共培养装置、共培养系统及共培养方法

1.本发明涉及共培养装置、共培养系统及共培养方法。


背景技术：

2.以调查药物动态、药物代谢等为目的，正在推进模拟肠内环境等的器件的开发。在专利文献1(国际公开第2018/079793号)中，公开了将在多孔质膜上播种了肠道上皮细胞的设备配置在厌氧腔室内来模拟肠内环境的系统。


技术实现要素：

3.在包含专利文献1的现有技术中，难以历时性地评价在厌氧环境中流动的培养基以及在好氧环境中流动的培养基这两者。
4.本发明提供一种共培养装置、共培养系统及共培养方法，能够历时性地评价在厌氧环境中流动的培养基以及在好氧环境中流动的培养基这两者。
5.本发明的共培养装置具备：第1密闭容器；共培养器件，配置于第1密闭容器外；第1培养基源，配置于第1密闭容器内，贮存有第1培养基；第2培养基源，贮存有溶解氧浓度比第1培养基低的第2培养基；第1导管，与共培养器件和第1培养基源连接。共培养器件具有：膜，包含第1主面以及位于第1主面的相反侧且用于培养细胞的第2主面；第1流路，配置为一部分由第1主面划分，且供第1培养基流动；第2流路，配置为一部分由第2主面划分，且供第2培养基流动。第1流路的入口与第1导管连接。
6.本发明的共培养系统具备厌氧腔室和配置于厌氧腔室内的上述共培养装置。
7.本发明的共培养方法具备：在厌氧腔室内配置共培养装置的工序，所述共培养装置具有包含第1主面以及位于第1主面的相反侧且用于培养细胞的第2主面的膜、一部分由第1主面划分的第1流路、一部分由第2主面划分的第2流路；向第1流路供给第1培养基的工序；向第2流路供给溶解氧浓度比第1培养基低的第2培养基的工序。被供给至第1流路的第1培养基在厌氧腔室内以好氧环境被保持。
8.本发明的上述以及其他目的、特征、方面及优点将通过联系附图理解的与本发明相关的以下详细说明来阐明。
附图说明
9.图1是实施方式的共培养系统的示意性的剖视图。
10.图2是共培养器件10的分解立体图。
11.图3是用于对第1保持件17a和第2保持件17b向共培养器件10的安装状态进行说明的分解立体图。
12.图4是实施方式的共培养方法的工序图。
13.图5是比较例的共培养系统的示意性的剖视图。
14.图6是第1变形例的共培养系统的示意性的剖视图。
15.图7是第2变形例的共培养系统的示意性的剖视图。
具体实施方式
16.参照附图对实施方式的详细情况进行说明。在以下的附图中，对相同或相当的部分标注相同的附图标记，不再反复进行重复的说明。
17.(实施方式的共培养系统)
18.以下，对实施方式的共培养系统进行说明。
19.《实施方式的共培养系统的概略构成》
20.图1是实施方式的共培养系统的示意性的剖视图。如图1所示，实施方式的共培养系统具有共培养器件10和第1密闭容器20。实施方式的共培养系统具有第1培养基容器30a、第2培养基容器30b、第3培养基容器30c和第4培养基容器30d。实施方式的共培养系统具有第1管40a、第2管40b、第3管40c和第4管40d。
21.实施方式的共培养系统具有第1泵50a、第2泵50b以及经上皮电阻测量装置60。
22.共培养器件10具有第1面10a和第2面10b。第1面10a朝向第1密闭容器20侧。第2面10b位于第1面10a的相反侧。共培养器件10在内部具有膜11、第1流路12和第2流路13。共培养器件10配置于第1密闭容器20外。
23.膜11具有第1主面11a和第2主面11b。第2主面11b位于第1主面11a的相反侧。第2主面11b是用于培养细胞的膜11的面。在第2主面11b上培养的细胞例如为在第2主面11b上形成紧密连接(tight junction)的肠道上皮细胞。在第2主面11b上培养的细胞的具体例为caco-2细胞。
24.膜11例如为聚碳酸酯制的径迹蚀刻(track etch)膜。膜11例如也可以是由pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯)等其他材料形成的多孔质膜或胶原蛋白凝胶膜。膜11只要能够在第2主面11b进行细胞培养，能够进行来自第1主面11a的氧和养分的供给，则没有特别限定。
