增片段序列如seqidno.8所示。
23.较优化的方案，步骤(3)中，扩增反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火、延伸40秒，共45循环；降温至55℃后保持20秒，升温至95℃，升温时收集荧光信号。
24.较优化的方案，步骤(2)中，酶混合液为逆转录酶和taq酶以体积比为1：1混合组成。
25.较优化的方案，步骤(1)中，提取待测样品rna具体步骤为：
26.①
取病毒样品，加入裂解液，充分混匀后室温放置5min，再在裂解好的样本溶液中加入缓冲液，充分混匀后转移混合液到套有接液管的亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
27.②
再加入500μl漂洗液到亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
28.③
重复
②
步骤；
29.④
将亲和柱套入接液管中，13000r/min离心2分钟，弃掉接液管和滤过液；再将亲和柱套入新的离心管中，向亲和柱底部吸附膜的中心部位加入50μl洗脱液，室温放置2min，13000r/min离心2min，得到待测样品rna。
30.较优化的方案，步骤(4)中，拷贝数与病毒浓度的计算公式为：
31.拷贝数＝核酸浓度
×
10
‑9×
6.02
×
10
23
/(碱基数
×
340)。
32.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
33.现有技术中，流感病毒的病毒滴度检测大多采用鸡胚eid50法，但该方法检测时间较长，且结果重复性差，通常波动范围在
±
1.0，对于关键数据需要多次测定确定其滴度，实用性较差，而本技术采用rt
‑
pcr法定量检测流感病毒，根据样品检测所得ct值与标准曲线相比较，并得到样品的物理滴度，从而量比转化为样品的病毒滴度，该方法能够在对样品定性的同时进行定量检测，测得的滴度更精准，波动范围在0.5以内，重复性高。
34.本发明公开的荧光定量pcr法检测用时只需4
‑
5h，结果重复性好，检测范围波动控制在0.5以内最低检测限为10拷贝；本发明建立了一种更加便捷高效的病毒滴度检测替代方法，有效解决了eid50方法检测耗时长，结果波动大，重复性不好等问题，pcr法耗时更短，更加精准高效，更适用于病毒滴度的检测，实用性更高。
具体实施方式
35.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例1：
37.一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，包括以下步骤：
38.(1)提取待测样品rna：
39.①
取病毒样品，加入裂解液，充分混匀后室温放置5min，再在裂解好的样本溶液中加入缓冲液，充分混匀后转移混合液到套有接液管的亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
40.②
再加入500μl漂洗液到亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
41.③
重复
②
步骤；
42.④
将亲和柱套入接液管中，13000r/min离心2分钟，弃掉接液管和滤过液；再将亲和柱套入新的离心管中，向亲和柱底部吸附膜的中心部位加入50μl洗脱液，室温放置2min，13000r/min离心2min，得到待测样品rna。
43.(2)配制pcr反应液；
44.取流感病毒反应液4ul、rt
‑
pcr反应液7.5ul、酶混合液5ul、去rna酶水3.5ul，配制得到pcr反应液。酶混合液为逆转录酶和taq酶以体积比为1：1混合组成。
45.(3)取待测样品rna和标准品，稀释后分别加入pcr反应液中，并通过荧光pcr扩增仪进行扩增检测，分别得到待测样品的扩增曲线和标准品的标准曲线；扩增反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火、延伸40秒，共45循环；降温至55℃后保持20秒，升温至95℃，升温时收集荧光信号。
46.(4)分析待测样品的扩增曲线并计算对应的ct值，判断样品的阴阳性；并根据ct值基于标准曲线计算待测样品的拷贝数，通过拷贝数计算病毒浓度，转换得到病毒滴度。
47.本方案中病毒样品采用甲型流感病毒a1 ivr
‑
215毒株，pcr反应液中流感病毒反应液为甲型流感病毒反应液，其中包括：rt
‑
pcr缓冲液、上游引物、下游引物和荧光探针，上游引物的基因序列如seqidno.1所示；下游引物的序列如seqidno.2所示；荧光探针的基因序列如seqidno.3所示；pcr扩增片段序列如seqidno.4所示。
48.1、以实施例1为实验方法，分别取不同浓度的待测样品rna并标记为a1
‑
001、a1
‑
002、a1
‑
003、a1
‑
004、a1
‑
005，以待测样品rna的稀释倍数为变量，进行参照试验，所有试验中标准品用10
‑5稀释后的稀释液做标准曲线。
49.具体检测结果为：
[0050][0051]
由此可知：上述检测过程中，待测样品的ct值均≦35且曲线呈s型，呈现阳性。
[0052]
2、取不同浓度的待测样品a1
‑
001、a1
‑
002、a1
‑
003、a1