25.第1流路12的一部分由第1主面11a划分。第2流路13的一部分由第2主面11b划分。第1流路12是供第1培养基80a流动的流路，第2流路13是供第2培养基80b流动的流路。
26.第2培养基80b中的溶解氧浓度低于第1培养基80a中的溶解氧浓度。即，第1培养基80a为好氧培养基，第2培养基80b为厌氧培养基。第2培养基80b可以包含菌。第2培养基80b中包含的菌例如为厌氧性菌。
27.在第1培养基80a在第1流路12流动的期间，第1培养基80a中的氧通过膜11被供给至在第2主面11b上培养的细胞。因此，即使第2培养基80b中的溶解氧浓度低，也能够维持在第2主面11b上培养的细胞。
28.第1密闭容器20是能够将其内部空间密闭的容器。第1密闭容器20的内部空间被保持为好氧环境。更具体而言，第1密闭容器20的内部空间被保持为大气环境。第1密闭容器20具有主体部21和盖22。主体部21为筒状。主体部21的下端由底壁封闭，主体部21的上端开口。盖22可拆装地安装于主体部21的上端。在盖22形成有沿厚度方向贯通盖22的贯通孔22a。另外，在第1密闭容器20内，也可以配置有非接触氧监测器(例如，能够通过照射激发光进行氧量的测量的点传感器)。由此，能够确认第1密闭容器20内的剩余氧量。
29.在第1培养基容器30a内贮存有第1培养基80a。第1培养基容器30a和第1流路12的入口通过第1管40a连接。第1管40a配置于第1密闭容器20内。第1管40a通过贯通孔22a将第1
培养基容器30a与第1流路12的入口连接。
30.在第2培养基容器30b内贮存有第2培养基80b。第2培养基容器30b与第2流路13的入口通过第2管40b连接。第2管40b配置于第1密闭容器20外。第1流路12的入口位于第1面10a。第2流路13的入口位于第2面10b。
31.第3培养基容器30c与第1流路12的出口通过第3管40c连接。第4培养基容器30d和第2流路13的出口通过第4管40d连接。第3管40c和第4管40d配置在第1密闭容器20外。第1流路12的出口位于第2面10b。第2流路13的出口位于第2面10b。
32.第1泵50a将贮存于第1培养基容器30a的第1培养基80a经由第1管40a供给至第1流路12。第1泵50a将从第1流路12排出的第1培养基80a经由第3管40c供给至第3培养基容器30c。第1泵50a安装于第1管40a。即，第1泵50a配置于第1密闭容器20内。但是，第1泵50a也可以配置于第1密闭容器20外(也可以安装于第3管40c)。
33.第2泵50b将贮存于第2培养基容器30b的第2培养基80b经由第2管40b供给至第2流路13。第2泵50b将从第1流路12排出的第2培养基80b经由第4管40d供给至第4培养基容器30d。第2泵50b安装于第2管40b。即，第2泵50b配置于第1密闭容器20外。但是，第2泵50b也可以安装于第4管40d。
34.第1管40a、第2管40b、第3管40c及第4管40d例如是由ptfe(聚四氟乙烯)、peek(聚醚醚酮)、有机硅等形成的管。第1泵50a例如是环泵，第2泵50b例如是环泵。
35.共培养器件10具有第1电极14a和第2电极14b。经上皮电阻测量装置60与第1电极14a及第2电极14b电连接。由此，经上皮电阻测量装置60对在第1流路12流动的第1培养基80a与在第2流路13流动的第2培养基80b之间的电阻值进行测量。
36.由于在第2主面11b上培养的细胞形成了紧密连接的情况下该电阻值变高，在第2主面11b上培养的细胞没有形成紧密连接的情况下该电阻值变低，因此，通过利用经上皮电阻测量装置60测量该电阻值，能够监测在第2主面11b上培养的细胞的状态。
37.厌氧腔室70内被保持为厌氧环境。在厌氧腔室70内配置有实施方式的共培养装置。
38.《共培养器件10的详细构成》
39.图2是共培养器件10的分解立体图。如图2所示，共培养器件10具有层叠了膜11、第1玻璃板15a、第2玻璃板15b、第1片材16a和第2片材16b的结构。第1片材16a和第2片材16b例如由树脂材料形成。该树脂材料的具体例为有机硅橡胶。
40.第1玻璃板15a配置于第1面10a侧。在第1玻璃板15a形成有贯通孔15aa。贯通孔15aa沿厚度方向贯通第1玻璃板15a。贯通孔15aa成为第1流路12的入口。
41.第2玻璃板15b配置于第2面10b侧。在第2玻璃板15b形成有贯通孔15ba、贯通孔15bb及贯通孔15bc。贯通孔15ba成为第2流路13的入口。贯通孔15bb成为第1流路12的出口。贯通孔15bc成为第2流路13的出口。
42.膜11被夹在第1片材16a与第2片材16b之间。膜11的第1主面11a朝向第1片材16a侧，膜11的第2主面11b朝向第2片材16b侧。第1片材16a和第2片材16b除了夹着膜11的部分以外相互接触。
43.第1片材16a及第2片材16b被夹在第1玻璃板15a与第2玻璃板15b之间。第1片材16a与第1玻璃板15a接触。第2片材16b与第2玻璃板15b接触。
44.虽然未图示，但在第1玻璃板15a的第1片材16a侧的面形成有第1电极14a，在第2玻璃板15b的第2片材16b侧的面形成有第2电极14b。第1电极14a和第2电极14b例如由白金形成。第1电极14a和第2电极14b例如通过溅射法形成。
45.在第1片材16a的第1玻璃板15a侧的面形成有沟槽16aa。沟槽16aa位于与贯通孔15aa重叠的位置。在第1片材16a形成有贯通孔16ab及贯通孔16ac。贯通孔16ab及贯通孔16ac沿厚度方向贯通第1片材16a。贯通孔16ab及贯通孔16ac位于与沟槽16aa重叠的位置。
46.在第2片材16b的第2玻璃板15b侧的面形成有沟槽16ba。沟槽16ba位于与贯通孔15ba及贯通孔15bc重叠的位置。
47.在第2片材16b形成有贯通孔16bb及贯通孔16bc。贯通孔16bb及贯通孔16bc沿厚度方向贯通第2片材16b。贯通孔16bb位于与沟槽16ba重叠的位置。贯通孔16bb位于与贯通孔16ab重叠的位置。贯通孔16ab及贯通孔16bb由膜11封闭。贯通孔16bc位于与贯通孔15bb及贯通孔16ac重叠的位置。
48.贯通孔15aa、沟槽16aa、贯通孔16ac、贯通孔16bc、贯通孔15bb及膜11的第1主面11a构成第1流路12。贯通孔15ba、沟槽16ba、贯通孔15bc及膜11的第2主面11b构成第2流路13。
49.第1玻璃板15a与第1片材16a的接合、第1片材16a与第2片材16b的接合以及第2片材16b与第2玻璃板15b的接合例如通过在利用氧等离子体将接合面活性化的状态下对该接合面进行加压来进行。
50.图3是用于对第1保持件17a和第2保持件17b向共培养器件10的安装状态进行说明的分解立体图。如图3所示，共培养器件10由第1保持件17a和第2保持件17b夹持。在第1保持件17a与共培养器件10之间，夹持有第1橡胶片材18a。在第2保持件17b与共培养器件10之间，夹持有第2橡胶片材18b。
51.第1保持件17a和第2保持件17b例如由聚醚醚酮树脂(peek树脂)形成。第1橡胶片材18a和第2橡胶片材18b例如由丁基橡胶形成。
52.在第1保持件17a形成有贯通孔17aa。贯通孔17aa沿厚度方向贯通第1保持件17a。贯通孔17aa在第1保持件17a安装于共培养器件10的状态下，与贯通孔15aa重叠。在第1橡胶片材18a形成有贯通孔18aa。贯通孔18aa在第1保持件17a安装于共培养器件10的状态下，与贯通孔15aa重叠。即，通过了贯通孔22a的第1管40a通过贯通孔17aa及贯通孔18aa连接至贯通孔15aa(第1流路12的入口)。
53.在第2保持件17b形成有贯通孔17ba、贯通孔17bb及贯通孔17bc。贯通孔17ba、贯通孔17bb及贯通孔17bc沿厚度方向贯通第2保持件17b。在第2橡胶片材18b形成有贯通孔18ba、贯通孔18bb及贯通孔18bc。贯通孔18ba、贯通孔18bb及贯通孔18bc沿厚度方向贯通第2橡胶片材18b。