‑
004、a1
‑
005，分别通过本方案公开的rt
‑
pcr法、常规鸡胚eid50法检测其病毒滴度，每个待测样品检测3次，具体数据如下：
[0053][0054][0055]
由此可知：通过本发明公开的rt
‑
pcr法检测时，其数据重复性更好，准确度更高，而常规鸡胚eid50法检测数据时明显波动较大，数据重复性差。
[0056]
实施例2：
[0057]
一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，包括以下步骤：
[0058]
(1)提取待测样品rna：
[0059]
①
取病毒样品，加入裂解液，充分混匀后室温放置5min，再在裂解好的样本溶液中加入缓冲液，充分混匀后转移混合液到套有接液管的亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
[0060]
②
再加入500μl漂洗液到亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
[0061]
③
重复
②
步骤；
[0062]
④
将亲和柱套入接液管中，13000r/min离心2分钟，弃掉接液管和滤过液；再将亲和柱套入新的离心管中，向亲和柱底部吸附膜的中心部位加入50μl洗脱液，室温放置2min，13000r/min离心2min，得到待测样品rna。
[0063]
(2)配制pcr反应液；
[0064]
取流感病毒反应液4ul、rt
‑
pcr反应液7.5ul、酶混合液5ul、去rna酶水3.5ul，配制得到pcr反应液。酶混合液为逆转录酶和taq酶以体积比为1：1混合组成。
[0065]
(3)取待测样品rna和标准品，稀释后分别加入pcr反应液中，并通过荧光pcr扩增仪进行扩增检测，分别得到待测样品的扩增曲线和标准品的标准曲线；扩增反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火、延伸40秒，共45循环；降温至55℃后保持20秒，升温至95℃，升温时收集荧光信号。
[0066]
(4)分析待测样品的扩增曲线并计算对应的ct值，判断样品的阴阳性；并根据ct值基于标准曲线计算待测样品的拷贝数，通过拷贝数计算病毒浓度，转换得到病毒滴度。
[0067]
本方案中病毒样品采用甲型流感病毒a3 ivr
‑
208毒株，pcr反应液中流感病毒反应液为甲型流感病毒反应液，其中包括：rt
‑
pcr缓冲液、上游引物、下游引物和荧光探针，上游引物的基因序列如seqidno.1所示；下游引物的序列如seqidno.2所示；荧光探针的基因序列如seqidno.3所示；pcr扩增片段序列如seqidno.4所示。
[0068]
3、以实施例2为实验方法，分别取不同浓度的待测样品rna并标记为a3
‑
001、a3
‑
002、a3
‑
003、a3
‑
004、a3
‑
005，以待测样品rna的稀释倍数为变量，进行参照试验，所有试验中标准品用10
‑5稀释后的稀释液做标准曲线。
[0069]
具体检测结果为：
[0070][0071]
由此可知：上述检测过程中，待测样品的ct值均≦35且曲线呈s型，呈现阳性。
[0072]
4、取不同浓度的待测样品a3
‑
001、a3
‑
002、a3
‑
003、a3
‑
004、a3
‑
005，分别通过本方案公开的rt
‑
pcr法、常规鸡胚eid50法检测其病毒滴度，每个待测样品检测3次，具体数据如下：
[0073][0074]
由此可知：通过本发明公开的rt
‑
pcr法检测时，其数据重复性更好，准确度更高，而常规鸡胚eid50法检测数据时明显波动较大，数据重复性差。
[0075]
实施例3：
[0076]
一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，包括以下步骤：
[0077]
(1)提取待测样品rna：
[0078]
①
取病毒样品，加入裂解液，充分混匀后室温放置5min，再在裂解好的样本溶液中加入缓冲液，充分混匀后转移混合液到套有接液管的亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
[0079]
②
再加入500μl漂洗液到亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
[0080]
③
重复
②
步骤；
[0081]
④
将亲和柱套入接液管中，13000r/min离心2分钟，弃掉接液管和滤过液；再将亲和柱套入新的离心管中，向亲和柱底部吸附膜的中心部位加入50μl洗脱液，室温放置2min，13000r/min离心2min，得到待测样品rna。
[0082]
(2)配制pcr反应液；
[0083]
取流感病毒反应液4ul、rt
‑
pcr反应液7.5ul、酶混合液5ul、去rna酶水3.5ul，配制得到pcr反应液。酶混合液为逆转录酶和taq酶以体积比为1：1混合组成。
[0084]
(3)取待测样品rna和标准品，稀释后分别加入pcr反应液中，并通过荧光pcr扩增仪进行扩增检测，分别得到待测样品的扩增曲线和标准品的标准曲线；扩增反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火、延伸40秒，共45循环；降温至55℃后保持20秒，升温至95℃，升温时收集荧光信号。
[0085]
(4)分析待测样品的扩增曲线并计算对应的ct值，判断样品的阴阳性；并根据ct值基于标准曲线计算待测样品的拷贝数，通过拷贝数计算病毒浓度，转换得到病毒滴度。
[0086]
本方案中病毒样品采用乙型流感病毒bv bvr
‑
11毒株，pcr反应液中流感病毒反应液为甲型流感病毒反应液，其中包括：rt
‑
pcr缓冲液、上游引物、下游引物和荧光探针，上游引物的基因序列如seqidno.5所示；下游引物的序列如seqidno.6所示；荧光探针的基因序列如seqidno.7所示。pcr扩增片段序列如seqidno.8所示。
[0087]
5、以实施例3为实验方法，分别取不同浓度的待测样品rna并标记为bv
‑
001、bv
‑
002、bv
‑
003、bv
‑
004、bv
‑
005，以待测样品rna的稀释倍数为变量，进行参照试验，所有试验中标准品用10
‑5稀释后的稀释液做标准曲线。
[0088]
具体检测结果为：
[0089]
[0090][0091]
由此可知：上述检测过程中，待测样品的ct值均≦35且曲线呈s型，呈现阳性。
[0092]
6、取不同浓度的待测样品bv
‑
001、bv
‑
002、bv
‑
003、bv
‑
004、bv
‑
005，分别通过本方案公开的rt
‑
pcr法、常规鸡胚eid50法检测其病毒滴度，每个待测样品检测3次，具体数据如下：
[0093][0094]
由此可知：通过本发明公开的rt
‑
pcr法检测时，其数据重复性更好，准确度更高，而常规鸡胚eid50法检测数据时明显波动较大，数据重复性差。
[0095]
实施例4：
[0096]
一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，包括以下步骤：
[0097]
(1)提取待测样品rna：
[0098]
①
取病毒样品，加入裂解液，充分混匀后室温放置5min，再在裂解好的样本溶液中加入缓冲液，充分混匀后转移混合液到套有接液管的亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
[0099]
②
再加入500μl漂洗液到亲和柱，13000r/min离心30秒，弃掉滤过液；
[0100]
③
重复
②
步骤；
[0101]
④
将亲和柱套入接液管中，13000r/min离心2分钟，弃掉接液管和滤过液；再将亲和柱套入新的离心管中，向亲和柱底部吸附膜的中心部位加入50μl洗脱液，室温放置2min，13000r/min离心2min，得到待测样品rna。
[0102]
(2)配制pcr反应液；
[0103]
取流感病毒反应液4ul、rt
‑
pcr反应液7.5ul、酶混合液5ul、去rna酶水3.5ul，配制
得到pcr反应液。酶混合液为逆转录酶和taq酶以体积比为1：1混合组成。
[0104]
(3)取待测样品rna和标准品，稀释后分别加入pcr反应液中，并通过荧光pcr扩增仪进行扩增检测，分别得到待测样品的扩增曲线和标准品的标准曲线；扩增反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火、延伸40秒，共45循环；降温至55℃后保持20秒，升温至95℃，升温时收集荧光信号。
[0105]
(4)分析待测样品的扩增曲线并计算对应的ct值，判断样品的阴阳性；并根据ct值基于标准曲线计算待测样品的拷贝数，通过拷贝数计算病毒浓度，转换得到病毒滴度。
[0106]
本方案中病毒样品采用乙型流感病毒by1 bx
‑
57l毒株，pcr反应液中流感病毒反应液为甲型流感病毒反应液，其中包括：rt
‑
pcr缓冲液、上游引物、下游引物和荧光探针，上游引物的基因序列如seqidno.5所示；下游引物的序列如seqidno.6所示；荧光探针的基因序列如seqidno.7所示。pcr扩增片段序列如seqidno.8所示。
[0107]
7、以实施例4为实验方法，分别取不同浓度的待测样品rna并标记为by1 ws、by1 ms，以待测样品rna的稀释倍数为变量，进行参照试验，所有试验中标准品用10
‑5稀释后的稀释液做标准曲线。
[0108]
具体检测结果为：
[0109][0110]
由此可知：上述检测过程中，待测样品的ct值均≦35且曲线呈s型，呈现阳性。
[0111]
8、取不同浓度的待测样品by1 ws、by1 ms，分别通过本方案公开的rt
‑
pcr法、常规鸡胚eid50法检测其病毒滴度，每个待测样品检测3次，具体数据如下：
[0112][0113]
由此可知：通过本发明公开的rt
‑
pcr法检测时，其数据重复性更好，准确度更高，而常规鸡胚eid50法检测数据时明显波动较大，数据重复性差。
[0114]
结论：本发明公开了一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法，该方法的检测用时只需4
‑
5h，结果重复性好，检测范围波动控制在0.5以内最低检测限为10拷贝；本发明建立了一种更加便捷高效的病毒滴度检测替代方法，有效解决了eid50方法检测耗时长，结果波动大，重复性不好等问题，pcr法耗时更短，更加精准高效，更适用于病毒滴度的检测，实用性更高。
[0115]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。