54.贯通孔17ba、贯通孔17bb及贯通孔17bc在第2保持件17b安装于共培养器件10的状态下，分别与贯通孔15ba、贯通孔15bb及贯通孔15bc重叠。贯通孔18ba、贯通孔18bb及贯通孔18bc在第2保持件17b安装于共培养器件10的状态下，分别与贯通孔15ba、贯通孔15bb及贯通孔15bc重叠。第2管40b通过贯通孔17ba和贯通孔18ba连接至贯通孔15ba(第2流路13的入口)。第3管40c通过贯通孔17bb及贯通孔18bb连接至贯通孔15bb(第1流路12的出口)。第4管40d通过贯通孔17bc和贯通孔18bc连接至贯通孔15bc(第2流路13的出口)。
55.共培养器件10以被第1保持件17a和第2保持件17b夹持的状态安装于第1密闭容器20的盖22。该安装例如通过螺栓拧紧来进行。
56.(实施方式的共培养方法)
57.以下，对实施方式的共培养方法进行说明。
58.图4是实施方式的共培养方法的工序图。如图4所示，实施方式的共培养方法具有准备工序s1和培养基供给工序s2。培养基供给工序s2在准备工序s1之后进行。
59.在准备工序s1中，将实施方式的共培养装置配置于厌氧腔室70内。在培养基供给工序s2中，贮存于第1培养基容器30a的第1培养基80a经由第1管40a被供给至第1流路12。此外，在培养基供给工序s2中，贮存于第2培养基容器30b的第2培养基80b经由第2管40b被供给至第2流路13。第1培养基80a向第1流路12的供给通过驱动第1泵50a来进行。第2培养基80b向第2流路13的供给通过驱动第2泵50b来进行。由此，在共培养器件10内进行细胞和菌的共培养。
60.通过第1泵50a的驱动，在第1流路12流动的第1培养基80a经由第3管40c被供给至第3培养基容器30c。通过第2泵50b的驱动，在第2流路13流动的第2培养基80b经由第4管40d被供给至第4培养基容器30d。贮存于第3培养基容器30c的第1培养基80a以及贮存于第4培养基容器30d的第2培养基80b例如被提供给使用了液相色谱质量分析法等的质量分析。
61.(实施方式的共培养系统的效果)
62.以下，与比较例进行对比来说明实施方式的共培养系统的效果。
63.图5是比较例的共培养系统的示意性的剖视图。如图5所示，比较例的共培养系统不具有第1密闭容器20。关于其他方面，比较例的共培养系统与实施方式的共培养系统相同。
64.在比较例的共培养系统中，由于第1培养基容器30a及第1管40a未配置于第1密闭容器20内，因此贮存于第1培养基容器30a且被供给至第1流路12的第1培养基80a会暴露于厌氧腔室70内的厌氧环境。另一方面，在实施方式的共培养系统中，由于第1培养基容器30a及第1管40a配置于第1密闭容器20内，因此贮存于第1培养基容器30a的第1培养基80a在不暴露于厌氧环境的情况下被供给至第1流路12。
65.此外，在实施方式的共培养系统中，由于第2培养基容器30b及第2管40b配置于厌氧腔室70内，因此贮存于第2培养基容器30b的第2培养基80b在厌氧环境下流动并被供给至第2流路13。这样，根据实施方式的共培养系统，能够历时性地评价在好氧环境中流动的培养基(第1培养基80a)以及在厌氧环境中流动的培养基(第2培养基80b)这两者。
66.在实施方式的共培养系统中，由于第1流路12的出口(贯通孔15bb)、第2流路13的入口(贯通孔15ba)以及第2流路13的出口(贯通孔15bc)形成于第2面10b，另一方面，第1流路12的入口(贯通孔15aa)形成于朝向第1密闭容器20侧的第1面10a，因此能够在第1培养基容器30a配置于第1密闭容器20内的状态下通过第1管40a容易地将第1流路12的入口和第1培养基容器30a连接。
67.(第1变形例的共培养系统)
68.以下，对第1变形例的共培养系统进行说明。在此，主要对与实施方式的共培养系统不同的方面进行说明，不再反复进行重复的说明。
69.图6是第1变形例的共培养系统的示意性的剖视图。如图6所示，第1变形例的共培
养系统具有第2密闭容器90。第2密闭容器90的内部空间被密闭。在第2密闭容器90内配置有共培养器件10、第2泵50b及第2培养基容器30b。关于其他方面，第1变形例的共培养系统与实施方式的共培养系统是共通的。另外，第2泵50b及第2培养基容器30b也可以配置于第2密闭容器90外。
70.在评价历经长时间(例如数天)的情况下，为了更换贮存于第1培养基容器30a的第1培养基80a，有时需要将第1密闭容器20带出至厌氧腔室70外。此时，无法维持共培养器件10内的厌氧环境。
71.在第1变形例的共培养系统中，由于在第2密闭容器90内配置有共培养器件10、第2泵50b及第2培养基容器30b，因此，为了更换贮存于第1培养基容器30a的第1培养基80a，在将第1密闭容器20带出至厌氧腔室70外时，即使厌氧腔室70内的氧浓度暂时上升，也能够持续将共培养器件10、第2泵50b及第2培养基容器30b保持在厌氧环境中。
72.(第2变形例的共培养系统)
73.以下，对第2变形例的共培养系统进行说明。在此，主要对与实施方式的共培养系统不同的方面进行说明，不再反复进行重复的说明。
74.图7是第2变形例的共培养系统的示意性的剖视图。如图7所示，在第2变形例的共培养系统中，共培养器件10与实施方式的共培养系统中的共培养器件10的层叠结构不同，具有培养槽19a、适配器19b、流路板19c。
75.培养槽19a例如是细胞培养插件(cell culture insert)。培养槽19a具有筒状部19aa和膜11。筒状部19aa例如由树脂材料形成。膜11将筒状部19aa的下端侧封闭。第1主面11a及第2主面11b分别朝向培养槽19a(筒状部19aa)的外部侧及内部侧。
76.在盖22形成有沿厚度方向贯通盖22并与第1密闭容器20的内部连通的贯通孔22b。培养槽19a的下端侧以位于第1密闭容器20内的方式插入贯通孔22b。培养槽19a与贯通孔22b之间通过气体密封部19d密封。由此，维持第1密闭容器20内的气密性。气体密封部19d例如为o形环。
77.适配器19b以远离膜11(第2主面11b)的方式从上端侧被插入到筒状部19aa内。由适配器19b的底面、筒状部19aa的内壁面及第2主面11b划分出的空间构成第2流路13。适配器19b例如由橡胶形成。
78.在适配器19b形成有贯通孔19ba和贯通孔19bb。贯通孔10ba和贯通孔19bb沿着从适配器19b的上表面朝向适配器19b的底面的方向贯通适配器19b。贯通孔19ba和贯通孔19bb与第2流路13连通。在贯通孔19ba及贯通孔19bb分别插入有第2管40b及第4管40d。由此，第2管40b及第4管40d与第2流路13连接。
79.流路板19c是板状的部件。流路板19c配置于第1密闭容器20内。在流路板19c形成有沟槽19ca、贯通孔19cb和贯通孔19cc。沟槽19ca形成于流路板19c的一个主面。流路板19c的一个主面朝向培养槽19a侧。贯通孔19cb及贯通孔19cc以沿着厚度方向贯通流路板19c并与沟槽19ca连通的方式形成于流路板19c的另一个主面。
80.培养槽19a以第1主面11a与沟槽19ca对置的方式配置在流路板19c上。培养槽19a与沟槽19ca之间由液体密封部19e液密性地密封。液体密封部19e例如为由pdms(聚二甲基硅氧烷)形成的密封件或o型环。沟槽19ca、贯通孔19cb、贯通孔19cc、液体密封部19e及第1主面11a构成第1流路12。在贯通孔19cb及贯通孔19cc分别连接有第1管40a及第3管40c。关
于其他方面，第2变形例的共培养系统的构成与实施方式的共培养系统的构成共通。
81.在第2变形例的共培养系统中，由于第1培养基容器30a及第1管40a配置于第1密闭容器20内，因此贮存于第1培养基容器30a的第1培养基80a在不暴露于厌氧环境的情况下被供给至第1流路12。此外，在第2变形例的共培养系统中，由于第2培养基容器30b及第2管40b配置于厌氧腔室70内，因此贮存于第2培养基容器30b的第2培养基80b在厌氧环境下流动并被供给至第2流路13。这样，通过第2变形例的共培养系统，也能够历时性地评价在好氧环境中流动的培养基(第1培养基80a)以及在厌氧环境中流动的培养基(第2培养基80b)这两者。
82.以上对本发明的实施方式进行了说明，但应该认为本次公开的实施方式在所有方面都是例示而不是限制性的。本发明的范围由权利要求书示出，意在包括与权利要求书等同的意思及范围内的所有变更。